Praktikum BIO102 Biologi Dasar – Ganjil2022 Lembar Kerja 07 1

Nama : Putri Aisha Asisten PJ Materi

: Farrah Zulfa
(G34180046)
Siti Nurul Badriah
(G34180035)
Rifky Fahrul Arifin
(F3401201131)
NIM : B0401221144 Nilai :
Kelompok : 1 (Satu) Tanggal Praktikum : Selasa, 27 September
2022
==================================================================

Laporan Praktikum
Isolasi DNA, Elektroforesis Gel, dan Polymerase Chain Reaction

Pendahuluan

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah suatu makromolekul yang membawa

informasi genetik pada makhluk hidup, termasuk virus. DNA tersusun atas polimer nukleotida
yang terdiri dari gula deoksiribosa, dua macam basa nitrogen berupa purin (adenin dan guanin)
atau pirimidin (timin dan sitosin), dan gugus fosfat. DNA pada eukariot maupun prokariot
mempunyai struktur heliks ganda yang dibentuk dari dua rantai polinukleotida yang saling
berkomplemen antara basa purin yang satu dengan basa pirimidin yang lainnya. DNA rantai
ganda secara kimia bersifat sangat inert, tetapi bersifat sangat rapuh (fragile) secara fisika.
Karena panjang dan berpilin dengan stabilitas lateral yang rendah, DNA dapat mudah
terpotong oleh tekanan hidrodinamik. Aliran hidronamik yang dihasilkan dari pippeting,
pengocokan, dan pengadukan memiliki kemampuan untuk memotong kedua rantai DNA. Oleh
karena itu, DNA genom mudah diperoleh dalam bentuk terfragmentasi (Hidayat, 2011).

Identifikasi molekuler memerlukan tahapan awal berupa isolasi DNA genom. Menurut
Murtiyaningsih (2017), prinsip isolasi DNA adalah mendapatkan DNA murni yang tidak
tercampur dengan komponen sel lainnya seperti protein dan karbohidrat. Isolasi DNA genom
dapat dilakukan dengan metode lisis sel secara fisik dan kimia. Selain itu, prinsip isolasi DNA
terdiri dari tiga tahapan, yaitu lisis dinding dan membran sel, pemisahan atau purifikasi DNA,
dan presipitasi DNA (Rizko et al. 2005). Pengadaan DNA berkualitas tinggi dan utuh
seringkali merupakan langkah pertama dan paling penting dalam banyak aplikasi biologi
molekuler, seperti kloning DNA, sekuensing, PCR, dan elektroforesis (Puspitaningrum et al.
2018).

Elektroforisis secara umum merupakan proses pemisahan makromolekul yang

didasarkan pada muatan molekul tersebut dalam suatu larutan dan resistansinya. Prinsip
Teknik elektroforesis adalah berdasarkan migrasi partikel bermuatan di bawah pengaruh
medan elektronik pada kondisi yang konstan. Metode pemisahan DNA dengan elektroforesis
ini secara luas digunakan untuk tujuan analitik dan preparatif (Puspitaningrum et al. 2018).

PCR merupakan suatu metode in vitro dalam sintesis DNA. Prinsip dasar metode ini
adalah perbanyakan fragmen DNA menggunakan enzim polymerase pada temperature yang
tinggi yang dilakukan secara berulang. Pada proses ini dibutuhkan oligonukleotida pendek
(primer DNA) yang berperan dalam mengawali proses ini. Primer akan menempel pada untai
tunggal DNA saat temperature diturunkan setelah terjadi pemisahan untai ganda DNA. Produk
hasil PCR dapat diamati menggunakan teknik elektroforesis agrose (Puspitaningrum et al.
 Praktikum BIO102 Biologi Dasar – Ganjil2022 Lembar Kerja 07 2

2018).

Tujuan Praktikum

Praktikum ini bertujuan untuk memahami serta mempelajari Teknik isolasi DNA yang
berguna sebagai template PCR, mempelajari Teknik elektroforesis gel agarose untuk
memisahkan fragmen DNA, dan mempelajari Teknik amplifikasi DNA dengan metode
Polymerase Chain Reaction (PCR).

Hasil dan Pembahasan

A. Isolasi DNA

Gambar 1. Tahapan isolasi DNA selama praktikum

1. Larutan buffer lisis pada isolasi DNA berfungsi untuk menghancurkan

jaringan dan membrane sel serta mengeliminasi kontaminan sehingga yang
didapatkan pada tahap ini ialah DNA genom. Larutan buffer lisis bekerja secara
optimal pada suhu yag tidak terlalu rendah (Triani, 2020).
2. Penambahan etanol atau alkohol 96% dingin berfungsi untuk menunjukkan
bahwa DNA tidak larut dalam etanol, tetapi larut dalam air saat terjadi presipitasi.
Ketika molekul DNA berpindah ke dalam larutan yang bukan pelarut, mereka akan
berkumpul atau menggumpal sehingga dapat terlihat. Hasil dari presipitasi DNA ini
terlihat seperti serabut-serabut putih yang terkumpul di atas permukaan larutan karena
besar massa jenis etanol yang lebih kecil daripada massa jenis air (Hapsari, 2015).
Menurut Aristya et al. (2013), alkohol yang digunakan dalam kondisi dingin berfungsi
 Praktikum BIO102 Biologi Dasar – Ganjil2022 Lembar Kerja 07 3

untuk menyempurnakan presipitasi, karena temperature yang rendah akan menurunkan

aktivitas molekul air yang dapat menyebabkan pengendapan DNA lebih efektif.

B. Elektroforesis Gel
1. Langkah elektroforesis gel agarose :
1) Letakkan gel agarose ke dalam tempat gel
2) Tuangkan larutan buffer elektroforesis ke reservoir di setiap ujung ruang gel.
Setelah itu, tambahkan terus larutan buffer ke dalam gel yang tertutup buffer
minimal 2 milimeter.
3) Tempatkan sampel anda yang akan diisi dengan urutan yang sesuai.
4) Untuk mendapatkan sampel DNA, tekan plunger secara perlahan pada mikropipet
yang bisa disesuaikan ke titik pertama. Masukkan ujung pipet ke dalam tabung
mikro yang berisi sampel DNA sambil menahan plunger. Tempatkan ujung plunger
dekat dengan bagian bawah sampel kemudian lepaskan tombol pendorong secara
perlahan.
5) Saat memuat sampel, jaga agar pipet tetap tegak lurus dengan deretan sumur.
Perlakuan ini akan mengurangi resiko tertusuknya sumur secara tidak sengaja oleh
ujung pipet. Turunkan ujung pipet hingga melewati permukaan buffer sampai
sampel terletak tepat di atas atau di dalam sumur.
6) Tekan tombol pendorong secara perlahan lalu amati saat sampel mengisi sumur.
Beri jeda lalu keluarkan pipet secara perlahan sambil tetap menekan plunger
dengan ibu jari anda.
7) Setelah semua sampel telah dimuat , hindari segara benturan atau pergerakan di
ruang gel yang dapat mengakibatkan sampel tumpah ke sumur yang berdekatan.
8) Tempatkan tutup pada atas ruang gel dengan terminal yang telah diposisikan secara
benar kepada elektroda yang sesuai dan cocok pada ruang gel. Warna hitam dengan
hitam dan warna merah dengan merah.
9) Hubungkan kembali elektroda ke catu daya dan pastikan elektroda sesuai dengan
terminal pada catu daya. Warna merah dengan merah dan warna hitam dengan
hitam.
10) Nyalakan catu daya lalu atur nilai voltase dengan benar untuk menjalankan
sampel.
11) Apabila terdapat pengatur waktu pada catu daya, atur waktu sesuai dengan yang
dibutuhkan.
12) Tekan tombol start untuk memulai aliran arus yang akan memisahkan fragmen
DNA. Pada kali ini, akan teramati gelembung yang berasal dari kabel di setiap
ujung kotak gel. Perhatikan bahwa elektroda positif atau merah menghasilkan
gelembung lebih sedikit daripada elektroda negatif atau hitam.
13) Dalam beberapa menit, sampel akan mulai bermigrasi dari sumur ke luar dalam
gel. Saat sampel DNA berjalan, diafragma akan bergerak dari elektroda negatif
menuju elektroda positif.
 Praktikum BIO102 Biologi Dasar – Ganjil2022 Lembar Kerja 07 4

2. Jawaban pertanyaan dari penuntun :

a.) Gel agarose elektroforesis adalah metode dari elektroforesis gel yang
digunakan dalam biokimia, biologi molekuler, dan kimia klinik untuk pemisahan
campuran populasi DNA atau protein dalam matrik agarosa. Agarosa gel ini
digunakan untuk analisis kualitas dari sampel DNA (Widiyanti, 2014). Menurut
Harahap (2018), gel agarose memiliki kelebihan pada pemakaian di teknik
elektroforesis, yaitu sederhana dan laju pemisahannya lebih cepat membentuk
fragmen-fragmen dan tidak bersifat toksik.
b.) Larutan buffer pada elektroforesis berfungsi untuk menjaga pH pada saat proses
pemisahan fragmen DNA. Menurut Harahap (2018), larutan buffer berfungsi untuk
mempertahankan pH di dalam medium pemisah dan berfungsi sebagai media
penyedia elektrolit pada proses pergerakan aliran listrik untuk memisahkan
fragmen DNA.
c.) Pada elektroforesis gel, Sampel DNA harus diletakkan pada sisi negatif. Hal ini
dikarenakan DNA yang bermuatan negatif sehingga molekul DNA akan bergerak
dari kutub negatif ke kutub positif lalu DNA akan terpisah sesuai dengan ukuran
molekulnya (Maulid dan Nurilmala, 2015).
d.) Pemberian arus listrik pada elektroforesis gel bertujuan untuk menarik fragmen
DNA yang bermuatan negatif pada anoda ke arah katoda yang bermuatan positif.
Gel agarose yang teraliri listrik akan meneruskan aliran tersebut sehingga fragmen
DNA akan bergerak sesuai dengan ukurannya melewati matriks gel menuju kutub
positif (Ardhana, 2011).
e.) Fragmen DNA dapat terpisah satu sama lain pada gel agarose karena adanya
muatan listrik. Muatan listrik ini bekerja dengan membawa fragmen-fragmen DNA
bergerak melalui matriks-matriks pada gel agarose. DNA yang lebih pendek akan
bergerak lebih jauh dibandingkan fragmen DNA yang lebih panjang sehingga
fragmen akan terpisah satu sama lain (Ardhana, 2011).
f.) Fragmen DNA yang berukuran lebih besar akan dekat dengan kutub negatif
dikarenakan fragmen ini akan lebih susah untuk bergerak daripada fragmen DNA
yang berukuran lebih kecil. Menurut Radji et al. (2010), semakin kecil ukuran
pasang basa nukleotida pada fragmen DNA, fragmen akan lebih mudah untuk
bermigrasi dan berada pada bagian gel yang dekat dengan kutub positif.

C. Teknik Polymerase Chain Reaction

No Waktu denaturasi, Ulangan Kombinasi Suhu Annealing dan Siklus PCR

Annealing, dan 45oC 56oC 68oC
ekstension (sec.) 15 25 35 15 25 35 15 25 35
1 10, 10, 20 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Praktikum BIO102 Biologi Dasar – Ganjil2022 Lembar Kerja 07 5

Rata-rata 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 30, 30, 60 1 16,8 66,9 83,9 61,4 85,1 104,0 1,6 8,8 17,0
2 22,1 69,3 79,0 61,9 89,8 115,5 1,1 5,0 17,0
3 17,9 71,6 85,2 47,1 93,5 109,1 1,3 7,3 10,5
4 18,7 61,8 81,2 46,8 78,4 105,5 2,1 11,8 22,4
5 18,2 61,4 94,3 50,9 74,6 110,6 1,5 9,7 22,7
Rata-rata 18,74 66,2 84,72 53,62 84,28 108,94 1,52 8,52 17,92

Tabel 1. Hasil simulasi PCR virtual

1. Jawaban pertanyaan dari penuntun :

1) PCR adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro yang
melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) serta terjadi duplikasi jumlah
target DNA untai ganda pada setiap siklusnya (Handoyo dan Rudiretna, 2001).
Menurut Cahyani (2011), teknik ini menggunakan teknik amplifikasi DNA selektif
in vitro yang meniru fenomena replikasi DNA in vivo.
2) Utas DNA yang diamplifikasi, yaitu utas DNA template yang sudah dipisah
menjadi utas tunggal. Utas tunggal DNA merupakan cetakan bagi pembentukan
utas baru DNA. Menurut Najafov (2017), template DNA yang diamplifikasi dapat
berupa DNA genomik, plasmid, dan amplicon.
3) Primer berfungsi sebagai pembuka pada proses extension DNA target yang
akan diamplifikasi serta untuk menyediakan gugus hidroksi pada ujung 3’ yang
dibutuhkan pada proses extension DNA (Handoyo dan Rudiretna, 2001).
4) Enzim DNA polymerase berfungsi untuk memperbanyak DNA secara in vitro
dengan cara mereplikasi DNA pada proses extension. Sesuai dengan pendapat
Ludyasari (2014), enzim polymerase akan membantu pemanjangan (extension)
pada primer selama 1 menit hingga terbentuknya DNA untai ganda.
5) Utas DNA bisa terpisah pada suhu 94 °C saat proses denaturasi. Hal ini sesuai
dengan pendapat Ludyasari (2014), yaitu rantai utas DNA akan terpisah secara
sempurna pada tahap denaturasi hingga menghasilkan utas tunggal yang
merupakan cetakan bagi pembentukkan utas baru DNA. Di samping itu, utas DNA
bisa disintesis pada suhu sekitar 72 °.
6) Setelah 35 siklus, molekul DNA yang terbentuk dari satu molekul DNA yang
diimplifikasi dengan PCR berjumlah sebanyak 235-70. Perhitungan ini
menggunakan rumus jumlah kopi fragmen DNA target (amplicon) yang dihasilkan
pada akhir siklus PCR, yaitu :
Y = (2n-2n)X
(Sogandi, 2018)

Y menyatakan jumlah amplicon, n menyatakan jumlah siklus, dan X

menyatakan jumlah molekul DNA template semula (1).

7) Pada proses PCR , perubahan suhu yang terjadi memiliki fungsi yang berbeda-
beda sesuai dengan tahapannya. Pada proses annealing, suhu yang digunakan
sekitar 55 °C, hal ini menunjukkan adanya penurunan suhu yang berfungsi sebagai
penempelan primer pada utas DNA. Pada proses extension menggunakan suhu 72
°C yang menunjukkan adanya kenaikan suhu, ini merupakan suhu optimal bagi
enzim DNA polymerase untuk membentuk utas baru. Selain itu, Pada tahap
 Praktikum BIO102 Biologi Dasar – Ganjil2022 Lembar Kerja 07 6

denaturasi, suhu yang digunakan sekitar 90 °C - 95 °C, hal ini berfungsi untuk
pemisahan utas ganda DNA menjadi utas tunggal (Ludyasari, 2014).
8) Saat suhu denaturasi 50°C, produk PCR tidak terbentuk karena proses
denaturasi membutuhkan suhu yang tinggi. Proses denaturasi memiliki suhu
optimum sekitar 94°C - 95°C. Apabila suhu kurang tinggi maka untaian DNA akan
saling menempel Kembali (Budiarto 2015; Majawati 2014)
9) Faktor-faktor yang memengaruhi keberhasilan PCR, yaitu
Deoksiribonukleotida triphospat (dNTP), oligonukleotida primer, DNA cetakan,
komposisi larutan buffer, jumlah siklus reaksi, dan enzim yang digunakan
(Feranisa, 2016).
10) Pada kondisi waktu denaturasi 30 detik, annealing 30 detik, extension 60 detik,
serta kondisi suhu annealing 56°C akan menghasilkan produk yang optimum.

Daftar Pustaka

Anggun Feranisa. 2016. Komparasi antara polymerase chain reaction (PCR) dan loop
mediated isothermal amplification (LAMP) dalam diagnosis molekuler. ODONTO
Dental Journal. 3(2): 145-151.

Arikunto, Aristya, G.R. Agriansyah, A. Daryono, B.S. 2013. Deteksi dan Skrining Pewarisan
Sifat Ketahanan Penyakit Powdery Mildew pada Generasi Backross Tanaman Melon
(Cucumis melo L.) Var Tacapa. https://repository.ugm.ac.id/96999/1/RT2013
0229.pdf

Ardhana P. 2011. Unjuk kerja aplikasi sistem pendingin pada alat elektroforesis termoelektrik
[Skripsi]. Depok: Universitas Indonesia.

Bugi Ratno Budiarto M.Biotech. 2015. Polymerase chain reaction (PCR): Perkembangan dan
perannya dalam diagnostic Kesehatan. Biotrends. 6(2): 29-38.

Cahyani WA. 2011. Deteksi virus hepatitis (HVC) pada komunitas gigolo Surakarta berbasis
tested PCR pada region e1-e2 [Skripsi]. Surakarta: Universitas Negeri Surakarta.

Dr. Rini Puspitaningrum, S.Si, M.Biomed, Chris Adhiyanto, M.Biomed, PhD., Solihin, S.Pd.
2018. Genetika molekuler dan aplikasinya.
https://repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/49517/1/1.2.2%20Geneti
a%20Molekuler%20dan%20Aplikasinya%20%28buku%29.pdf

Harahap MR. 2018. Elektroforesis: analisis elektronika terhadap biokimia genetika.

CIRCUIT: Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro. 2(1): 21-26. doi:
10.22373/crc.v2i1.3248.

Handoyo, D., dan A. Rudiretna. 2001. Prinsip umum dan pelaksaan polymerase chain
reaction (PCR). Unitas. 9(1): 17-29.

Hidayat, dr. 2011. Teknik isolasi DNA dari darah.

https://repository.usu.ac.id/bitstream/handle/123456789/28634/Teknik%20Isolasi%
0DNA%20dari%20Darah.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Hidayah Murtiyaningsih. 2017. Isolasi DNA genom dan indentifikasi kekerabatan genetic
 Praktikum BIO102 Biologi Dasar – Ganjil2022 Lembar Kerja 07 7

nanas menggunakan RAPD (Random Amplified Polimerfic DNA). Agritrop. 15(1):

83-93.

Ludyasari.A. 2014. Pengaruh Suhu Annealing pada Program PCR Terhadap Keberhasilan
Amplifikasi DNA Udang Jari (Metapenaeus elegans) Laguna Segara Anakan Cilacap
Jawa Tengah [Skripsi]. Malang; Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim.

Maulid DY, Nurilmala M. 2015. DNA barcoding untuk autentikasi produk ikan tenggiri.
Jurnal Akuatika. 6(2): 154-160.

Majawati, E.S. 2014. Penggunaan Polymerase Chain Reaction (PCR) pada Diagnosis
Filariasis. Jurnal Kedokteran Meditek, 15(39): 1-8.

Najafov A, Hoxhaj G. 2017. Chapter 1–Introduction dalam PCR Guru: An Ultimate

Benchtop Reference for Molecular Biologists. London: Academic Press. h.1-6.
doi:10.1016/b978-0-12-804231-1.00001-8.

Nurmalisa Rizko, et al. 2020. Isolasi DNA daun jeruk bali merah (Citrus maxima Merr.)
dengan modifikasi metode Doyle and Doyle. Berkala Bioteknologi. 3(2): 1-7.

Nova Triani. 2020. Isolasi DNA tanaman jeruk dengan menggunakan metode CTAB (Cethyl
Trimethyl Ammonium Bromide). G-Tech Jurnal Teknologi Terapan. 3(2): 221-226.

Ni Luh Putu Manik Widiyanti, et al. 2014. Perbandingan tampilan pita penanda DNA
(Deoxyribonucleic Acid) standar dan penentuan panjang DNA kromosom Y yang
diisolasi dari darah manusia pada pemisahan dengan menggunakan media berbeda.
Seminar Nasional FMIPA UNDIKSHA IV Tahun 2014.

Radji M, Puspaningrum A, Sumiati A. 2010. Deteksi cepat bakteri Escherichia coli dalam
sampel air dengan metode polymerase chain reaction menggunakan primer 16e1 dan
16e2. Makara Sains. 4(1): 39-43.

Sogandi, M.Si. Biologi Molekuler: Identifikasi bakteri secara molekuler. Jakarta: Universitas
17 Agustus 1945.

Lampiran
Praktikum BIO102 Biologi Dasar – Ganjil2022 Lembar Kerja 07 8