PERCOBAAN II

ANALISIS DNA DAN PROTEIN

DENGAN ELEKTROFORESA

A. TUJUAN PERCOBAAN
1. Memahami prinsip dasar agarose gel elektrophreresis
(AGE)
2. Memahami prinsip dasar Polyacrylamide Gel Elektro-
phreresis (PAGE)
3. Mengisolasi DNA strawberi
4. Mendeteksi DNA hasil isolasi dalam agarose gel
elektroforesa
5. Mendeteksi profil protein organel sel dan kasein murni
serta kasein hasil isoasi dari susu sapi

B. LANDASAN TEORI
Elektroforesa adalah teknik yang menggunakan aliran
listrik untuk memisahkan molekul-molekul bermuatan
yang berbeda ukuran melalui suatu matrik berpori-pori
(seperti gel). Molekul molekul berukuran lebih kecil
bergerak lebih mudah atau lebih cepat melalui pori-pori
gel daripada yang berukuran lebih besar. Media gel yang
sering digunakan untuk memisahkan molekul besar
seperti protein dan DNA adalah poliakrilmid dan agarose.
Pergerakan molekul bermuatan dalam media yang dike-
nai medan listrik dinyatakan oleh persamaan: E.q
v=
f
Dimana:
E = medan listrik dalam volt / cm
q = muatan neto molekul
f = koefisien gesekan, yang tergantung pada massa dan
bentuk molekul
v = kecepatan molekul
 Beberapa ahli DNA menggunakan agarose gel untuk
memisahkan fragment DNA dengan teknik elektroforesa.
Agarose gel dibuat dari ganggang laut yang telah dimurni-
kan dan berkualitas tinggi. Agarose adalah polimer linear
terdiri dari residu D- dan L-galaktosa yang berikatan
glikosidik α-(1 → 3) dan -(1 → 4). Residu L-galaktosa
memiliki jembatan anhydro antara posisi 3 dan 6 (Gambar
2-1).

Gambar 2.1. Struktur kimia agarosa

Kecepatan migrasi DNA melalui gel agarosa ditentukn

oleh faktor-faktor: (1) ukuran molekul DNA, (2) konsen-
trasi agarosa, (3) konformasi DNA, (4) adanya ethidium
bromide dalam gel dan buffer, (5) tegangan yang
digunakan, dan (6) Jenis bufer yang digunakan.
Gel agarosa dimasukkan ke dalam tangki elektroforsa
yang telah diisi dengan larutan garam yang dapat
menghantarkan arus listrik. DNA sampel diload
(dimasukkan) ke dalam sumur-sumur yang dibuat pada
saat pembuatan gel. Oleh karena sampel DNA tidak
berwarna, maka untuk meudahkan saat loading maka
sampel DNA diwarna dulu dengan loading dye yang
berwarna biru. Warna ini akan membantu juga untuk
mengamati jalannya migrasi DNA saat proses elektro-
foreasis. Gugus fosfat pada tulang punggung DNA
membawa muatan negative sehingga DNA lebih bermu-
atan negatif. Dalam aliran listrik DNA bermuatan negative
akan bergerak menuju kutub bermuatan positif pada
chamber eletroforesa. Untuk menampakkan DNA
digunakan pewarna fluorescence, ethidium bromide
(EtBr). EtBr akan berikatan dengan doble heliks DNA yang
dapat dilihat dibawah sinar UV
Gel poliakrilamida disiapkan melalui reaksi polimeri-
sasi radikal bebas dari akrilamida dan agen cross-linking
N,N’-methylene-bis-akrilamida (Gambar 2.2). Reaksi poli-
merisasi yang dimaksud dikendalikan oleh sistem inisiator-
katalis, amonium persulfate-N,N,N’,N’-tetrame-
thylethylenediamine (TEMED). Riboflavin dengan adanya
radiasi UV dapat dugunakan sebagai inisiator pemben-
tukan radikal.

Gambar 2.2. Reaksi kimia pmbentukan poliakrilamida

 Perbandingan jarak migrasi protein yang diukur dari
titik start sampai jarak terjauh yang ditempuh (ditandai
dengan jejak warna) merupakan harga Rf. Jarak migrasi
dan kondisi pemisahan protein sangat ditetukan oleh
komposisi gel. Komposisi gel dinyatakan dalam %T dan
%C. %T menggabarkan isi total akrilamida (jumlah
akrilamida dan monomer cross-linking), %C merupakan
bagian zat cross-linking dari monomer, yang ditentukan
dengan rumus:
AA + C C
%T = x 100 %C = x 100
V AA + C
AA = jumlah akrilamida (g), C= jumlah cross-linking (g), V
= volum campuran gel (mL).

(Akrilamida sangat beracun, hindari menghirup debu, &

gunakan sarung tangan saat bekerja dengan monomer).
Hampir semua elektroforesa untuk analisis protein
dilakukan dengan gel poliakrilamida di bawah kondisi yang
memastikan bahwa disosiasi protein berada dalam
subunit polipeptida untuk meminimalkan agregasi.
Umumnya digunakan deterjen yang sangat anionik
natrium dodesilsulfat (SDS) atau cetyltrimethylammo-
nium bromide (CTAB) dikombinasi dengan zat pereduksi
(DTT) dan panas untuk mendenaturasi protein menjadi
unit tunggal sebelum dimasukkan ke dalam gel.
Polipeptida terdenaturasi mengikat SDS dan menjadi
bermuatan negatif. Karena jumlah SDS terikat hampir
selalu sebanding dengan berat molekul polipeptida dan
independen, maka kompleks SDS-polipeptida akan
bermigrasi melalui gel poliakrilamida sesuai dengan
ukuran polipeptida. Dengan menggunakan marker
protein, berat molekul polipeptida atau protein sampel
dapat diperkirakan. Elektroforesis yang demikian sering
disebut Elektroforesa denatursi.
alam kebanyakan kasus, elektroforesis gel SDS-
poliakrilamida dilakukan dengan terputus-putus
Sistem penyangga yang buffer di waduk adalah pH dan
kekuatan ion yang berbeda dari bahwa buffer digunakan
untuk melemparkan gel. Kompleks SDS-polipeptida dalam
sampel yang diterapkan untuk gel yang tersapu oleh batas
bergerak dibuat ketika arus listrik adalah melewati antara
elektroda. Setelah bermigrasi melalui gel susun porositas
tinggi, kompleks disimpan di zona yang sangat tipis (atau
tumpukan) pada permukaan gel menyelesaikan.
Kemampuan sistem penyangga terputus berkonsentrasi
semua kompleks dalam sampel menjadi sangat volume
kecil sangat meningkatkan resolusi gel SDS-poliakrilamida.
Sistem buffer diskontinyu yang paling banyak digunakan
pada awalnya dirancang oleh Ornstein A964) dan Davis
A964). Sampel dan gel susun berisi Tris-Cl (pH 6,8), yang
waduk penyangga atas dan bawah berisi Tris-glisin (pH
8,3), dan gel menyelesaikan berisi Tris-Cl (pH 8,8). Semua
komponen dari sistem mengandung 0,1% SDS (Laemmli
1970). Klorida ion dalam sampel dan stacking gel
membentuk terdepan dari batas bergerak, dan trail- yang
trailing edge terdiri dari molekul glisin. Antara tepi
terkemuka dan trailing yang bergerak batas zona
konduktivitas rendah dan gradien tegangan curam, yang
menyapu polypep- yang polipeptida dari sampel dan
deposit mereka di permukaan gel menyelesaikan. Ada pH
lebih tinggi gel menyelesaikan nikmat ionisasi glisin, dan
ion glisin yang dihasilkan bermigrasi melalui polipeptida
ditumpuk dan perjalanan melalui gel menyelesaikan
segera balik klorida ion. Dibebaskan dari batas bergerak,
kompleks SDS-polipeptida bergerak melalui resolv- yang
 menyelesaikan gel di zona tegangan seragam dan pH dan
dipisahkan menurut ukuran dengan analisa saringan.

C. ALAT
1. Satu set alat AGE
2. Set alat PAGE vertikal
3. Mikropipet dan tip
4. Power suply
5. Lampu UV atau Gel Doc
6. Mortar
7. Tabung reaksi
8. Tabung eppendorf
9. Pipet lengkung untuk mengambil DNA

D. BAHAN
1. DNA Marker
2. Protein Marker
3. Sampel DNA
4. Ethidium Bromide (EtBr)
5. dd H2O (aquabidest)
6. Gel Agarose
7. Loading Buffer (Loading dye)
8. Buffer Tri-Asetat-EDTA (TAE)
9. Akuades
10. NaCl (garam)
11. Sabun cair
12. Alkohol 96% dan 70%
13. Akrilamida dan N, N’-metilen-bis-akrilamida
Larutan stok: mengandung 29% (w/v) akrilamida dan
1% (w/v) N, N'-metilen-bis-akrilamida dilarutkan
dalam H2O hangat. Cek pH larutan adalah 7,0 atau
kurang. Simpan larutan dalam botol coklat di 4oC.
14. Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10 % (w/v)
 Larutan stok: timbang 2 g SDS dilarutkan dalam
aquades sampai volum akhir 20 mL, diaduk. Simpan di
suhu kamar.
15. TEMED
16. Bufer Tris-Cl 50 mM (pH 6,8)
17. Amonium persulfat (APS) 10%
Larutan stok (w/v): timbang 1 g APS dilarutkan dalam
10 mL aquades, aduk, simpan di 4oC.
18. Bufer elektroforesis Tris-glisin 1X dengan komposisi:
25 mM Tris
250 mM glisin (Elektroforesis grade) (pH 8,3)
0,1% (w/v) SDS
Laurtan stok 5X: larutkan 1.51 g of Tris base dan 9,4 g
glycine dalam 90 ml dH2O, Kemudian tambahkan 5 ml
10% (w/v) larutan stok SDS dan volum dibuat menjadi
100 mL dengan dH2O. Simpan di suhu kamar.

E. CARA KERJA
Isolasi DNA Stroberi
1. Ambil sekitar 3 buah stroberi, cuci sampai bersih
2. Letakkan stroberi di plastik lalu hancurkan dengan
menggunakan mortar dan alu.
3. Tuang stroberi yang sudah hancur ke dalam gelas beker
kemudian tambahkan sabun cair 10 tetes.
4. Kemudian tambahkan 5 mL akuades dan 5 mg garam
5. Saring campuran stroberi tadi menggunakan kertas
saring sambil diperas ke dalam tabung reaksi.
6. Ca 5 mL filtrate strawberi hasil ditambahkan 5 mL 96%
etanol.
7. Diamkan dan amati yang terjadi pada tabung reaksi.
8. Bila terbentuk lapisan tipis benang-benang pada
tabung reaksi, segera ambil benang-benang tipis
tersebut menggunakan pipet lengkung.
9. Masukkan lapisan benang yang mengandung DNA tadi
ke dalam epi dan cuci dengan etanol 70%, kemudian
keringkan dan dilarutkan dalam 50 μL akuabides,
ratakan sela-sela dinding agar seluruh DNA yang ada di
dalam epi larut.

Pembuatan Gel Agarose

1. Timbangan 0, 75 gram bubuk agarose dilarutkan pada
60 ml Buffer TAE.
2. Campuran tersebut dilarutkan dengan cara dipanaskan
sampai mendidih.
3. Setelah semua terlarut kemudian didiamkan pada
suhu ±50°C.
4. Gel Comb dipasang pada casting gel (pencetak gel).
5. Larutan agarose bersuhu ±50°C dituangkan pada
cetakan gel dan didinginkan hingga mengeras.
6. Setelah gel tersebut mengeras, gel comb dapat diambil
dan gel agarose siap untuk digunakan.

Elektroforesis dengan Gel Agarosa

1. Gel Agarose dalam tray diambil dari cetakan kemudian
dimasukkan ke dalam tangki (chamber) elektroforesa
dan direndam dengan Buffer TAE 1X.
2. loading dye 1μl dicampur dengan 3,5 μl Sampel DNA
pada parafilm yang telah tersedia dengan bantuan
mikropipet.
3. Campuran tersebut dituangkan ke sumur/well pada gel
agarose.
4. Sedangkan untuk 3,5 μl DNA marker 1kb dituangkan
pada sumur/well yang berada pada paling tepi kiri atau
kanan.
5. Tangki elektroforesis kemudian ditutup dan
dihubungkan ke power supply.
6. Power Supply diset 100V dan proses elektroforesis
dijalankan selama 45 menit.

Dokumentasi
1. Gel agarose hasil elektroforesis direndam pada larutan
EtBr selama ± 15 menit.
2. Dilanjutkan dengan direndam sebentar dalam akuades
(untuk menghilangkan background EtBr saat
dokumentasi) (optional)
3. Divisualisasi dibawah sinar UV (atau dengan
menggunakan Gel Doc) dan kemudian diambil
gambarnya.
(Gel disimpan dalam plastik tertutup, disimpan dalam
kulkas untuk Percobaan III)

Pembuatan Gel Poliakrilamid

1. Pasang
Menuangkan SDS-poliakrilamida Gel
1. Pasang pelat kaca sesuai dengan instruksi produsen.
2. Tentukan volume cetakan gel (informasi ini biasanya
disediakan oleh pabrikan yang produsen). Dalam
sebuah labu Erlenmeyer atau tabung plastik sekali
pakai, siapkan volume yang sesuai larutan yang
mengandung konsentrasi yang diinginkan dari
akrilamida untuk gel menyelesaikan, menggunakan
nilai yang diberikan dalam Tabel A8-9. Mencampur
komponen-komponen dalam urutan yang
ditunjukkan. Polimerisasi akan mulai segera setelah
TEMED telah ditambahkan. Tanpa penundaan, aduk
campuran cepat dan lanjutkan ke langkah berikutnya.
Konsentrasi amonium persulfat yang kami sarankan
lebih tinggi dari yang digunakan oleh beberapa
peneliti. Hal ini menghilangkan kebutuhan untuk
 membersihkan solusi akrilamida oksigen terlarut
(yang menghambat polimerisasi) oleh degassing.
3. Tuangkan larutan akrilamida ke celah antara pelat
kaca. Meninggalkan ruang yang cukup untuk gel susun
(panjang gigi sisir ditambah 1 cm). Gunakan pipet
untuk peduli- hati-hati overlay solusi akrilamida
dengan 0,1% SDS (untuk gel yang mengandung -8%
akrilamida) atau isobutanol (untuk gel yang
mengandung -10% akrilamida). Tempatkan gel dalam
posisi vertikal di kamar temperatur. Overlay
mencegah oksigen dari menyebar ke gel dan
menghambat polimerisasi. Isobutanol melarutkan
plastik beberapa aparat minigel.
4. Setelah polimerisasi adalah menit C0 lengkap),
tuangkan overlay dan mencuci bagian atas gel
beberapa kali dengan deionisasi H2O untuk
menghilangkan akrilamida unpolymerized. Tiriskan
sebagai banyak cairan mungkin dari atas gel, dan
kemudian menghapus sisa H2O dengan tepi handuk
kertas.
5. Siapkan gel susun sebagai berikut: Dalam sebuah
tabung plastik sekali pakai, mempersiapkan berapi
yang tepat volume larutan yang mengandung
konsentrasi yang diinginkan akrilamida, menggunakan
nilai yang diberikan dalam Tabel A8-10. Mencampur
komponen-komponen dalam urutan yang
ditunjukkan. Polimerisasi akan mulai segera setelah
TEMED telah ditambahkan. Tanpa penundaan, aduk
campuran cepat dan lanjutkan ke langkah berikutnya.
Konsentrasi amonium persulfat lebih tinggi dari yang
digunakan oleh beberapa peneliti. Ini menghilangkan
kebutuhan untuk membersihkan solusi akrilamida
 oksigen terlarut (yang menghambat polymerisasi)
oleh degassing.
6. Tuangkan larutan susun gel langsung ke permukaan
menyelesaikan gel polimerisasi. Segera menyisipkan
Teflon sisir bersih ke dalam larutan gel susun, berhati-
hati untuk menghindari menjebak gelembung udara.
Tambahkan larutan gel lebih susun untuk mengisi
ruang-ruang yang complete- sisir sepenuhnya.
Tempatkan gel dalam posisi vertikal pada suhu kamar.
Sisir teflon harus dibersihkan dengan H2O dan
dikeringkan dengan etanol sebelum digunakan.
Persiapan Sampel dan Menjalankan Gel
7. Sementara gel susun adalah polimerisasi, menyiapkan
sampel dalam volume yang sesuai lx SDS gel-loading
penyangga dan panas mereka untuk 100 ° C selama 3
menit untuk denaturasi protein. Pastikan untuk
mengubah sifat sampel yang mengandung protein
penanda berat molekul yang dikenal. Campuran tepat
polipeptida berukuran tersedia dari sumber
komersial. Protein sangat hidrofobik, seperti yang
mengandung beberapa domain transmembran,
mungkin endapan atau multimerize ketika direbus
selama 3 menit pada 100 ° C. Untuk menghindari hal
ini, panasi sampel selama 1 jam pada suhu yang lebih
rendah D5-55 ° C) untuk efek denaturasi.
8. Setelah selesai polimerisasi menit C0), menghapus
sisir Teflon hati-hati. Gunakan botol semprot untuk
mencuci sumur segera dengan deionisasi H2O untuk
menghilangkan unpolymerized akrilamida. Jika perlu,
meluruskan gigi gel susun dengan suntik tumpul jarum
melekat pada jarum suntik. Mount gel di aparat
elektroforesis. Tambahkan Tris-glisin elektroforesis
penyangga ke waduk atas dan bawah. Hapus semua
 gelembung yang menjadi terjebak di bagian bawah gel
antara pelat kaca. Hal ini paling baik dilakukan dengan
hipo membungkuk jarum suntik yang melekat pada
jarum suntik. Sebuah PENTING Jangan prerun gel
sebelum loading sampel, karena prosedur ini akan
menghancurkan diskontinuitas dari sistem penyangga.
9. Beban hingga 15 ?? dari masing-masing sampel dalam
urutan yang telah ditentukan ke bagian bawah sumur.
Hal ini paling baik dilakukan dengan Hamilton
mikroliter syringe atau micropipettor sebuah
dilengkapi dengan gel-pemuatan tips yang dicuci
dengan penyangga dari reservoir bawah setelah
masing-masing sampel dimuat. Memuat volume yang
sama lx SDS gel-loading buffer ke setiap sumur yang
tidak terpakai.
10. Pasang aparat elektroforesis untuk catu daya listrik
(elektroda positif harus terhubung ke buffer waduk
bawah). Menerapkan tegangan dari 8 V / cm untuk gel.
Setelah depan dye telah pindah ke gel menyelesaikan,
meningkatkan tegangan 15 V / cm dan run gel sampai
biru bromofenol mencapai bagian bawah gel
menyelesaikan (-4 jam). Kemudian mematikan listrik.
11. Lepaskan pelat kaca dari aparat elektroforesis dan
menempatkannya pada handuk kertas. Gunakan gel
spacer ekstra hati-hati membongkar piring terpisah.
Tandai orientasi gel dengan memotong sudut dari
bawah gel yang paling dekat dengan sumur paling kiri
(slot 1).
PENTING Jangan memotong sudut dari gel yang akan
digunakan untuk immunoblotting.
12. Pada tahap ini, gel bisa diperbaiki, diwarnai dengan
Coomassie Brilliant Blue atau garam perak,
fluorographed atau autoradiographed, atau
 digunakan untuk mendirikan imunoblot, semua
seperti yang dijelaskan pada halaman berikut.

GELS PEWARNAAN SDS-poliakrilamida

Protein berlabel dipisahkan dengan elektroforesis gel
poliakrilamid biasanya terdeteksi oleh pewarnaan, baik
dengan Coomassie Brilliant Blue atau dengan garam
perak. Dalam waktu yang relatif cepat dan lurus Reaksi
langsung, Coomassie Brilliant Blue mengikat nonspesifik
untuk protein tetapi tidak untuk gel, sehingga
memungkinkan visualisasi protein sebagai band biru
bijaksana dalam matriks tembus gel (Wilson 1983). Perak
pewarnaan, meskipun agak lebih sulit untuk melakukan,
secara signifikan lebih sensitif. Penggunaan pewarnaan
perak memungkinkan deteksi protein diselesaikan oleh gel
elektroforesis pada konsentrasi hampir 100 kali lipat lebih
rendah daripada yang terdeteksi oleh Coomassie Brilliant
Biru pewarnaan (Switzer et al 1979;. Merril et al 1984.).
Identifikasi protein dengan noda-perak pewarnaan
didasarkan pada pengurangan diferensial ion perak, dalam
reaksi yang sama dengan yang digunakan pada proses
fotografi. Reagen untuk pewarnaan dengan Coomassie
Brilliant Blue serta kit (misalnya, Biru Cetak Cepat
HALAMAN Stain, Life Technologies) yang tersedia secara
komersial. Kit untuk pewarnaan perak tersedia secara
komersial dari Pierce dan Bio-Rad.
Pewarnaan SDS-Polyacrylamide Gel dengan Coomassie
Brilliant Blue
Coomassie Brilliant Blue adalah pewarna
aminotriarylmethane yang membentuk kuat tetapi tidak
kovalen kompleks dengan protein, kemungkinan besar
dengan kombinasi Waals van der dan elektrostatik
interaksi dengan kelompok + NH3. Coomassie Brilliant
Blue digunakan untuk protein noda setelah pemilihan
umum elektroforesis melalui gel poliakrilamida.
Penyerapan zat warna adalah sekitar sebanding dengan
jumlah protein, mengikuti hukum Beer-Lambert.
Polipeptida dipisahkan oleh SDS-poliakrilamida gel dapat
secara bersamaan tetap dengan asam asetat
methanohglacial dan diwarnai dengan Coomassie Brilliant
Blue R-250, trifenilmetana sebuah pewarna tekstil juga
dikenal sebagai asam Biru 83. Gel direndam selama
beberapa jam dalam terkonsentrasi methanol: larutan
asam asetat dari pewarna, dan kelebihan zat warna
kemudian dibiarkan berdifusi dari gel selama periode
berkepanjangan destaining.

BAHAN
PERHATIAN: Silakan lihat Lampiran 12 untuk penanganan
yang tepat dari bahan yang ditandai dengan <!>.
Coomassie Brilliant Blue R-250
Larutan asam Methanohacetic <I>
Campurkan 900 ml metanol: H2O E00 ml metanol dan 400
ml H2O) dan 100 ml asetat glasial
AC id.

Langkah 1 dari protokol ini membutuhkan reagen

tercantum pada halaman? 8.42.

METODE
1. protein terpisah dengan elektroforesis melalui gel
SDS-poliakrilamida seperti yang dijelaskan pada
Halaman A8.40.
2. Siapkan solusi pewarnaan dengan melarutkan 0,25 g
Coomassie Brilliant Blue R-250 per 100 ml larutan
asam methanoliacetic. Saring larutan melalui
 Whatman No 1 penyaring untuk menghilangkan
partikel.
3. Rendam gel dalam setidaknya 5 volume larutan
pewarnaan dan tempat pada plat- perlahan berputar
platform untuk minimal 4 jam pada suhu kamar.
4. Hapus noda dan menyimpannya untuk penggunaan
masa depan. Destain gel dengan merendamnya dalam
methanol: larutan asam asetat tanpa pewarna pada
platform perlahan goyang untuk 4-8 jam, mengubah
solusi destaining tiga atau empat kali. Lebih teliti gel
destained, semakin kecil jumlah protein terdeteksi
oleh pewarnaan dengan Coomassie Brilliant Blue.
Destaining selama 24 jam biasanya memungkinkan
sesedikit 0,1? G protein terdeteksi dalam sebuah band
tunggal. Tingkat lebih cepat dari destaining dapat
dicapai dengan cara berikut:
• destaining di 30% metanol, 10% asam asetat. Jika
destaining berkepanjangan, akan ada beberapa
kerugian intensitas pewarnaan pita protein.
• destaining dalam buffer destaining normal pada
suhu yang lebih tinggi D5 C) °.
• Termasuk beberapa gram resin pertukaran anion
atau sepotong spons di destain- biasa destaining
penyangga. Ini menyerap noda karena larut dari gel.
• destaining elektroforesis di aparat yang dijual secara
komersial untuk tujuan ini.
5. Setelah destaining, menyimpan gel dalam H2O dalam
kantong plastik tertutup. Gel dapat disimpan tanpa
batas waktu tanpa penurunan dalam intensitas
pewarnaan; Namun, tetap gel poliakrilamida disimpan
dalam H2O akan membengkak dan dapat mendistorsi
selama penyimpanan. Untuk menghindari-masalah ini
masalah, toko gel tetap di H2O mengandung 20%
 gliserol. Gel Stained tidak harus disimpan dalam
destaining penyangga, karena pita protein bernoda akan
memudar. Untuk membuat catatan permanen, baik
memotret gel bernoda (lihat Bab 5, Protocol 2) atau
kering gel seperti yang dijelaskan pada p. A8.50.

PENGERINGAN SDS-gel polyacrylamide

Gel SDS-poliakrilamida yang mengandung protein
radiolabeled dengan 35S-berlabel asam amino harus
dikeringkan sebelum gambar autoradiografik dapat
diperoleh. Masalah utama yang dihadapi saat gel dikeringkan
adalah A) penyusutan dan distorsi dan B) retak gel. Yang
pertama dari-masalah ini masalah dapat diminimalkan jika gel
melekat selembar kertas Whatman 3mm sebelum itu
dehidrasi dehidrasi. (Untuk gel nonradioactive, diketahui
bahwa preferensi mungkin untuk mengeringkan gel antara
asetat lembar untuk memungkinkan transillumination dan
mudah visualisasi dari gel kering.) Namun, tidak ada dijamin
solusi untuk masalah kedua, yang menjadi lebih jelas dengan
gel tebal mengandung lebih poliakrilamida. Retak umumnya
terjadi ketika gel dihapus dari pengeringan peralatan sebelum
benar-benar dehidrasi. Oleh karena itu penting untuk
menjaga pengeringan aparatur dalam kondisi baik,
menggunakan garis vakum handal yang memiliki beberapa
fluktuasi tekanan, dan menggunakan gel tipis kemungkinan
untuk mencapai tujuan yang diinginkan. Alternatif yang
sangat baik Metode yang merendam gel dalam 3% gliserol,
diikuti dengan pengeringan di udara dengan menggunakan
alat sederhana (Tersedia dari AP Biotech atau Owl Ilmiah).

BAHAN
PERHATIAN: Silakan lihat Lampiran 12 untuk penanganan
yang tepat dari bahan yang ditandai dengan <!>.
Memperbaiki solusi Glasial asam asetat: metanol: H2O A0:
20: <!> 70 v / v / v)
Pengering Gel
Pengering Gel yang tersedia dari sejumlah sumber komersial
(misalnya, Life Technologies dan Promega). Saya yang terbaik
adalah untuk membeli pengering dari produsen SDS-
poliakrilamid tangki elektroforesis gel untuk memastikan
bahwa ukuran pengering akan disesuaikan dengan yang ada
pada gel dan akan mengakomodasi beberapa SDS-gel
poliakrilamida secara bersamaan.

Methanol B0%) yang mengandung 3% gliserol <!>

Opsional, silakan lihat Langkah 1.
Kertas Whatman 3mm

METODE
1. Lepaskan gel dari aparat elektroforesis dan menetaskan itu
pada suhu kamar di 5-10 volume memperbaiki solusi. The
bromofenol biru akan berubah kuning seperti penetapan
asam solusi berdifusi ke gel. Lanjutkan fiksasi selama 5
menit setelah semua warna biru memiliki menghilang, dan
kemudian mencuci gel sebentar di H2O deionisasi. Jika
retak polyacrylamide gel selama pengeringan adalah
masalah konstan, rendam gel tetap di 20% methanol, 3%
gliserol semalam sebelum melanjutkan ke Langkah 2.
2. Pada sepotong Saran Wrap sedikit lebih besar dari gel,
mengatur gel dengan memotong sudut pada sisi kanan
bawah.
3. Tempatkan selembar kertas kering Whatman 3mm pada
gel basah. Makalah harus besar cukup untuk membuat
perbatasan A-2 cm) sekitar gel dan cukup kecil untuk muat
di koran gel. Jangan mencoba untuk memindahkan kertas
3mm sekali kontak telah dibuat dengan gel.
4. Atur sepotong kertas 3mm kering pada permukaan
pengeringan pengering gel. Potongan ini harus cukup
besar untuk menampung semua gel yang akan dikeringkan
pada waktu yang sama.
5. Tempatkan sandwich 3mm kertas / gel / Saran Wrap pada
selembar kertas 3mm pada gel pengering. The Saran Wrap
harus menonjol.
6. Tutup penutup dari pengering gel, dan menerapkan hisap
sehingga tutup membuat segel ketat di sekitar gel. Jika
pengering dilengkapi dengan pemanas, menerapkan E0-
65 panas rendah ° C) untuk mempercepat pengeringan
proses.
7. Keringkan gel untuk waktu yang disarankan oleh produsen
(biasanya 2 jam untuk standar Gel 0,75-mm). Jika panas
diterapkan, matikan api selama beberapa menit sebelum
melepaskan vakum.
8. Lepaskan gel, yang sekarang melekat pada selembar kertas
3mm, dari pengering.
9. Lepaskan sepotong Saran Wrap dan mendirikan
autoradiograf seperti yang dijelaskan dalam Lampiran 9,
atau menyimpan gel dehidrasi sebagai catatan percobaan.

Penyiapan Sampel Protein

sampel protein
Sampel harus diselesaikan, misalnya, dapat dimurnikan
protein atau sel lisat.
% SDS gel-loading penyangga
50 mM Tris-Cl (pH 6,8)
100 mM dithiothreitol
2% (b / v) SDS (elektroforesis grade)
0,1% bromofenol biru
10% (v / v) gliserol
F. PERTANYAAN
1. Mengapa Gel agarose setelah running harus di rendam
di dalam larutan EtBr?
2. Apakah Aquades bisa digunakan sebagai pengganti
buffer elektroforesa?
3. Apakah yang dimaksud dengan Poly acrylamide Gel
Elektroforesa (PAGE)?
4. Apakah perbedaan antara AGE, PAGE dan Paper
electrophoresis (PE)?

G. PUSTAKA
R. Boyer: Biochemistry Laboratory Modern Theory and
Techniques. 2012.
M. Holtzhauser: Basic Methods for the Biochemical Lab,
2006.
B. Sambrook and D.W. Russel, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 3ed, 2001