Praktikum Biokimia 2016

MODUL V
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI ASAM NUKLEAT

I. DASAR TEORI

Asam nukleat disusun dari nukleotida yang memilki komponen-komponen basa purin
(adenin atau guanin) dan basa pirimidin (sitosin, urasil atau timin), gula ribosa atau
deoksiribosa dan gugus fosfat. Asam nukleat terbagi ke dalam dua jenis, DNA
(deoxyribose nuleic acid) dan RNA (ribose nucleic acid).
Pada organisma tingkat rendah speprti bakteri dan ragi DNA dan RNA berada pda
sitoplasma sedangkan pada organisme yang lebih tinggi, tumbuhan dan hewan, DNA
berada dalam inti dan RNA berada diluar inti pada organel lain dan dalam sitoplasma.
Pada percobaan ini akan dilakukan isolasi DNA dari sel tanaman. Tahap awal adalah
memecahkan sel yang dapat dilakukan dengan kombinasi beberapa tehnik dan senyawa
kimia. Penambahan deterjen memiliki dua fungsi; (i) membantu solubilisasi membran dan
memperlemah struktur sel, (ii) menghambat aktivitas enzim nuklease. EDTA juga dapat
menghambat kerja enzim tersebut dengan mengikat ion logam di-atau trivalen.
Setelah asam nukleat berada`pada larutan, maka perlu dilakukan proses pemisahan DNA
dari komoponen-kompenen sel. Asam nukleat dipisahkan dari protein dengan penambahan
natrium perklorat (NaClO4). Penambahan pelarut organik menyebabkan protein
terdenaturasi dan mengendap pada interface dan pada saat yang bersamaan juga
melarutkan lipid. Oleh karena itu, pada lapisan air akan tertinggal asam nukleat, molekul
kecil yang larut dalam air dan beberapa protein sebagai kontaminan. Penambahan etanol
menyebabkan pengendapan molekul besar (DNA, RNA dan protein) dan molekul kecil akan
tertinggal dalam larutan. Pada tahap ini DNA akan terdapat sebagai molekul besar yang
berbentuk benang-benang yang dapat dililitkan pada batang gelas. Protein dan RNA
mengendap berbentuk gel dan tidak dapat dililitkan pada batang gelas. Oleh karena itu pada
tahap ini terjadi pemisahan DNA dari RNA dan protein.
Setelah isolasi DNA maka diperlukan tahap identifikasi yag dapat dilakukan dengan uji
biokimia; uji fosfat, uji deoksiribosa dan uji basa purin. Uji difenilamin adalah uji spesifik
untuk deoksiribosa dan sampel yang mengandung DNA akan memberikan warna biru. Uji
fosfat dengan reagen amonium molibdat menghasilkan endapan warna kuning. Uji basa
purin dengan pereaksi AgNO3 menghasilkan endapan warna putih yang sedikit larut atau
dengan ion Cu2+ dan NaHSO3 menghasilkan endapan kuning.

II. TUJUAN :
Mengisolasi asam nukleat dari sel tanaman. .

III. ALAT DAN BAHAN

Gelas kimia 50 mL Buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8

Gelas ukur 25 mL Larutan SDS-salin (7 g SDS dilarutkan
dalam 250 mL NaCl 0,75 M)
Corong pisah Kloroform-isoamil alkohol (24:1)
Pipet pasteur Amonium sulfat 4M
Mortar dan alu Etanol 96% dingin
Batang pengaduk Kecambah
Mikropipet 100 L 1000 L Aquadest steril
Tabung reaksi EDTA 0,5 M pH 8
Hot plate Buffer TE
Shaker-waterbath 55C H2SO4 1M
Kertas lakmus Amonium molibdat

RFK-Institut Teknologi Del Page 1

 Praktikum Biokimia 2016

Kalium fosfat 10%

Larutan Dische

IV. PROSEDUR PERCOBAAN

4.1. Isolasi Asam Nukleat dari Kecambah

1. Timbang kecambah sebanyak 5 gram kemudian buang akar dan bagian yang
berwarna hijau, kemudian tempatkan dalam mortar.
2. Tambahkan 10 ml buffer Tris-Cl pH 8, kemudian kecambah digerus dalam mortar,
pasta yang terbentuk dipindahkan ke dalam gelas kimia dan ditambah 2 ml larutan
amonium sulfat 4M, kemudian diaduk dengan batang pengaduk gelas selama 10
menit.
3. Tambahkan 15 ml larutan SDS dan 1 mL EDTA 0,5 M pH 8 ke dalam campuran dan
inkubasi pada suhu 55C dalam shaker waterbath selama 15 menit.
4. Pindahkan campuran ke dalam corong pisah dan ekstraksi dengan 20 ml kloroform-
isoamil alkohol (24:1).
5. Lapisan bawah dibuang dan lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung sentrifuga,
kemudian disentrifuga pada 4000 g selama 10 menit.
6. Pipet supernatan dan pindahkan ke dalam gelas kimia kemudian tambahkan etanol
dingin 2,5 kali. Asam nukleat akan mengendap berupa benang-benang halus dan
dapat diambil dengan batang pengaduk.
7. Cuci DNA yang diperoleh dengan 1 mL etanol 70% dan keringkan pada suhu ruang.
8. Larutkan DNA dalam 1 mL buffer TE.

4.2. Uji Biokimia Asam Nukleat

Hidrolisis asam nukleat hasil isolasi dengan menambahkan 5 mL H2SO4 1M ke

dalam 750 L asam nukleat hasil isolasi, kemudian dipanaskam dalam penangas air
mendidih selama 3 menit. Dinginkan dalam suhu ruang lalu netralkan dengan
meneteskan NaOH 2 M sambil dicek menggunakan kertas lakmus. Lakukan uji berikut
ini terhadap hidrolisat asam nukleat.

Uji Fosfat
Tambahkan 1 ml larutan amonium molibdat ke dalam 1 mL hidrolisat asam nukleat,
kemudian panaskan dalam penangas air mendidh selama 5 menit.
Adanya endapan kuning menunjukkan uji fosfat positif.
Sebagai pembanding gunakan kalium fosfat 10%.

Uji deoksiribosa
Tambahkan 5 mL reagen Dische ke dalam 1 mL hidrolisat asam nukleat kemudian
campuran diinkubasi dalam penangas air mendidih selama 5 menit.
Warna biru menunjukkkan uji positif terhadap deoksiribosa.

Uji Basa Purin dengan AgNO3

Ke dalam 1 mL hidrolisat asam nukleat tambahkan beberapa tetes NH4OH sampai
bersifat basa, kemudian tambahkan beberapa tetes AgNO3 1%
Adanya putih yang sedikit larut menandakan adanya basa purin.
Sebagai pembanding gunakan, adenin, guanin dan sitosin.

RFK-Institut Teknologi Del Page 2

 Praktikum Biokimia 2016

REFERENCES
Frederick Bettelheim and Joseph Landesberg, 2000, Laboratory Experiments for General,
Organic & Biochemistry 4th ed. Harcourt Brace College, London.

POST LAB QUESTION

Jawaban dikerjakan per kelompok dan diserahkan pada saat akhir praktikum.

1. Jelaskan apakah reaksi dengan difenilamin dapat membedakan ribosa dan

deoskiriobosa, DAN dan RNA?
2. Apa yang terjadi pada saat sampel yang mengandung DNA dihidrolisis dengan
H2SO4? Jelaskan hasil reaksinya.
3. Jelaskan bagaiman uji difenilamin dapat memberikan warna biru pada sampel yang
mengandung DNA.
4. Jelaskan prinsip reaksi uji fosfat pada DNA dengan uji amonium molibdat.
5. Jelaskan prinsip reaksi uji basa purin dengan AgNO3.

RFK-Institut Teknologi Del Page 3