MODUL PRAKTIKUM

ANALISIS BIOMEDIK DAN FORENSIK

MUTAKIN
WIWIEK INDRIYATI
IDA MUSFIROH
ALIYA NUR HASANAH
DRIYANTI RAHAYU
MUCHTARIDI
SANDRA MEGANTARA
FEBRINA AMELIA SAPUTRI
RIMADANI PRATIWI

DEPARTEMEN ANALISIS FARMASI DAN KIMIA MEDISINAL

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2017
 MODUL 1

Pengukuran Fosfor Anorganik dari Urin Manusia dengan Metode

Spektrofotometri

Prinsip

Fosfor anorganik dalam filtrat bebas protein direaksikan dengan amonium molibdat
(Mo (VI)) membentuk amonium fosfomolibdat. Senyawa ini direduksi dengan agen
pereduksi membentuk “molibdenum biru” sebuah jenis molibdenum heteropoli.
Molibdat tidak direduksi pada kondisi ini. Warna biru yang terbentuk diukur secara
spektrofotometri.

Reaksi

7PO43- + 12 (NH4)6Mo7O24 +36 H2O  7 (NH4)3PO4 .12MoO3 + 51 NH4+ + 72

OH-

(NH4)3PO4 .12MoO3 + agen pereduksi  Mo(V) berwarna biru

(walaupun amonium molibdat (NH4)2MoO4 dapat terkristalisasi, kristal yang

umum terbentuk adalah (NH4)6Mo7O24.4H2O atau 3(NH4)2O.7MoO3.4H2O)

Larutan dan bahan kimia yang dibutuhkan

1. 5% (b/v) larutan asam trikloroasetat (TCA); 5 M H2SO4;

asamaminonaftolsulfonat sebagai larutan pereduksi disiapkan sebagai
berikut: Tambahkan 0,5 gram 1,2,4-asam aminonaftolsulfonat dan 5 mL
larutan natrium sulfit (20g natrium sulfit anhidrat/100 mL) ke dalam 195
mL larutan natrium bisulfit (15 g natrium bisulfit/100mL) dalam botol
coklat. Kocok hingga larut. Jika tidak, tambahkan 1 mL larutan natrium
sulfit dengan mengocok terus menerus. Hindari penambahan natrium sulfit
berlebihan. Simpan di kulkas. Larutan stabil selama 1 bulan.
2. Larutan stok fosfor (100 mg/dL P): larutkan 0,439 g KH2PO4 dalam air dan
encerkan hingga 100 mL dalam labu ukur.
3. Larutan kerja fosfor. Pipet 1 mL larutan baku fosfor dan encerkan hingga
100 mL dengan larutan 5% TCA. (Perhatian. TCA sangat korosif, hindari
kontak dengan kulit). Larutan 1 mg/dL ini digunakan untuk menyiapkan
 konsentrasi bertingkat berikutnya. Pipet 2 mL dan 5 mL larutan ke dalam
labu ukur 10 mL dan encerkan dengan larutan 10% TCA hingga tersedia
baku dengan konsentrasi 0,2; 0,5; dan 1 mg/dL. Konsentrasi ini
berhubungan dengan konsentrasi 2, 5, dan 10 mg/dL fosfor dalam sampel,
seperti prosedur dibawah, karena adanya pengenceran sampel 1:10.
4. Larutan amonium molibdat. Larutkan 2,5 g amonium molibdat dalam 80
mL air dan tambahkan 30mL larutan 5 M H2SO4.

Prosedur

1. Larutkan urin dalam air dengan perbandingan 1:10

2. Ambil urin sebanyak 0,5 mL dan pindahkan ke wadah
3. Siapkan larutan baku 0,2; 0,5; dan 1 mg/dL di wadah terpisah
4. Tambahkan 1 mL reagen molibdat, kocok
5. Tambahkan 0,4 mL larutan asamaminonaftolsulfonat, kocok
6. Diamkan 5-10 menit
7. Ukur pada panjang gelombang 690 nm
8. Konsentrasi yang terukur dikalikan dengan 100 untuk mendapatkan
konsentrasi fosfor dalam urin. Konsentrasi normalnya adalh 0,4 – 1,3 g/hari.
 MODUL 2

PENENTUAN KONSENTRASI NATRIUM DAN KALIUM DALAM URIN

MENGGUNAKAN FLAME ATOMIC-EMISSION SPECTROSCOPY

Tujuan
Menentukan konsentrasi natrium dan kalium dalam urin menggunakan Flame
Atomic-Emission Spectroscopy

Pendahuluan

Spektroskopi nyala emisi atom merupakan metode analisis instrument yang cepat,
mudah, dan sensitive untuk penentuan “trace metal element” dalam larutan. Metode
ini relative bebas dari gangguan unsur lain karena mempunyai karakteristik emisi
line yang sempit (0,1 nm). Metode ini juga mempunyai akurasi dan presisi yang
baik dengan limit deteksi yang rendah yaitu antara 1 ng/ml and 1 µg/ml.

Metode ini cocok untuk analisis berbagai macam logam terutama logam yang
mudah tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi seperti Li, Na, K, Rb, Cs, Ca,
Cu, Sr, and Ba. Secara umum, golongan metaloid dan nonlogam tidak akan
menghasilkan atom netral pada nyala tetapi kebanyakan menghasilkan ion dan
polyatomic radikal. Oleh karena itu golongan nonlogam tidak dapat ditentukan
dengan spektroskopi emisi nyala kecuali dalam penanganan dan kondisi khusus.

Flame photometry adalah metode analisis empiris, tidak mutlak, seperti gravimetri,
sehingga metode ini harus dikalibrasi secara berkala. Banyak variable
eksperimental yang berbeda mempengaruhi intensitas cahaya yang dipancarkan
dari nyala api untuk sampai ke detector. Oleh karena itu perlu dilakukan kalibrasi
secara hati-hati agar dapat memperoleh hasil yang baik.

Instrument (Corning 400® Flame Photometer)

Flame photometer adalah photometer nyala emisi atom pada suhu rendah
(udara/gas alami) yang dirancang untuk analisis rutin natrium dan kalium dalam
larutan, yang merupakan unsur penting dalam system fisiologis tubuh. Kadar
normal Na+ and K+ dalam plasma adalah 136-145 mM dan 3.5-5.0 Mm yang setara
dengan 3200 dan 170 µg/mL. Sebelum dianalisis, plasma tersebut diencerkan
terlebih dahulu100-200 kali lipat. Pada intrumen ini tersedia filter tambahan untuk
analisis litium, kalsium, dan barium.

Suhu nyala yang rendah (sekitar 1700°C dibandingkan dengan oksigen/asetilena

pada 3100°C) menghasilkan emisi yang kuat hanya dari unsur yang paling mudah
tereksitasi. Isolasi panjang gelombang dengan menggunakan filter interferensi
celah pita sempit sederhana dirancang hanya untuk mentransmisikan karakteristik
garis natrium-doublet yang intens pada sekitar 589,0 dan 589,6 nm. [Filter terpisah
harus digunakan untuk mentransmisikan dua garis kalium pada 766,5 dan 769,9
nm].

Detektornya adalah fotodioda p-i-n yang relatif murah dan kokoh. Perangkat solid-
state ini memiliki lapisan intrinsik (non-doped) yang berada di antara lapisan p dan
n-doped yang berada dalam dioda - asal dari sebutan p-i-n. Pengaturan ini membuat
detector mempunyai sensitivitas yang lebih besar dan kecepatan operasi lebih cepat
dari pada fotodioda standar. [http://www.rp-
photonics.com/p_i_n_photodiodes.html]

Instrumen ini disebut "single-channel" photometer karena hanya dapat menentukan

satu elemen pada satu waktu dan memiliki output direct-reading tunggal. Filter
harus diubah dan instrumen dikalibrasi ulang untuk elemen yang berbeda. Alat ini
menggunakan aspirator kapiler untuk menyuntikkan sampel ke dalam ruang
pencampuran yang mengandung butiran-butiran spray PTFE dan beberapa baffles
PTFE yang berfungsi untuk mencampurkan tetesan bahan bakar, oksidan, dan
sampel. Kombinasi ini menghasilkan tetesan-tetesan kecil uap sampel untuk masuk
ke pembakar; Sebagian besar sampel akan disedot mengalir. Konsumsi sampel
larutan adalah 2-6 mL / menit.

Instrument ini memiliki batas deteksi 0.2, 0.2, 0.25, 15, and 30 µg/mL untuk Na, K,
Li, Ca, and Ba. Reproduksibilitasnya dikatakan lebih baik dari 1% standar deviasi
relatif untuk 20 sampel berturut-turut menggunakan Na 10 ppm untuk membaca
50,0 pada meteran.

ALAT DAN BAHAN

Alat:
1. Botol penyemprot
2. Instrumen Flame Photomete.
3. Labu ukur 100 mL
4. Labu ukur 500 mL
5. Pipet volume
 6. Wadah kecil plastik

Bahan:

1. Air deionisasi
2. NaCl

Penyiapan Larutan

Larutan stok standar natrium 100 ppm

1. Timbang secara akurat 0,1271 g NaCl grade reagent

2. Masukan secara hati-hati ke dalam labu ukur 500 ml
3. Gunakan air deionisasi untuk membilas labu ukur secara perlahan
4. Tambahkan 100 ml air deionisasi ke dalam labu, kocok, dan larutkan semua
NaCl tersebut
5. Tambahkan air deionisasi hingga tanda batas
Larutan kalibrasi standar natrium

1. Gunakan air deionisasi sebagai blanko

2. Ambil 1, 2, 4, 8, dan 16 ml larutan natrium standar 100 ppm dan masukan ke
dalam 5 buah labu 100 ml
3. Tambahkan air deionisasi hingga tanda batas dan kocok perlahan

Larutan sampel

Sampel urin

Prosedur

Ikuti instruksi di bawah ini untuk penggunaan instrument dan mengukur intensitas
emisi untuk blanko (air deionisasi), standard, dan sampel.

1. Nyalakan flame pada instrument dan biarkan selama 15 menit agar nyala flame
stabil.
2. Pastikan semua alat yang akan digunakan dicuci terlebih dahulu. Pertama
dengan aquadest kemudian dengan air deionisasi.
3. Isi vial polietilen (25 ml) dengan blanko (air deionisasi), 5 larutan standar
natrium (1, 2, 4, 8, dan 16 ppm) dan larutan sampel, kemudian tempatkan vial-
vial tersebut secara berurutan dalam holder.
4. Alirkan air deionisasi hingga pembacaannya stabil. Proses ini memerlukan
waktu 30-90 detik. Gunakan tombol blank untuk mensetting meter reading
 menjadi 0.00. Kemudian, uji lrutan standar dengan konsentrasi tertinggi (16
ppm) hingga meter reading stabil. Gunakan tombol fine sensitivity untuk
mensetting meter reading menjadi 50. [saklar sensitivity harus berada dalam
setting yang benar dan tidak perlu di tukar-tukar].
5. Ulangi 2 tahapan prosedur kalibrasi tersebut dengan air deionisasi dan standar
5 ppm beberapa kali hingga keduanya stabil berturut-turut pada 0.00 dan 50.
6. Alirkan larutan blanko, 5 larutan standar, dan sampel. Lakukan pengukuran
sebanyak tiga kali untuk masing-masing larutan. Akan ada beberapa gangguan
dalam pembacaan terutama pada larutan konsentrasi tinggi.
7. Untuk kalibrasi kedua, tempatkan larutan sampel diantara dua standar yang
pembacaanya tidak diketahui, sehingga konsentrasi larutan yang dialirkan
meningkat. Instrument emisi atom akan bekerja dengan baik dari konsentrasi
rendah ke konsentrasi tinggi.
8. Ulangi seluruh proses kalibrasi dan lakukan pembacaan hingga tiga kali
pengulangan. Lakukan paling tidak 1 atau lebih dari dua kali. Semakin banyak
data yang diperoleh akan semakin baik untuk mengeliminasi eror dan inakurasi
data.
9. INSTRUMENT ALERT. Kompartemen aspirator terkadang tidak sesuai.
Hal-hal yang harus diperhatikan: alirkan beberapa larutan hingga pembacaan
di mulai, kemudian air deionisasi dialirkan, hingga pembacaan masih berjalan
dan muncul sinyal yang kuat untuk Na. Jika jendela kecil di cerobong nyala
terlihat warna kekuningan yang merupakan emisi dari Na, kompartemen
aspirator tersebut perlu di cuci.
10. Ketika percobaannya selesai, alirkan air deionisasi untuk membersihkan
aspirator kemudian maktikan instrument
11. Cuci dan bilas semua alat gelas dan plastic dengan air deionisasi
Pengolahan Data

1. Siapkan data kurva kalibrasi antara intensitas emisi sebagai fungsi dari
konsentrasi Na.
2. Tentukan konsentrasi Na pada sampel berdasarkan hasil kurva kalibrasi
3. Tergantung dari instrument dan factor lainnya, lebih baik untuk merata-ratakan
tiga data yang diperoleh untuk setiap larutan.
PUSTAKA

D. A. Skoog, D. M. West, F. J. Holler, and S. R. Crouch, Analytical Chemistry:

An Introduction, 7th ed., Chapter 23, pp. 594-631.

Revised March 8, 2007

Copyright© by The Department of Chemistry, University of Kentucky, 2007
 MODUL 3

Pengukuran Iodin dalam Urin Manusia dengan Microplate

Sederhana
(Sumber: Ohashi T, M. Yamaki, C. Pandav, M. Karmarkar, dan M. Irie. 2000. Simple Microplate
Method for Determination of Urinary Iodine. Clinical Chemistry 46:4 529–536)

Tujuan

Mampu menentukan I2 dalam urin dengan metode microplate

Prinsip

Reaksi Sandell-Kolthoff :

Alat dan Bahan

Alat
- Batang Pengaduk - Oven standar (ST-450
- Erlenmeyer drying oven)
- Filter Kaca - Pipet
- Freezer - Sealing cassette
- Ice bath - Spatel
- Karet silikon
- Karet Stainless Steel
- Labu ukur
- Microplates polypropylene
96-well
- Microplate reader
- Mikropipet
Bahan
- Asam Perklorat (700g/L)
- Asan Sulfat
- Arsen Trioksida
- Aquades
- Kalibrator Iodium
- Kalium Klorat 500 mg
- Kalium Iodida
- Larutan amonium persulfat
- Larutan amonium sulfat
- Larutan asam arsen
- Larutan asam klorat
- Natrium Klorida
- Tetrammonium cerium (IV) sulfat dihidrat

Larutan

1. Larutan asam klorat (3,3 mol/L). Kalium klorat (500 g) dilarutkan dalam 1000 mL air
dalam erlenmeyer 2000 mL dengan pemanasan selama 60 menit dalam water bath,
setelah sebanyak 375 mL asam perklorat ditambahkan secara perlahan. Larutan
kemudian disimpan pada suhu -25oC selama semalam. Suspensi difilter dengan mesh
5-10 µm. Filtrat disimpan di kulkas (4oC) hingga digunakan.
2. Larutan amonium persulfat (1,31 mol/L). Amonium persulfat (30 g) dilarutkan dalam
air hingga 100 mL. Larutan disiapkan segar sebelum digunakan.
3. Larutan asam arsenat 90,05 mol/L). Arsen trioksida (5 g) dilarutkan dalam 100 mL
larutan natrium hidroksida 0,875 mol/L. Asam sulfat pekat (16 mL) ditambahkan
perlahan, dan campuran diencerkan hingga 500 mL dengan air dingin dan disaring.
4. Larutan ceric amonium sulfat (0,019 mol/L). Tetraamonium cerium (IV) sulfat dihidrat
(6 g) dilarutkan dalam 1,75 mol/L asam sulfat dan ditambahkan dengan larutan asam
yang sama hingga 500 mL.
5. Kalibrator iodin. Dalam labu ukur 100 mL, sebanyak 168,6 mg kalium iodat dilarutkan
dalam air hingga terbentuk larutan stok 7,88 mmol/L (1000 mg/L iodin). Larutan
diencerkan 100 dan 10000 kali. Larutan kerja dengan konsentrasi 0,039 – 4,73 μmol/L
(5-600 μg/L iodin) disiapkan.
6. Larutan sampel urin disiapkan secara segar.
Prosedur

Kalibrator dan sampel dipipet ke dalam plate polipropilen, diikuti dengan penambahan 100 μL
larutan amonium persulfat (konsentrasi akhir 0,87 mol/L). Plate ditutup rapat dan disimpan
selama 60 menit suhu 110oC dalam oven. Setelah digesti, plate didinginkan kemudian sebanyak
50 μL alikuot hasil digesti dipindahkan ke dalam plate polistiren 96-well. Larutan asam arsenat
(100 μL) ditambahkan ke dalam well; 50 μL larutan ceric amonium sulfat ditambahkan secara
cepat (1 menit) menggunakan pipet multichannel. Reaksi dibiarkan berjalan selama 30 menit
pada suhu 25oC dan absorbansinya diukur pada 405 nm dengan microplate reader.

Evaluasi Pengukuran

Kurva kalibrasi dan perhitungan. Kurva kalibrasi disiapkan dengan memplotkan absorbansi
dari logaritma konsentrasi pada 405 nm pada sumbu y terhadap konsentrasi iodin [0.20, 0.39,
0.79, 1.57, 2.36, 3.15 µmol/L (25, 50, 100, 200, 300 and 400 µg/L iodin) pada sumbu x.
Konsentrasi iodin dihitung melalui persamaan garis linier. Air digunakan sebagai zero
kalibrator.

Batas deteksi. Batas deteksi didefinisikan sebagai 2 SD dari zero kalibrator (10 replikasi),
dikarakterisasi dari 5 analisis

Presisi. Spike sampel dengan konsentrasi iodin rendah, medium dan tinggi digunakan untuk
menghitung KV intra- dan interassay. Percobaan intraassay dilakukan dengan mengukur
sampel sebanyak delapan replikasi. Dengan percobaan yang sama, interassay diukur dalam 30
hari berbeda.

Perolehan kembali. Perolehan kembali dari iodin diperoleh dengan mengukur 12 sampel
berbeda yang dispike larutan kalium iodat sebanyak tiga replikasi, dan dibandingkan dengan
sampel yang dispike air. Larutan kalium iodat (3,94 μmol/L) dan air yang ditambahkan ke
sampel adalah 1/10 volume sampel. Persen perolehan kembali dihitung dengan rumus:

Perolehan kembali (%) =

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑖𝑜𝑑𝑖𝑛 𝑑𝑖 𝑢𝑟𝑖𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒 𝑘𝑎𝑙𝑖𝑢𝑚 𝑖𝑜𝑑𝑎𝑡−𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑖𝑜𝑑𝑖𝑛 𝑑𝑖 𝑢𝑟𝑖𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒 𝑎𝑖𝑟
x 100
𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑖𝑜𝑑𝑖𝑛 𝑑𝑖 𝑢𝑟𝑖𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑠𝑝𝑖𝑘𝑒 𝑘𝑎𝑙𝑖𝑢𝑚 𝑖𝑜𝑑𝑎𝑡 𝑥 0,1

Linieritas. Sampel yang dispike iodin pada konsentrasi rendah, medium, dan tinggi diencerkan
dengan air kemudian diukur sebanyak tiga replikasi.