WEEK-4 HPLC KARBOHIDRAT

SBW
 Analysis Karbohidrat by HPLC
• Food Karbohidrat: glukosa, galaktosa,
raffinosa, fruktosa, mannitol, sorbitol, laktosa,
maltosa, dan sukrosa dapat dianalisa secara
KROMATOGRAFI DENGAN HPLC
• Karena karbohidrat tidak memiliki sifat
kromofore atau fluoresence, maka bisa di
detektor RI atau refraktif indeksi dengan
detektor REFRAKTIF INDEX, sampai kadar
ppm atau ppb.
 Sampel cair
• Minuman ringan sesudah di saring dengan ultrafilter,
dapat langsung di injeksikan ke mesin HPLC
• Sampel padat memerlukan: tahap ekstraksi lemak (bila
sampel tinggi lemak) atau tahap deproteinase.
• Bila sampel padat normal: Preparasi sampel, hanya
penghancuran, TIMBANG TEPAT, LARUTKAN DALAM
ETANOL 80%, DIDIHKAN, DI SARING DGN KERTAS
SARING, RESIDU CUCI DGN ETANOL 80%, DIPEROLEH
100 ML CUPLIKAN/SAMPEL.
• AMBIL 10 ML SARING DENGAN FILTER ULTRA (0,45
um), sebelum injeksikan ke HPLC.
 Instrumentation
Gradient
Controller
•
Pump Column
Detector
Injector
Mobile Phases
KROMATOGRAM Gula Cair Coklat
(siwalan)
Larutan STD
A = sukrosa 9,97 menit
B = Glukosa 11,56 menit
C = Fruktosa 12,79 menit

Larutan Sampel Gula Cair

Coklat
A = Sukrosa 9,95 menit
B = Glukosa 11, 62 menit
C = Fruktosa 12, 81 menit
KONDISI MESIN HPLC (Suhardi, 1993)

Kolom : AMINEXHPX-87H, 300 mm x 7,8 mm resin ion eksklusi

Flow rate : 0,5 ml/menit
Detektor : RID (Reflective Index Detector) 156
Mobile Phase : Aquadest Dmin Bebas Ion
Konsentrasi Asam Sulfat (H2SO4) 0,01 N
Merk : Beckman
Suhu : Max 50C dengan tekanan pompa saat operasi 344 psi
Sistem Elusi : Isokratik
Waktu : 15 menit
 PREPARASI SAMPEL
• Sampel ditimbang sebanyak 5 gram dan dipindahkan ke dalam tabung sentrifus polietilen
sebanyak 50 ml
• Sampel bebas lemak ditambahkan 20 ml campuran etanol absolut:air (80:20), dan
dimasukkan ke dalam tabung sentrifus, kemudian dipanaskan dalam penangas air pada
suhu 80C selama 30 menit. Selain itu disentrifus dengan kecepatan minimum 2000 rpm
selama 10 menit
• Supernatan yang didapat ditambahkan larutan Pb-asetat 10% sebanyak 2 ml. Kemudian
disentrifus lagi dan dipisahkan supernatannya
• Endapan yang didapat ditambah 20 ml campuran etanol absolut:air (80:20) dikocok dan
disentrifus, supernatannya digabung dengan supernatan yang didapat sebelumnya
• Gabungan supernatan diuapkan dengan rotari evaporator sampai volume  10 ml.
Kelebihan Pb-asetat dihilangkan dengan menambahkan Na-oksalat 5% sampai tidak
terjadi endapan
• Larutan dimasukkan kedalam labu takar 25 ml lalu ditambahkan etanol absolut:air (80:20)
sampai tanda
• Setelah dikocok sampai homogen, kemudian disaring dengan millex
• Selanjutnya contoh siap diinjeksikan ke dalam HPLC
• Dibuat kurva standar gula: sukrosa, glukosa, fruktosa masing-masing 1000; 750 dan 500
ppm, volume injeksi 10 l
• Perhitungan kadar gula didasarkan pada interpolasi dari kurva standar dengan
menggunakan regresi linier
 ANALISA ASAM AMINO BY HPLC
• SAMPEL: DAGING
• PREPARASI SAMPEL: DAGING DI POTONG KECIL-2.
DIKERINGKAN SECARA FREEZE DRYING.
DIHALUSKAN DAN DI HIDROLISIS DGN 6N HCL @
110 0C selama 24 jam.
• Sampel direaksikan dgn reagent ccQ (6-
aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimdyl carbamite)
sebelum dipisahkan dalam kolom HPLC AccQ Tag
Reverse Phase (3,9 X 150 mm) kolom (Waters
USA).
 MESIN HPLC
• Waters 1525 Binary HPLC Pump, 717 Plus autosampler (Waters®)
and Waters 2475 Multi λ Fluorescence detector (wavelength
excitation 250nm, emission 395nm).
• Chromatographic peaks were integrated, identified and quantified
with Breeze TM software version 3.20 by comparing it to known
standards (Amino acid standard H, Pierce, Rockford, Illinois).
Methionine and cystine were determined from the same method of
acid hydrolysis after treatment with performic acid oxidation;
triptophan was not analyzed in this study
• Kondisi mesin HPLC unKnown (sumber: Boni Ikhlas*, Nurul Huda
and Noryati Ismail , 2010. Comparison of meat quality
characteristics of young and spent quail. As. J. Food Ag-Ind.
• 2010. 3(05), 498-504
KROMATOGRAM:
Table 3. Amino acid composition of young and spent quail meat (g/100 g
protein)
Ala 4.70 ± 0.42
Arg 10.76 ± 0.66
Asp 6.57 ± 1.09
Cys 0.25 ± 0.09
Glutamic 12.31 ± 1.36
Glysine 7.77 ±1.39
His 4.07 ±o.43
IsoLeu 5.37 ±0.14
Leu 7.44 ±1.22
Lys 7.12 ±1.27
Met 3.18 ±0.26
Phenylala 5.38 ± 0.64
Proline 4.14 ± 0.33
Serine 4.87 ± 0.31
Threo 6.02 ± 0.35
 Profil Asam Amino Metode HPLC
(AOAC, 1984)
• PREPARASI SAMPEL
• Sampel ditimbang sebanyak 0,15 g
1. Kemudian didestruksi dengan 10 ml HCl 6 N,
panaskan selama 24 jam pada suhu 100 oC.
2. Sampel disaring, diambil 30 µl sampel,
ditambahkan 30µl larutan pengering (methanol
+ Na asetat + triethylamine) dan 30µl larutan
derivatisasi (methanol + picoiotrocianat/ PITC +
triethilamine), biarkan selama 20 menit.
Tambahkan buffer Natrium asetat 1 ml.
3. Injek ke HPLC.
 PREPARASI SAMPEL
• Prinsip:
• Sampel dihidrolisis dalam kondisi asam (HCL), 30
menit dengan bantuan ultrasonic bath. Sampel
disentrifuse 3000 rpm, suhu rendah 4 oC. Ambil 5
ml filtrat, direaksikan dengan larutan asam
trikloroasetate. Cairan di vortek, ambil cairan
jernih untuk direaksikan dengan reagen AccQ. Tag
mengandung Fluor Borate buffer. Di Vortek, Ambil
larutan jernih, siap di injeksikan ke HPLC
 KONDISI MESIN HPLC
• Mesin HPLC tipe 2695 Waters
• Detektor Fluorescence, Waters, USA
• Kolom: AccQ.Tag amino acid column Nova-Pak
C18. Suhu kolom 37 oC, Jumlah sampel 10 uL
• Fase Mobil: eluent A, B dan C
• Detail : Czech. J. Food Sci. 2009. 27(3):143-
150.
Data keju di Czechna.
 LATIHAN SOAL
• Jelaskan prinsip analisa komposisi karbohidrat
secara HPLC (persiapan sampel, prinsip
pemisahan jenis karbohidrat dan cara
indentifikasi jenis karbohidrat, pertimbangan
kondisi pemisahan dengan mesin HPLC
• Bagaimana identifikasi secara prinsip analisa
asam amino pada sampel keju, jelaskan yang
bisa sdr ketahui?