MODUL 5 31S2204_PRAKTIKUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER SEM.

GENAP

ELEKTROFORESIS DNA

Pada pekerjaan genetika dan biologi molekuler elektroforesis DNA merupakan tehnik yang rutin
digunakan. DNA kromosom, DNA plasmid dan hasil pemotongan DNA umumnya diidentifikasi
dengan elektroforesis DNA gel agarosa. Pada proses kloning DNA, seringkali diperlukan tahap
untuk membedakan fragmen-fragmen DNA berdasarkan ukuran. Misalnya, dari hasil
pemotongan DNA hanya diperlukan ptotongan DNA berukuran tertentu sehingga perlu
dipisahkan dari fragmen-fragmen lainnya.

Pada elektroforesis gel agarosa, DNA yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah kutub
positif karena arus listrik. Unit elektroforeisis DNA adalah aliran listrik yang sederhana yang
dapat dipahami melalui dua persamaan yang sederhana. Hukum Ohm, V = IR, persamaan yang
berhubungan dengan medan listrik; V (satuan volt) sebanding dengan arus, I (satuan
miliamper) dikali tahanan, R (satuan Ohm). Pada elektroforeis gel agarosa, tahanan hampir
semuanya berasal dari gel dan voltase yang diberikan pada gel mempengaruhi mobilitas
sampel. Gel agarosa merupakan matriks polimer yang memiliki ukuran pori yang bergantung
pada kompisisi buffer dan konsentrasi agarosa yang digunakan. Pada saat fragmen DNA
bergerak pada matriks gel agarosa, fragmen yang besar akan lebih tertahan dibandingkan
dengan fragmen yang kecil. P = I2R, persamaan yang menyatakan bahwa power yang dihasilkan
oleh sistem P (satuan watt) sebanding dengan tahanan dikali kuadrat arus.

DNA murni dan terlarut tidak dapat dilihat oleh mata. Oleh karena itu DNA yang telah dipisahkan
pada proses elektroforesis harus divisualisasi. Untuk visualisasi DNA diperlukan pewarna DNA
yang umumnya berupa senyawa`kimia. Senyawa kimia yang umum digunakan sebagai pewarna
DNA adalah etidium bromida (EtBr), tetapi saat ini telah banyak digunakan pengganti EtBr yang
fungsinya sama. Etidium bromida adalah pewarna DNA yang telah digunakan sejak lama, tetapi
karena bersifat mutagen dan toksik, maka pemakaiannya sudah dikurangi. Pada praktikum ini
akan digunakan pewarna Diamond Nucleic Acid Dye dari Promega.

Hal-hal yang perlu diketahui sebelum anda melakukan elektroforesis DNA:

Istilah-istilah

Gel Agarosa Bubuk agarosa yang telah larut dalam buffer dengan cara
mendidihkan dan memadat membentuk gel pada suhu ruang.

Tray Tempat mencetak gel agarosa.

Sisir Plastik yang berbentuk sisir yang disisipkan ke dalam gel agarosa
sebelum memadat untuk menghasilkan sumur tempat sampel DNA.

Loading Dye Campuran gliserol dan warna pelacak. Gliserol menyebabkan sampel
DNA berada di dasar sumur, agar DNA tidak akan mengambang.
Warna pelacak berfungsi untuk memonitor pergerakan sampel. Warna
pelacak selalu bergerak lebih cepat dari DNA..

RFK_INSTITUT TEKNOLOGI DEL 1

MODUL 5 31S2204_PRAKTIKUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER SEM. GENAP

Pewarna DNA Senyawa kimia yang dapat menempel pada DNA dan menghasilkan
cahaya jika disinari dengan sinar UV. Pewarna DNA digunakan untuk
visualisasi DNA pada gel agarosa.

DNA Ladder Campuran fragmen-fragmen DNA yang telah diketahui ukurannya,

dielektroforesis bersamaan dengan sampel DNA dan digunakan untuk
menentukan ukuran DNA sampel. Sering juga disebut sebagai DNA
standar.

Elektroforesis DNA gel agarosa melibatkan tahap-tahap berikut ini:

1. Melarutkan agarosa dalam buffer. dan menuang agarosa pada tray elektroforesis.
2. Menempatkan gel agarosa yang telah memadat pada tangki elektroforesis.
3. Mencampurkan sampel DNA dengan loading dye.
4. Mengisi tangki elektroforesis dengan running buffer.
5. Menempatkan sampel pada sumur gel agarosa menggunakan mikropipet.
6. Menjalankan elektroforesis pada voltase tertentu.
7. Visualisasi DNA pada sinar UV.

1. Pembuatan gel agarosa

Penting diperhatikan bahwa buffer yang digunakan untuk melarutkan agarosa haruslah sama
dengan buffer yang digunakan untuk running buffer (buffer pada tangki elektroforesis) dan gel
harus sudah benar-benar padat saat dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis. Perbedaan
buffer dan gel yang belum padat akan menyebabkan pemisahan dan hasil yang tidak tepat.

2. Persiapan sampel
Sampel DNA harus dicampurkan dengan loading dye untuk tujuan supaya sampel DNA
berada di dasar sumur karena adanya gliserol dalam loading dye. Warna pada`loading dye
bermigrasi pada kecepatan tertentu yang membantu kita untuk memonitor migrasi sampel
sehingga tidak melewati ujung gel.

Pada saat memasukkan sampel pada sumur gel agarosa, pastikan bahwa ujung tip berada
pada bagian tengah sumur dan jangan sampai ditekan agar tidak mengenai dasar sumur
karena menyebabkan sumur gel bocor dan sampel akan menyebar dalam running buffer.
Anda dapat memegang mikropipet dengan kedua tangan anda atau menahan siku anda pada
meja saat memipet sampel ke dalam sumur gel agarosa untuk membuat mikropipet tetap
steady. Jangan memindahkan tray ataupun alat elektroforesis setelah sampel berada dalam
sumur, karena pergerakan akan menyebabkan sampel mengambang keluar sumur. Pastikan
posisi alat elektroforesis sudah tepat sebelum memasukkan sampel ke dalam sumur gel
agarosa.

3. Mengatur arus
Arus yang digunakan berbahaya bagi mnusia oleh karena itu jangan pernah menyentuh
running buffer selama arus berjalan. Jika terjadi kebocoran tangki elektroforesis, segera
matikan arus listrik.

RFK_INSTITUT TEKNOLOGI DEL 2

MODUL 5 31S2204_PRAKTIKUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER SEM. GENAP

4. Visualisasi hasil
Bahan yang digunakan untuk mewarnai DNA membutuhkan aktivasi oleh sinar UV. Gel
agarosa ditempatkan pada UV transilluminator dan menghasilkan cahaya fluoresense yang
dapat ditangkap oleh kamera digital. Karena sinar UV dapat menyebabkan kerusakan pada
retina mata maka mata harus dilindungi dengan mengenakan kacamata pelindung saat
melakukan visualisasi DNA, umumnya digunakan UV face shield.

Gambar 2. Pemisahan fragmen DNA pada elektroforesis gel agarosa.

DNA diinkubasi dengan enzim restriksi menghasilkan banyak fragmen. Campuran
fragmen DNA ditempatkan pada sumur gel agarosa yang telah terendam dalam buffer
kemudia dialirkan arus listrik. DNA yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah
muatan positif yang kecepatan pergerakannya bergantung pada ukuran fragmen DNA,
sehingga fragmen-fragmen DNA dipisahkan berdasarkan ukuran.

(Sumber: Karp, G. 2013. Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments, 7th ed. John
Wiley and Sons, Inc.)

1. Tujuan Percobaan
1. Membuat gel agarosa.
2. Melakukan elektroforesis DNA.
3. Karakterisasi DNA kromosom, DNA plasmid dan DNA hasil pemotongan.

RFK_INSTITUT TEKNOLOGI DEL 3

MODUL 5 31S2204_PRAKTIKUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER SEM. GENAP

III. Alat dan Bahan :

1. Baker gelas 500 mL

2. Gelas ukur 100 mL
3. Erlenmeyer 500 mL
4. Microwave
5. Alat elektroforesis DNA
6. Tabung mikrosentrifuga 500 uL
7. Mikropipet dan tip.
8. Alat elektroforesis DNA (Mupid eXu)
9. Agarosa
10. UV transilluminator
11. Buffer TAE 50X:
- 242 gram Tris-base
- 57,1 mL asam asetat glasial
- 100 mL EDTA 0,5 M pH 8,0
tambahkan akuades hingga volume campuran 1 liter.
12. DNA Loading buffer 6X yang terditi dari : 60% (w/v) gliserol; 6 mM EDTA pH 8,0; dan
0,01% bromophenol blue
13. Larutan Diamond Nucleic Acid Dye: 1 : 10.000 dalam buffer TAE 1X (untuk merendam
gel agarosa hasil elektroforesis.
(simpan dalam wadah tertutup dan berwarna gelap, dan gunakan sarung tangan bila
bekerja dengan pewarna tersebut)

IV. Prosedur Percobaan

4.1. Pembuatan Gel Agarosa
1. Siapkan working buffer TAE 1X dengan mencampurkan 10 mL TAE 50X dengan 490
mL akuades.

2. Buat gel agarosa 1% sebagai berikut: timbang 1,5 gram agarosa, tempatkan dalam labu
Erlenmeyer 500 mL, kemudian larutkan dengan 150 mL TAE 1X dengan cara
dipanaskan sampai mendidih pada microwave. Biarkan hingga suhu mencapai ±600C

4. Siapkan tray elektroforesis yang dilengkapi dengan sisir, seperti pada Gambar 1 di
bawah ini.

Gambar 1. Tray yang telah dilengkapi dengan sisir

RFK_INSTITUT TEKNOLOGI DEL 4

MODUL 5 31S2204_PRAKTIKUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER SEM. GENAP

5. Tuang larutan agarosa (yang telah menacapai suhu ±600C) ke dalam tray, biarkan
hingga agarosa memadat. Usahakan agar tidak ada gelembung udara yang terjerap
dalam gel.

6. Setelah agarosa memadat, lepaskan sisir dari gel agarosa, kemudian tempatkan gel
beserta tray-nya ke dalam tangki elektroforesis yang telah berisi working buffer TAE 1X.
Gel harus terendam oleh buffer. Pastikan bahwa sumur gel berada pada sisi kutub
negatif (katoda).

Gambar 2. Tahap pembuatan gel agarosa

4.2. Persiapan Sampel

1. Siapkan tabung mikrosentrifuga yang kecil (tabung PCR) sesuai dengan jumlah sampel
yang akan dielektroforesis.
2. Pipet 2 l 6X loading dye ke dalam masing-masing tabung mikrosentrifuga tesebut.
3. Pipet masing-masing 10 μl sampel ke dalam tabung mikrosentrifuga yang telah berisi
loading dye, homogenkan dengan memipet berulang (up and down pipetting).
4. Pipet sampel yang telah dicampur dengan loading dye, kemudian masukkan sampel ke
dalam sumur gel agarosa.

Gambar 3. Loading sampel DNA ke dalam sumur gel agarosa

5. Masukkan juga DNA standar (DNA Ladder) sebanyak 5 L ke dalam salah satu sumur gel
agarosa sebagai pembanding ukuran DNA.
6. Tutup tangki elektroforesis kemudian nyalakan power supply dan set timer 60 menit dan
voltase sebesar 100 volt.
7. Jalankan elektroforesis sampai loading dye mencapai 0,5 cm dari ujung gel, kemudian
matikan alat elektroforesis.

RFK_INSTITUT TEKNOLOGI DEL 5

MODUL 5 31S2204_PRAKTIKUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER SEM. GENAP

8. Keluarkan gel beserta tray dari tangki elektroforesis kemudian rendam gel dalam larutan
pewarna (larutan Diamond Nucleic Acid Dye) sambil digoyang pada orbital shaker selama
15- 30 menit dengan kecepatan 50 rpm.
9. Keluarkan gel elektroforesis dari rendaman dan visualisasi DNA pada gel dengan UV
transilluminator.

REFERENSI
1. Brown T.A., 2010, Gene Cloning & DNA Analysis: An Introduction, 6th ed., Wiley-Blackwell,
UK.
2. Sambrook, 2001, Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd ed Vol.1-3, Cold Spring
Harbor Laboratory Press.

RFK_INSTITUT TEKNOLOGI DEL 6