Elektroforesis gel agarose adalah cara paling efektif untuk memisahkan fragmen DNA dengan

berbagai ukuran mulai dari 100 bp hingga 25 kb1. Agarose didapatkan dari isolasi rumput laut
Gelidium dan Gracilaria, dan terdiri dari subunit agarobiosa (L- dan D-galaktosa). Selama gelasi,
polimer agarosa berasosiasi secara non-kovalen dan membentuk jaringan bundel yang ukuran pori-
porinya menentukan pengayak molekuler gel properti. Penggunaan elektroforesis gel agarosa
merevolusi pemisahan DNA. Sebelum adopsi gel agarosa, DNA dipisahkan menggunakan sentrifugasi
gradien kepadatan sukrosa, yang hanya memberikan perkiraan ukuran. Untuk memisahkan DNA
menggunakan agarose elektroforesis gel, DNA dimasukkan ke dalam gel. Struktur molekul fosfat
DNA (dan RNA) bermuatan negatif, oleh karena itu ketika ditempatkan di medan listrik, fragmen
DNA akan bermigrasi ke anoda bermuatan positif. Karena DNA memiliki massa / rasio muatan yang
seragam, molekul DNA dipisahkan berdasarkan ukurannya dalam gel agarosa dalam pola sedemikian
rupa sehingga jarak yang ditempuh berbanding terbalik dengan log dari berat molekulnya. Model
pergerakan DNA pada gel agarosa adalah "reptation bias", dimana ujung terdepan bergerak maju
dan menarik sisa molekul lainnya. Laju migrasi molekul DNA melalui gel ditentukan oleh berikut ini:
1) ukuran molekul DNA; 2) konsentrasi agarosa; 3) konformasi DNA; 4) tegangan yang diterapkan, 5)
adanya ethidium bromide, 6) jenis agarosa dan 7) buffer elektroforesis. Setelah pemisahan, molekul
DNA dapat divisualisasikan di bawah sinar UV setelah dilakukan pewarnaan yang sesuai. Dengan
mengikuti protokol ini, siswa diharapkan mampu:

1. Paham mekanisme pemisahan fragmen DNA dalam matriks gel

2. Paham bagaimana konformasi molekul DNA akan menentukan mobilitasnya melalui matriks gel

3. Identifikasi larutan agarosa dengan konsentrasi yang sesuai untuk kebutuhan

4. Menyiapkan gel agarosa untuk elektroforesis sampel DNA

5. Menyiapkan peralatan elektroforesis gel dan power supply

6. Pilih tegangan yang sesuai untuk pemisahan fragmen DNA

7. Paham mekanisme yang memungkinkan etidium bromida untuk visualisasi pita DNA

8. Tentukan ukuran fragmen DNA yang dipisahkan

1. Persiapan Gel

1. Timbang massa agarosa yang sesuai ke dalam labu Erlenmeyer. Gel agarose dibuat menggunakan
larutan persentase w / v. Konsentrasi agarosa dalam gel akan bergantung pada ukuran fragmen DNA
yang akan dipisahkan, dengan sebagian besar gel berkisar antara 0,5% -2%. Volume buffer tidak
boleh lebih dari 1/3 kapasitas labu.

2. Tambahkan buffer yang mengalir ke labu yang berisi agarosa. Aduk untuk mencampur. Buffer
running gel yang paling umum adalah TAE (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA) dan TBE (45 mM Tris-
borate, 1 mM EDTA).

3. Lelehkan campuran agarosa / buffer. Hal ini paling sering dilakukan dengan memanaskan dalam
microwave, tetapi juga dapat dilakukan dengan api Bunsen. Pada 30 detik interval, angkat labu dan
aduk isinya agar tercampur rata. Ulangi sampai agarosa benar-benar larut.
4. Tambahkan etidium bromida (EtBr) dengan konsentrasi 0,5 μg / ml. Sebagai alternatif, gel juga
dapat diwarnai setelah dilakukan elektroforesis dalam buffer yang mengandung 0,5 μg / ml EtBr
selama 15-30 menit, diikuti dengan destaining dalam buffer pada jangka waktu yang sama.

Catatan: EtBr diduga merupakan bahan karsinogen dan harus dibuang dengan benar sesuai
peraturan institusi. Sarung tangan harus selalu dipakai saat memegang gel yang mengandung EtBr.
Pewarna alternatif untuk pewarnaan DNA tersedia; namun EtBr tetap menjadi yang paling populer
karena sensitivitasnya dan biayanya.

5. Biarkan agarosa dingin baik di atas meja atau dengan inkubasi dalam penangas air 65 ° C. Jika tidak
dilakukan, baki gel akan bengkok.

6. Tempatkan baki gel ke dalam peralatan pengecoran. Sebagai alternatif, dapat dengan merekatkan
tepi terbuka baki gel untuk membuat cetakan. Tempatkan sisir yang sesuai ke dalam cetakan gel
untuk membuat sumur.

7. Tuang agarosa cair ke dalam cetakan gel. Biarkan agarosa mengeras pada suhu kamar. Angkat sisir
dan tempatkan gel di dalam kotak gel. Sebagai alternatif, gel dapat dibungkus dengan bungkus
plastik dan disimpan pada suhu 4 ° C sampai digunakan (Gbr. 1).

2. Menyiapkan Alat Gel dan Pemisahan Fragmen DNA

1. Tambahkan pewarna ke sampel DNA yang akan dipisahkan (Gbr. 2). Pewarna pemuatan gel
biasanya dibuat dengan konsentrasi 6X (0,25% bromphenol biru, 0,25% xylene cyanol, 30% gliserol).
Memuat pewarna membantu melacak sejauh mana sampel DNA Anda telah berjalan, dan juga
memungkinkan sampel tenggelam ke dalam gel.

2. Program power supply ke voltase yang diinginkan (1-5V / cm antar elektroda).

3. Tambahkan running buffer secukupnya untuk menutupi permukaan gel. Penting untuk
menggunakan buffer berjalan yang sama seperti yang digunakan untuk menyiapkan gel.

4. Pasang ujung kotak gel ke power supply. Nyalakan power supply dan pastikan bahwa kotak gel
dan power supply berfungsi.

5. Buka tutupnya. Masukkan sampel DNA secara perlahan dan hati-hati ke dalam gel (Gbr. 3). Marker
ukuran DNA yang sesuai harus selalu dimuat bersama dengan sampel eksperimental.

6. Pasang kembali tutup kotak gel. Katoda (kabel hitam) harus lebih dekat ke sumur daripada anoda
(kabel merah). Periksa kembali apakah file elektroda dipasang ke slot yang benar di power supply.

7. Nyalakan power. Jalankan gel sampai pewarna berpindah ke jarak yang sesuai.

3. Mengamati Fragmen DNA Terpisah

1. Setelah elektroforesis selesai, matikan power supply dan lepaskan tutup kotak gel.

2. Keluarkan gel dari kotak gel. Tiriskan sisa buffer dari permukaan gel. Letakkan baki gel di atas tisu
untuk menyerap sisa buffer.
3. Keluarkan gel dari baki gel dan paparkan gel ke sinar UV. Hal ini biasanya dilakukan dengan
menggunakan sistem dokumentasi gel (Gbr. 4). Pita DNA harus muncul sebagai pita fluoresen
oranye. Ambil gambar gel (Gbr. 5).

4. Buang gel dan buffer dengan benar sesuai peraturan institusi.

4. Hasil Representatif

Gambar 5 menunjukkan hasil khas setelah elektroforesis gel agarosa dari produk PCR. Setelah
pemisahan, fragmen DNA yang dihasilkan terlihat sebagai band yang jelas. Standar atau tangga DNA
harus dipisahkan sedemikian rupa sehingga memungkinkan penentuan ukuran pita sampel. Dalam
contoh yang ditunjukkan, fragmen DNA 765 bp, 880 bp dan 1022 bp dipisahkan pada gel agarosa
1,5% bersama dengan 2-log Tangga DNA.

DISKUSI

Elektroforesis gel agarose telah terbukti menjadi cara yang efisien dan efektif untuk memisahkan
asam nukleat. Kekuatan gel agarose yang tinggi memungkinkan untuk penanganan gel persentase
rendah untuk pemisahan fragmen DNA yang besar. Penyaringan molekuler ditentukan oleh ukuran
pori-pori yang dihasilkan bundel agarose dalam matriks gel. Secara umum, semakin tinggi
konsentrasi agarosa semakin kecil ukuran pori-porinya. Gel agarosa tradisional paling efektif pada
pemisahan fragmen DNA antara 100 bp dan 25 kb. Untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih
besar dari 25 kb, dibutuhkan gel elektroforesis, yang melibatkan penerapan arus bolak-balik dari dua
arah yang berbeda. Dengan cara ini Fragmen DNA berukuran lebih besar dipisahkan oleh kecepatan
di mana gel mengubah orientasinya, dengan perubahan arah. Fragmen DNA lebih kecil dari 100 bp
lebih efektif dipisahkan menggunakan gel elektroforesis poliakrilamida. Tidak seperti gel agarosa,
matriks gel poliakrilamida terbentuk melalui reaksi kimia radikal bebas. Gel yang lebih tipis ini
memiliki konsentrasi yang lebih tinggi, dan memiliki resolusi yang lebih baik. Pada sekuensing DNA
modern elektroforesis kapiler digunakan, di mana tabung kapiler diisi dengan matriks gel.
Penggunaan tabung kapiler memungkinkan untuk penerapan dengan tegangan tinggi, sehingga
memungkinkan pemisahan fragmen DNA (dan penentuan urutan DNA) dengan cepat.

Agarosa dapat dimodifikasi untuk menjadi agarosa low melting melalui hidroksietilasi. Agarosa low
melting umumnya digunakan saat isolasi fragmen DNA yang diinginkan. Hidroksietilasi mengurangi
kepadatan kemasan bundel agarosa, secara efektif mengurangi ukuran pori mereka. Ini berarti
bahwa fragmen DNA dengan ukuran yang sama akan membutuhkan waktu lebih lama untuk
bergerak melalui gel agarosa low melting dibandingkan dengan gel agarosa standar. Karena bundel
berasosiasi satu sama lain melalui interaksi non-kovalen, gel agarosa dapat dilelehkan kembali
setelah ia mengeras.

EtBr adalah reagen yang paling umum digunakan untuk mewarnai DNA dalam gel agarosa. Saat
terkena sinar uv, elektron dalam cincin aromatik dari etidium molekul diaktifkan, yang menyebabkan
pelepasan energi (cahaya) saat elektron kembali ke keadaan dasar. EtBr bekerja dengan
menginterkalasi dirinya sendiri di Molekul DNA dalam cara yang bergantung pada konsentrasi. Ini
memungkinkan untuk perkiraan jumlah DNA dalam pita DNA tertentu berdasarkan intensitasnya.
Karena muatan positifnya, penggunaan EtBr mengurangi tingkat migrasi DNA hingga 15%. EtBr
adalah mutagen dan karsinogen tersangka, Oleh karena itu seseorang harus berhati-hati saat
menangani gel agarosa yang mengandungnya. Selain itu, EtBr dianggap sebagai limbah berbahaya
dan harus dibuang dengan benar. Pewarnaan alternatif untuk DNA dalam gel agarosa termasuk SYBR
Gold, SYBR green, Crystal Violet dan Methyl Blue. Methyl Blue dan Crystal Violet tidak membutuhkan
gel paparan sinar uv untuk visualisasi pita DNA, sehingga mengurangi kemungkinan mutasi jika
pemulihan fragmen DNA dari gel diinginkan. Namun, kepekaannya lebih rendah daripada EtBr. SYBR
emas dan SYBR hijau keduanya sangat sensitif, pewarna yang bergantung pada sinar UV dengan
toksisitas lebih rendah daripada EtBr, tetapi harganya jauh lebih mahal. Banyak pewarna alternatif
tidak bisa atau tidak bekerja dengan baik saat ditambahkan langsung ke gel, oleh karena itu gel harus
diwarnai setelah elektroforesis. Karena biaya, kemudahan penggunaan, dan kepekaan, EtBr masih
tetap menjadi pewarna pilihan bagi banyak peneliti.

Pewarnan yang digunakan dalam gel elektroforesis memiliki tiga tujuan utama. Pertama,
menambahkan kerapatan pada sampel, memungkinkannya meresap ke dalam gel. Kedua, pewarna
memberi warna dan mempermudah proses pemuatan. Serta, pewarna bergerak dengan kecepatan
standar melalui gel, yang memungkinkan untuk perkiraan jarak migrasi fragmen DNA.

Ukuran pasti dari fragmen DNA yang terpisah dapat ditentukan dengan memplot log berat molekul
untuk pita DNA yang berbeda. standar terhadap jarak yang ditempuh oleh setiap band. Standar DNA
berisi campuran fragmen DNA dengan ukuran yang telah ditentukan sebelumnya dapat
dibandingkan dengan sampel DNA yang tidak diketahui. Penting untuk dicatat bahwa berbagai
bentuk DNA bergerak melalui gel dengan kecepatan berbeda. Supercoiled DNA plasmid, karena
konformasinya yang kompak, bergerak melalui gel paling cepat, diikuti oleh fragmen DNA linier
dengan ukuran yang sama, dan yang berbentuk melingkar terbuka bergerak paling lambat.

Kesimpulannya, sejak adopsi gel agarosa pada tahun 1970-an untuk pemisahan DNA, telah terbukti
sebagai salah satu yang teknik paling berguna dalam penelitian ilmu biologi.