DETEKSI HASIL ISOLASI

DNA SECARA KUALITATIF

DAN KWANTITATIF
Deteksi hasil isolasi DNA bisa dilakukan secara
kualitatif dan kwantitatif.
 kualitatif : deteksi hasil isolasi DNA
menggunakan elektroforeisis.
 Kwantitatif : deteksi hasil isolasi DNA
menggunakan spektrofotometer.
Pendahuluan

 Hasil isolasi DNA harus diukur

konsentrasinya yang menunjukkan
kemurnian dari DNA tersebut.
 Kemurnian DNA yang tinggi dapat
diartikan bahwa DNA hasil isolasi
mempunyai kandungan zat pengotor
yang rendah.
 Contoh zat pengotor dari DNA adalah
lemak, protein, organel-organel lain.
Metode Pengukuran Konsentrasi DNA

 DNA hasil isolasi dapat dilakukan

pengecekan secara kualitas dan kuantitas
untuk mengetahui konsentrasi dan
kemurniannya dg menggunakan
elektroforesis agarosa dan
spektrofotometer.
 1. Pengukuran Konsentrasi DNA
dengan Spektrofotometer
 Metode pengujian kuantitaif untuk isolat DNA dilakukan
menggunakan spektrofotometri UV-Vis. Uji kuantitatif DNA
dengan spektrofotometri UV-Vis
 DNA murni dapat menyerap cahaya ultraviolet karena
keberadaan basa-basa purin dan pirimidin.
 Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada λ280,
sedang kontaminan protein atau fenol akan menyerap cahaya
pada λ280 nm.
 Kemurnian DNA dapat dukur dg menghitung nilai
absorbansi λ280 nm dibagi dg nilai absorbansi λ280 (A260/A280)
dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1,8-2,0
Serta untuk mengukur konsentrasi DNA
digunakan rumus sebagai berikut:

[DNA] = Al260 x 50 x faktor pengenceran

 Al260 = Nilai absorbansi pada l260 nm

 50 = larutan dengan nilai absorbansi 1,0 sebanding
dengan 50 μg untai ganda DNA per mL
Rumus menghitung kemurnian DNA

λ 260
Kemurnian DNA =  Dimana :
λ280
 λ 260 = nilai dari
panjang gelombang
260
Rumus factor pengenceran :
 λ 280 = nilai dari panjang
Σ 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛
gelombang 280
Σ 𝑧𝑎𝑡 𝑡𝑒𝑟𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡
Cara preparasi sampel untuk pengukuran
konsentrasi dan kemurnian
 Siapkan tube eppendorf 1,5 ml
 Ambil sampel DNA 4 µl
 Tambahkan aquades steril 996 µl
 Homogenkan dengan menggunakan vortex
 Baca dengan menggunakan alat spektrofotometer.
Contoh perhitungan
 Diket : hasil pengukuran isolasi DNA pada λ 260 = 0,039 nm, λ 280 =
0,023 nm.
 Hitunglah konsentrasi dan kemurnian DNA dari data tersebut?
 Jawab :
a. Konsentrasi DNA
Konsentrasi DNA = λ 260 x 50 x faktor pengenceran
DNA = 0,039 x 50 x 250
DNA = 487,5 µg/ml
b. Kemurnian DNA
λ260
Kemurnian DNA = λ280
0,039
= 0,023

= 1,69 µg/ml
ELEKTROFORESIS
2. Pengukuran Konsentrasi DNA dengan
Elektroforesis DNA
 Metode pengujian kualitatif isolat DNA dapat dilakukan dg menggunakan
elektroforesis gel agarosa.
 Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor
ukuran dan konfirmasi molekul DNA, konsentrasi agarosa, arus listrik dan
temperatur.
 Pewarna Ethidium Bromide (EtBr) digunakan untuk alat identifikasi dan
mengukur semi-kualitatif fragmen DNA yg terseparasi dalam gel.
 EtBr terikat diantara dua untai ganda DNA, shg pita DNA dalam gel agarosa
akan berpendar, karena pewarna ini mengandung zat fluoresence.
 EtBr dapat diberikan pada setiap sampel yang akan dimasukkan ke sumuran
gel atau dicampurkan ke gel agarosa sebelum gel dicetak dalam cetakan gel.
Intensitas fluoresence dapat diukur dg DNA marker standar, sehingga dapat
diperkirakan kuantitas DNAnya, misal antara 0,50 sampai 20 μg/mL.
 Sejarah Elektroforesis

 Dikemukakan oleh Tellius pada pemakaian pertama kali sekitar

tahun 1930, untuk memisahkan protein dalam bentuk larutan
dapar yang ditempatkan dalam tabung berbentuk negative.
 Pada kedua ujung diberikan electrode negative dan positif yang
kemudian diberi arus searah. Dengan pengaruh medan listrik
tersebut, protein akan bergerak secara bebas menuju kutub yang
berlawanan muatannya.
 Gerakan tersebut garis (baundery), sehingga disebut moving
baundery, karena terjadinya peristiwa itu dalam larutan
dinamakan free solution. Gerakan tersebut dipengaruhi pila oleh
bobot jenis molekul yang tentu saja sesuai dengan bobot molekul.
Definisi atau Pengertian Elektroforesis

 Elektroforesis merupakan proses untuk memisahkan molekul – molekul

didalam suatu media (gel agarose) yang direndam ke dalam larutan buffer yang
diberi arus listrik.
 Elektroforesis dapat digunakan untuk memisahkan protein, DNA maupun
RNA. Gel yang dipakai menggunakan poliakrilamid maupun agarose.
 Senyawa (partikel) bermuatan dalam medan listrik yang bermuatan negative (-)
bergerak ke anode (+), yang bermuatan (+) akan bergerak katode (-).
 Banyak senyawa dalam bentuk ,olekul yang mudah terionkan seperti amino
acid, proteins, nucleotides, nucleic acids.
 Migrasi dari solute yang bermuatan dalam media cair/padat dan berada dalam
medan listrik.
 Manfaat Elektroforesis

 Manfaat elektroforesis gel antara lain :

a. Mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR
b. Memisahkan produk DNA dari hasil restriksi atau
digesti yang berbeda ukuran
c. Pemurnian atau puifikasi DNA
 Prinsip Dasar Elektroforesis DNA

 Sampel DNA yang akan dipisahkan harus bermuatan negative, dikarenakan

arus listrik yang akan diberikan bergerak dari muatan negative menuju muatan
positif.
 Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa
DNA.
 Kecepatan aliran molekul DNA tergantung pada berat molekul tersebut.
Apabila fragmen DNA berukuran besar, maka akan bermigrasi lambat,
sebaliknya fragmen DNA yang kecil akan bermigrasi cepat, sehingga
elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran
panjangnya.
 Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan ethidium bromide yang akan
masuk diantara ikatan hydrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan
kelihatan dibawah lampu UV.
Alat dan Bahan yang digunakan untuk
elektroforesis
 Alat :  Bahan :
a. Seperangkat alat a. Larutan TBE konsentrasi
elektroforesis 1X
b. Mikropipet ukuran 0,5 – 10 b. Agarose
µL
c. Aquades steril
c. Cetakan gel dan comb
d. Kertas parafilm
d. Microwave
e. Loading dye
f. Tip ukuran 0,5 – 10 µL
Prosedur pembuatan gel agarose 1 %
Tambahkan larutan Panaskan ke
Timbang 1 gram
TBE 1X sampai dalam microwave
agarose
volume 100 ml 2 menit

Tunggu sampai
Tunggu sampai Tuang kedalam suhu gel agarose
gel padat cetakan gel hangat

Gel agarose siap

digunakan
Prosedur kerja elektroforesis DNA menggunakan gel
agarosa
Masukan gel kedalam alat Siapkan kertas Ambil loading dye 2
Lepaskan comb
elektroforesis sampai gel
parafilm µl sebanyak jumlah
dari cetakan gel terendam larutan TBE sampel

Masukkan sampel yang

Tutup alat Campur sampel
sudah dicampur dengan Ambil sampel
elektroforesis loading dye ke dalam dengan loading
DNA 4 µL
sumuran gel dye

Setting alat :
Voltase : 50 volt
Waktu : 60 menit
Sistem dari elektroforesis gel agarosa
Pewarnaan hasil elektroforesis dengan
menggunakan ethidium bromide
Langkah Kerja

Ambil gel dari alat Masukkan gel Rendam selama 10 –

elektroforesisc kedalam larutan EtBr 15 menit

Bilas dengan air

Visualisasi gel dengan Angkat gel dari
mengalir selama 10 –
alat gel doc larutan EtBr
20 menit
Contoh hasil elektroforeis hasil isolasi DNA
 Elektroforesis dapat digunakan untuk memisahkan protein, DNA,
maupun RNA. Gel yang dipakai menggunakan poliakrilamid
maupun gel agarosa.
 Perbedaan elektroforesis menggunakan gel agarosa dan gel
poliakrilamid

No Perbedaan Elektroforesis gel agarosa Elektroforesis gel

poliakrilamid
1 Laju pemisahan Lebih cepat Lebih lambat
2 Resolusi gel Rendah Tinggi
3 Toksisitas gel Tidak toksik Toksik
4 Preparasi gel Lebih mudah dan cepat Lama
5 Gerak medan Horizontal Vertikal
Gambar elektroforesis Vertikal dan Horizontal
 TERIMA KASIH dan
SEMOGA BERMANFAAT