SODIUM DODECYLSULPHATE-

POLYACRYLAMIDE GEL
ELECTROPHORESIS
(SDS-PAGE)
TUJUAN PRAKTIKUM

• Mengetahui prinsip dasar SDS-PAGE

• Mengetahui langkah-langkah dalam SDS-PAGE
ELEKTROFORESIS PROTEIN
Memisahkan protein berdasarkan ukuran
(berat molekul)
Dapat digunakan untuk :
• Karakterisasi
• Kuantifikasi
• Menentukan kemurnian sampel
• Membandingkan berbagai protein dari
sumber yang berbeda
• Merupakan salah satu langkah dalam
western blot
SDS-PAGE
sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel
electrophoresis

Tujuan : memisahkan protein berdasarkan

ukurannya (dengan memberikan muatan yang
sama)
SODIUM DODECYLSULPHATE
• SDS (sodium dodecyl sulfate) adalah
suatu detergent yang dapat
melarutkan molekul hidrofob dan
memberi muatan negatif
• Bila SDS ditambahkan pada protein
maka protein akan larut dalam
detergent tersebut dan akan
bermuatan negatif
•
SODIUM DODECYLSULPHATE

Suatu sampel protein yang dipanaskan dalam detergent SDS dan

beta merkaptoetanol :
- Merkaptoetanol akan mereduksi ikatan disulfida
- Detergent akan merusak struktur sekunder dan tersier
Hasil akhir :
Protein hanya memiliki struktur primer (linier)
Protein memiliki muatan negatifbila diletakkan dalam medan
listrik akan bermigrasi dari kutub negatif menuju kutub positif
SODIUM DODECYLSULPHATE

Now we are ready to focus on the second half - PAGE.

POLYACRYLAMIDE GEL
ELECTROPHORESIS (PAGE)
• Gel dipersiapkan segera sebelum dipakai
• Polimerisasi akrilamid dan N,N’-methylene bis
acrylamide. Pori-pori dikontrol oleh melalui proporsi
kedua komponen tersebut.
akrilamid berpotensi neurotoksin, hati-hati saat menimbang akrilamid
dan bisakrilamid (gunakan sarung tangan dan masker)
• Ammonium persulfate (APS) menyediakan radikal
bebas untuk proses polimerisasi
• TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylenediamine)
mempercepat proses polimerisasi dengan
mengkatalisis pembentukan radikal bebas oleh APS.
POLYMERIZATION OF
ACRYLAMIDE
 POLYACRYLAMIDE GELS

Bis-Acrylamide polymerizes along with acrylamide

forming cross-links between acrylamide chains
PERPINDAHAN PROTEIN DALAM GEL

Protein yang lebih

kecil akan
bergerak lebih
cepat
dibandingkan
protein yang lebih
besar
VERTICAL GEL FORMAT: POLYACRYLAMIDE
GEL ELECTROPHORESIS
Reservoir/Tank
Power Supply
Glass Plates, Spacers, and Combs
Step by Step Instructions on how to assemble the polyacrylamide gel
apparatus
PROSEDUR
Pembuatan gel poliakrilamid
Preparasi sampel :
• Tambahkan sampel dengan sampel buffer
• Panaskan pada 95°C selama 4 menit
Aplikasi sampel ke dalam gel poliakrilamid
Jalankan apparatus 100v selama 1,5 jam
Pewarnaan gel
PREPARASI GEL

Reagent 10% (Running Gel) 5% (Stacking Gel)

Acrylamide/ Bisacrylamide 3.3 ml 0.67 ml

(40%) *
1 M Tris-HCl pH 8.8 2.5 ml 0.5 ml
water (distilled) 4.0 ml 2.7 ml
10% SDS 100 µl 40 µl
10% Ammonium Persulfate 100 µl 40 µl

TEMED (added last) 4 µl 4 µl

* = 19:1 w:w ratio of acrylamide to N,N'-methylene bis-acrylamide
SAMPLE BUFFER
• Tris buffer
• SDS untuk melarutkan protein dan memberi
muatan negative
• Gliserol untuk membuat sampel turun kedalam
well
• Bromophenol blue untuk memberi warna
sampel

Panaskan 95C selama 4 menit

LOADING SAMPLES & RUNNING THE GEL

Running Buffer, pH 8.3

Tris Base 12.0 g
Glycine 57.6 g
SDS 4.0 g

distilled water to 4 liter

SDS-PAGE
PEWARNAAN PROTEIN DALAM GEL

Coomassie Brilliant Blue

• Dapat mendeteksi 1 µg protein
Silver Staining
• Sekitar 100 kali lebih sensitif, dapat mendeteksi 10
ng protein
ESTIMASI BERAT MOLEKUL DENGAN SDS-PAGE
Molecular
Weight
Standard

250 KD
150
100
75
50
37

25

20

15

10
WESTERN BLOT
TERIMA KASIH