5|Elektroforesis gel agarosa

Uji kualitatif DNA

oleh: Faizah Fulyani, S.Si, M.Sc, Ph.D

Tujuan:
1. Memahami prinsip kerja elektroforesis gel agarose
2. Memisahkan fragmen DNA dan menentukan ukuran fragmen DNA

A. Teori Dasar:

Elektroforesis gel agarosa adalah metode untuk memisahkan fragmen DNA dengan cara
menggerakkannya melalui media padat berbahan agarosa. Agarosa merupakan suatu polisakarida
yang diperoleh dari rumput laut. Larutan agarosa yang memadat mengandung pori-pori kecil
yang berfungsi sebagai saringan untuk memisahkan DNA berdasarkan ukurannya. Apabila
sampel yang mengandung fragmen DNA dengan beragam ukuran dimasukan ke dalam gel
agarosa dan diberikan arus listrik dalam medium cairan, maka DNA akan bergerak melalui pori-
pori agarosa dari arah kutub negatif ke arah kutub positif. Pergerakan DNA ke arah kutub positf
dapat terjadi dikarenakan DNA bermuatan negatif pada kondisi fisiologisnya. Kecepatan
pergerakan molekul DNA berbanding terbalik dengan ukuran molekulnya. Untuk
mengoptimalkan pemisahan fragmen DNA maka acuan berikut dapat digunakan untuk
menentukan persen agarosa yang digunakan (Gambar1).

Terdapat beberapa larutan penyangga (buffer) yang bisa digunakan untuk elektroforesis gel
agarosa, tetapi yang paling umum adalah: Tris-asetat Buffer EDTA (TAE) dan buffer Tris-borate
EDTA (TBE).

Karena DNA tidak berwarna, untuk melacak sampel yang dimasukkan ke dalam gel agarose
digunakanlah suatu zat warna. Etidium bromida dapat dicampurkan kedalam larutan agarosa
sebelum memadat, yang apabila kemudian disinari dengan sinar UV mengakibatkan lokasi
tempat DNA berada menjadi berpendar.
Gambar 1. Kapasitas pemisahan gel agarose pada berbagai konsentrasi % (b/v).

B. Alat dan Bahan

Bubuk agarosa, 1X bufer TBE (89 mM Tris-base, 89 mM boric acid and 2 mM EDTA)
Disiapkan fresh dari larutan stock 10X TBE, Ethidium Bromide (5 mg/ml), Gel loading dye
(Glycerol and orange dye),1 kb and 100 bp DNA ladder, horizontal electrophoresis apparatus
and power supply.

C. Cara Kerja

C.1 Membuat gel agarosa

1. Buatlah 500 ml larutan buffer TBE 1x dengan mengencerkan larutan stock TBE 10x
2. Takar gram agarosa yang diinginkan untuk membuat 75 ml larutan agarosa 1%,
larutkan di dalam buffer TBE 1x.
3. Panaskan larutan hingga mendidih di dalam microwave untuk melarutkan agarosa
agar menghasilkan campuran yang homogen.
 4. Tambahkan 4 μl etidium bromida dengan HATI-HATI ke dalam larutan agarosa dan
aduk. Lakukan prosedur ini pada saat suhu larutan mencapai 60 derajat Celcius
5. Siapkan cetakan untuk membuat gel agarose dan tuangkan larutan agarosa ke dalam
cetakan
6. Letakkan sisir pada tempatnya. Biarkan gel mendingin hingga mencapai suhu kamar.

C.2 Memasukan sampel pada gel agarosa

7. Tempatkan gel di dalam ruang elektroforesis.

8. Tuangkan buffer elektroforesis secukupnya (1X TBE) untuk menutupi gel agar gel
tidak terlalu panas.
9. Lepaskan sisir dengan hati-hati.
10. Siapkan sampel DNA dengan mencampurkan sekitar 300 ng sampel DNA dengan 3-4
μl pewarna pemuatan.
11. Tambahkan 3 μl DNA ladder ke dalam sumur pertama dengan menggunakan
mikropipet.
12. Tempatkan sampel yang telah disiapkan dengan hati-hati ke dalam sumur yang
berdekatan
13. Elektroforesis sampel pada tegangan 95 V selama 45 menit (Periksa gel saat sedang
berjalan).

C.3 Memvisualisasi hasil elektroforesis gel agarosa

14. Keluarkan gel dengan hati-hati, letakkan di atas kotak sinar UV dan ambil gambar
gel.
15. Tentukan ukuran fragmen DNA
D. Pendalaman Materi 1.
Jawablah pertanyaan-pertanyaan berikut!

1. Tuliskan Alat dan bahan yang digunakan dalam percobaan sekaligus dengan fungsinya
berdasarkan video pembelajaran!
2. Sebutkan minimal 3 faktor yang mempengaruhi kecepatan pergerakan DNA pada agarosa?
3. Gambarkan struktur molekul agarosa!
4. Apakah terdapat keterkaitan antara ukuran pori-pori gel agarose dengan konsentrasi agarose
yang digunakan untuk membuat gel?
5. Bagaiamana cara memvisualisasi pita DNA pada gel agarose? Jelaskan!
6. Bagaimana cara menentukan ukuran frgamen DNA pada hasil DNA elektroforesis gel
agarosa ?
7. Apakah perbedaan penggunaan TAE dan TBE buffer pada DNA elektroforesis gel agarose?
8. DNA linier bermigrasi sebagai pita tunggal dengan ukuran yang dapat diprediksi pada gel
agarosa. Sebaliknya, DNA plasmid melingkar dapat muncul sebagai beberapa pita dan tidak
bermigrasi dengan kecepatan yang sama dikarenakan struktur sekundernya. Jelaskan jenis-
jenis struktur sekunder DNA plasmid yang muncul sebagai pita yang berbeda pada hasil
elektroforesis gel agarose!

E. Pendalaman Materi 2.
Analis hasil elektroforesis berikut !

1. Terdapat empat sampel DNA yang diberi label a, b, c, dan d. yang dianalisis dengan
menggunakan elektroforesis gel agarosa. Hasil elektroforesis DNA dapat dilihat sebagai
berikut. Diketahui bahwa ukuran fragment dari sampel a, b,c, dan d berturut turut adalah
200 kDa, 100 kDa, 700 kDa, dan 50 Kda. Tentukan lah letak sampel a, b, c, dan d pada hasil
elektroforesis berikut. Jelaskan jawaban anda !
F. Referensi
https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel
Molecular Cloning, A Laboratory Manuals, Sambrook and Russel, CSHL Press. 2001