Laporan Pratikum

Analysis of Rekombinant Proteins by

SDS-polyacrylamide Gel Electrophoresis and Western Blotting

Oleh :

Dita Fauziah

2010342011

Dosen pembimbing :

Pekik Wiji Prasetyaningrum, M.Farm

Badan Riset dan Inovasi Nasional

Cibinong
2023
A. Prinsip
Prinsip dari SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) adalah
pemisahan protein melalui matriks gel. Protein dipisahkan berdasarkan berat
molekulnya dan panjang rantai polipeptida. Protein yang berikatan dengan
SDS (detergen anionik) akan bermuatan negatif dan bergerak ke elektroda
yang bermuatan positif. Laju pergerakan ini ditentukan oleh berat molekul
protein tersebut. Semakin ringan berat molekul suatu protein, maka semakin
cepat laju pergerakannya (Smith, 2003)
Setelah protein dipisahkan dengan eletroforesis, protein dapat
dideteksi dengan Western Blotting. Proses ini dimulai dengan memindahkan
protein dari gel ke membran. Membran yang memiliki afinitas yang tinggi
terhadap protein harus diblok dengan buffer pemblokan seperti susu tanpa
lemak atau 3–5% bovine serum albumin (BSA) untuk mencegah reaksi non
spesifik. Setelah itu dilakukan penandaan protein target dengan antibodi
primer dan sekunder untuk divisualisasikan (Mahmood & Yang, 2012).

B. Dasar Teori
Blotting adalah salah satu metode analitik yang berguna untuk
mendeteksi dan kuantifikasi protein atau asam nukleat. Secara umum, metoda
blotting memiliki empat langkah berikut, yaitu elektroforesis gel sampel,
mentransfer sampel eletroforesis dari gel ke membran, mengikat sampel
(molekul target) dengan probe, dan deteksi visual. Metoda ini memiliki tiga
jenis berdasarkan target yang dideteksinya, yaitu Southern Blotting, Nothern
Blotting, dan Western Blotting. Southern Blotting adalah metoda yang
digunakan untuk memeriksa keberadaan urutan sekuen DNA. Nothern
Blotting merupakan metoda untuk mengetahui tingkat ekspresi gen dengan
cara mendeteksi RNA. Terakhir, Western Blotting merupakan metoda untuk
mendeteksi protein spesifik berdasarkan berat molekulnya.
Salah satu cara kerja utama dari Western Blotting adalah transfer
protein dari gel poliakriamida setelah ektroforesis ke membran nitroselulosa
atau pilivilidena diflurorida (PVDF) sehingga didapatkan protein spesifik
yang dapat dideteksi berdasarkan reaksi antibodi. Pada Western Blotting ini,
umumnya jenis elektroforesis yang digunakan memakai gel poliakrimide yang
mengandung sodium dodecyl sulfate (SDS) atau dikenal dengan SDS-PAGE
(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis).
SDS-PAGE merupakan metoda yang dikembangkan oleh Ulrich K.
Laemli yang bekerja dengan cara memisahkan protein berdasarkan berat
molekul antara 5 sampai 250 kDa. Adanya SDS yang merupakan detergen
anionic memungkinkan semua protein berubah bermuatan negatif. Jumlah
 SDS yang terikat protein sebanding dengan ukurannya. Sekitar 1,4 gram SDS
terikat per 1 gram protein. Selain itu, SDS memiliki efek denaturasi protein
yang kuat dengan memotong ikatan disulfide sehingga protein berubah
menjadi rantai linear (Smith, 2003).

Gambar 1. Prinsip kerja SDS-PAGE

https://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/sds-page.html

Protein yang sudah dipisahkan oleh SDS-PAGE dapat diwarnai dengan agen
kimia seperti Coomasie Brilliant Blue R250 (CBB) atau menggunakan pewarna
perak. Jika sudah diwarnai dapat dilanjutkan ke proses Transfer (Western
Blotting) lalu pemblokiran.
Proses pemblokiran merupakan proses yang penting dilakukan pada metoda
Western Blotting. Proses ini bertujuan untuk menghindari positif palsu dengan
cara menempatkan membran dalam larutan 5 % BSA atau susu tanpa lemak yang
diencerkan dengan 0,05% TBS-T. Cara kerjanya larutan tersebut dengan
berikatan pada membran di semua tempat dimana protein target belum menempel.
Sehingga ketika ditambahkan antibodi primer, antibodi primer dapat berikatan
spesifik ke protein target. Protein target ini dapat dideteksi dengan menggunakan
spektrofotometer massa.

C. Tujuan
Tujuan dari analisis protein rekombinan dengan metode SDS-PAGE dan
Western Blotting adalah untuk mengetahui dan dan mendeteksi protein target.
D. Alat dan Bahan SDS-PAGE
1. Alat
a. Electrophoresis Tank
b. Power Supply
c. Wadah plastic untuk pewarnaan dan destaining gel
2. Bahan
a. 1,5 M Tris/HCl (pH 8.8) (jangan sesuaikan pH) = 36,3 g Tris Base +
45 ml 1 N HCl + up to 200 ml H2O
b. 1 M Tris/HCl (pH 6,8) = 24,2 g Tris Base + 150 ml H2O
(sesuaikan pH menjadi 6,8 dengan konsentrasi HCl (10-15 ml) dan
jadikan volume total 200 ml.
c. 5x Tris/Glycerine Electrode Buffer (25 mM Tris, 250 mM glycerin,
0,1% SDS) = 15,1 g Tris base + 94 g Glyserin + 50 ml 10%SDS + up
to 1 liter H2O.
d. 2x SDS Loading Buffer = 1 ml 1 M Tris/HCl (pH 6.8) + 4 ml 10 %
SDS + 20 mg BPB + 2 ml Glycerol + up to 9 ml H2O.
e. 30% Acrylamide Solution = 29 g Acrylamide + 1 g N.N’-
methylenbisacrylamide. (larutkan dalam 100 ml H2O)
f. CBB Staining Solution (0,25% CBB, 50% methanol, 10% asam asetat)
= 1 g CBB + 200 ml Methanol + 160 ml H2O + 40 ml asam asetat.
g. Destaining solution (30% methanol: 10% asam asetat)
= 150 ml methanol + 50 ml asam asetat + up to 500 ml H2O.
h. 1 N HCl: Campurkan 40 ml conc. HCl (36%, 11.6 M) dengan H2O
untuk membuat 464 ml.

E. Prosedur SDS-PAGE
1. Menyiapkan mini slab gel
a. Pembuatan gel
- Campurkan sebagai berikut untuk membuat 15 ml gel
(bisa membuat 2 gel minislab).

% of gel 8% 10% 12%

H2O 6.9 5.9 4.9
30% acrylamide 4.0 5.0 6.0
sol
1,5 M Tris (pH 3.8 3.8 3.8
8,8)
10% APS 0.15 0.15 0.15
- Lapisi gel dengan 0,5 ml isopropanol untuk membuat permukaan
permukaan di atas rata.
 b. Pembuatan gel susun 5% (stacking gel)
- Saat gel pemisah mengeras, buang isopropanol
- Cuci permukaan gel dengan air
- Campurkan

H2O 2,7 ml
30% acrylamide sol 0,67
1.0 M Tris/HCl (pH 6,8) 0,5
10% SDS 0,04
10% APS 0,04
TEMED 0,004

- Tuang larutan di antara plat kaca

- Masukkan sisir dengan hati-hati agar tidak ada gelembung udara
yang terperangkap di bawah gigi sisir.
- Diamkan sampai gel benar-benar mengeras.
c. Penyiapan Buffer Elektoda
- 100 ml 5x Tris/Gly electrode Buffer
- 400 ml H2O
d. Saat polimerisasi selesai, siapkan tangki elektroforesis.
Arus listrik menghasilkan panas selama elektroforesis. Distribusi suhu
yang tidak merata pada gel mendistorsi ujung depan sampel (smilling).
Beberapa tangki elektroforesis adalah ruang yang dalam di mana gel
pemisah direndam dalam elektroda buffer untuk membuat distribusi
panas yang merata dan mencegah garis sampel melengkung.
2. Preparasi Sampel
a. Campurkan 20 ug sampel protein dengan loading buffer
Sampel Protein 5 ul 10 ul
2x Loading Buffer + 2-ME 5 ul 10 ul
b. Panaskan pada suhu 95ºC selama 3 menit dan dinginkan
c. Lalu masukkan ke sumur gel
3. Elektroforesis
a. Sambungkan kabel power supply. Atur power supply pada mode arus
konstan.
b. Terapkan arus yang cukup sehingga tegangannya sekitar 100V.
c. Jalankan elektroforesis sampai pewarna BPB biru mencapai 5 mm di
atas dasar gel.
Cara alternatif; menjalankan tegangan konstan:
 Terapkan 100 V sampai pewarna biru mencapai bagian bawah susun
gel. Terapkan 200 V sampai pewarna biru mencapai 5 mm dari dasar
gel pemisah
4. Pewarnaan dan destaining
a. Keluarkan gel dari pelat kaca.
b. Celupkan gel dalam larutan pewarnaan CBB dalam wadah plastik.
Inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar atau suhu 50ºC.
c. Pindahkan gel ke destaining solution, letakkan satu atau dua lembar
Kim Wipe. Inkubasi pada suhu kamar sampai pita protein terlihat.
d. Rendam gel dalam air dan letakkan di atas kotak iluminasi. Ambil
gambar gel yang sudah di-destained. Atau letakkan gel di antara dua
lembar plastik bening. Atur dalam bingkai plastik dan keringkan
beberapa jam pada suhu kamar atau dalam pengering 65°C.

F. Alat dan Bahan Western Blotting

1. Alat
a. Transblotting Tank
b. Power supply (max.200 V, 200 mA)
2. Bahan
a. Transfer Buffer
Methanol 800 ml (final 20%)
Tris 12,12 g
Glysin 57,63 g
H2O Up to 4 liter
b. TBS-T/PBS-T; TBS atau PBS mengandung 0,05% Tween 20
Tris (final 20 mM) 2,42 g
NaCl (final 133 mM) 80 g
1N HCl 16,5 ml pH = 7,6
20% Tween 20 2,5 ml 0,05 atau 1%
H2O Total 1000 ml
c. Methanol
d. Membran Plivinylidene difluoride (PVDF)
e. Kertas saring; Whatman 3 MM /kertas saring ketebalan sedang

G. Prosedur Western Blotting

Ukuran gel seharusnya 6x9cm. Ubah ukuran membran dan filter sesuai
dengan ukuran gelnya.
1. Siapkan membran PVDF (6x9 cm) dan kertas saring Whatman 3MM (4
lembar kertas untuk setiap membran, dan ukurannya harus sekitar 7x10
cm).
2. Rendam membran PVDF dalam metanol selama 5 menit lalu rendam
dalam Transfer Buffer (jangan biarkan membran mengering) selama 45-60
menit sambil dikocok.
3. Rendam kertas saring dan spons dalam Transfer Buffer.
4. Setelah elektroforesis, bilas pelat dengan air keran, lalu pisahkan pelat dan
isolasi gel. Rendam gel dalam Transfer Buffer (hanya untuk menghindari
kekeringan saat menyiapkan sandwich).
5. Atur sandwich blotting sebagai berikut.
Gulung gelembung udara dengan pipet panjang disetiap tumpukan lapisan,
spons, kertas saring, membran, atau gel
Urutan tumpukan adalah sebagai berikut ini.
a. Positif (+) Elektode merah (Sisi putih)
b. Spons (direndam dalam transfer buffer)
c. 2 lembar kertas saring (direndam dalam transfer buffer)
d. Membran PVDF (direndam dalam transfer buffer)
e. Gel
f. 2 lembar kertas saring (direndam dalam transfer buffer)
g. Spons (direndam dalam transfer buffer)
h. Negatif (-) Elektode hitam (Sisi hitam)

Gambar 2. Susunan Blotting Sandwich

6. Masukkan gumpalan kertas saring dan gel ke dalam alat. Lihat panduan
pengguna perangkat tentang cara memasang gumpalan ke tangki blotter
 7. Isi tangki dengan Transfer Buffer. Tempatkan tangki atau pengaduk
magnet dan masukkan batang pengaduk kecil ke dalam tangki. Aduk terus
selama proses transfer.
8. Atur tegangan 100V konstan (sekitar 150 mA) selama 1 jam. Atau, tangki
dikemas dengan es dalam kotak styrofoam, dan diletakkan di atas
pengaduk magnet. Lalu diatur konstan 20% untuk semalam. Aduk Buffer
9. Lepaskan membran.
10. Rendam membran dalam TBS-T (atau PBS-T) selama 2 menit.
11. Sekarang membran siap untuk dideteksi oleh antibodi.

H. Kesimpulan
SDS-PAGE adalah metoda elektroforesi yang memisahkan protein
berdasarkan berat jenisnya dan protein tersebut bermuatan negatif karena
berikatan dengan SDS (detergen anionic). Sedangkan metoda western
Blotting adalah metoda untuk mentransfer protein yang berada di gel
poliakriamida ke membran pilivilidena diflurorida (PVDF). Hasilnya, protein
target dapat dideteksi berdasarkan warna band yang dihasilkan pada membran
pilivilidena diflurorida akibat adanya reaksi antibodi dengan protein target.

Daftar Pustaka

Mahmood, T., & Yang, P. C. (2012). Western Blot: Technique, Theory, and Trouble
Shooting. North American Journal of Medical Sciences, 4(9), 429.
https://doi.org/10.4103/1947-2714.100998
Smith, B. J. (2003). SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Proteins,
41–56. https://doi.org/10.1385/0-89603-062-8:41/COVER
Kawaichi, M., (2013). Protein Purification and Characterization. 14-25. Cibinong:
LIPI