Ayu Dwi Utami/Universitas Sebelas Maret

Pembimbing : Prof. Dr. Ir. Titiek Farianti Djaafar. M.P.

METODE PENELITIAN

A. Tahapan Penelitian
Diagram alir tahapan penelitian disajikan pada Gambar 1. Tahapan awal yang
dilakukan yaitu preparasi biji kakao untuk fermentasi. Buah kakao segar diperoleh dari
kelompok tani di Kecamatan Patuk Kabupaten Gunungkidul dan sekitarnya. Buah
kakao setelah dipanen, dilakukan pemeraman selama 2-3 hari. Pemecahan atau
pembelahan buah dilakukan dengan menggunakan pemukul kayu atau memukulkan
buah satu dengan lainnya agar tidak melukai atau merusak biji kakao. Biji kakao
dikeluarkan dari buahnya dan dipisahkan dari empulur yang melekat pada biji. Sortasi
biji kakao dilakukan dengan memisahkan biji kakao yang masak penuh dari biji yang
muda atau cacat karena serangan hama penyakit, jamur atau sudah bertunas. Biji kakao
yang sudah disortasi sebagai bahan baku proses fermentasi.
Proses pengurangan pulp pada biji kakao (depulping) dilakukan dengan
menggunakan mesin depulper. Biji kakao basah yang sudah disortasi dan diaduk supaya
merata, dimasukkan ke dalam hopper untuk dikurangi pulpnya. Hasil dari proses ini
diperoleh pulp dan biji kakao yang masih mengandung pulp (Sumanto et al., 2015;
Marwati et al., 2020) dengan kadar yang lebih rendah.
Setelah proses depulping, dilakukan penambahan bakteri asam laktat
L.plantarum HL-15. Proses fermentasi kakao menggunakan starter dilakukan mengacu
pada metode Marwati et al (2020) dan Rahayu et.al (2021). Biji kakao yang sudah
dicampur dengan kultur L.plantarum HL-15 dengan populasi 109 cfu/gram selanjutnya
difermentasi. Fermentasi biji kakao dilakukan dengan memasukan biji kakao ke dalam
kotak fermentasi berjenjang dengan kapasitas 40 kg, kemudian bagian atas diberi tutup
daun pisang dan karung goni. Fermentasi dilakukan selama 5 hari dengan pembalikan
setiap 2 hari sekali. Selama lima hari fermentasi biji kakao dilakukan analisis fisiko-
kimia setiap hari. Analisa fisiko-kimia meliputi suhu fermentasi dan suhu ruang
fermentasi, pH, kadar gula (glukosa, fruktosa, dan sukrosa), kadar asam organi (asam
sitrat, asam laktat, asam asetat), dan kadar etanol.
 Buah Kakao

Pemecahan

Penyortiran basah

Fermentasi

Analisa suhu fermentasi, pH, kadar

gula (glukosa, fruktosa, dan
Tanpa Depulping Depulping dan sukrosa), asam organik (asam sitrat,
dan Penambahan Penambahan asam laktat, asam asetat),kadar
bakteri asam laktat bakteri asam laktat etanol pada sampel hari ke-0,1,2,3,4
dan 5 fermentasi.

Gambar 1. Tahapan penelitian

B. Metode Analisis
Metode analisis yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada tabel berikut :
Tabel 1. Metode Analisis Penelitian
No Jenis Analisis Metode

1 Suhu
Termometer (Arinata, Yulianti, & Arda.,
a. Suhu fermentasi
2019)
b. Suhu ruang fermentasi

2. pH pH meter (AOAC., 2006)

3 Kadar gula Kromatografi menggunakan High

Performance Liquid Chromatography
a. Glukosa (HPLC) (Cempaka, Aliwarga, Purwo, &

b. Fruktosa Kresnowati, 2014; De Sa, De Oliveira,

Cammarota, Matos, & Ferreira-Leitao,

c. Sukrosa 2011; Pereira et al., 2012; Damayanti, S.,

Permana, B., & Weng, C. C., 2012).
 4. Kadar asam organik Kromatografi menggunakan High
Performance Liquid Chromatography
a. Asam sitrat (HPLC) (Cempaka, Aliwarga, Purwo, &

b. Asam laktat Kresnowati, 2014; De Sa, De Oliveira,

Cammarota, Matos, & Ferreira-Leitao,

c. Asam asetat 2011; Pereira et al., 2012; Violeta, N. O. U.

R., Trandafir, I., & Ionica, M. E., 2010).
Spektrofotometri UV-Vis (Cawan Conway)
5. Kadar etanol (Yuniawati, N., Sabikis, S., & Diniatik,
D.,2010)

C. Tahapan Metode Analisis

Analisa kadar etanol
a. Preparasi sampel biji kakao
Biji kakao fermnetasi basah ditimbang sebanyak 20 gr kemudian ditambahkan
aquades 40 ml. Kemudian Sampel dihancurkan menggunakan stomacher selama 5
menit. Setelah itu dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 4500 rpm, pada suhu
4°C selama 15 menit.
b. Prosedur analisa
1. Pembuatan pereaksi
1.1 Larutan dikromat asam
Ditimbang 0,74 g K2Cr2O7, dan dimasukkan dalam 30 ml akuades lalu ditambah
56 ml H2SO4 pekat secara perlahan lahan dan diaduk dengan magnetic stirer.
Kemudian diencerkan hingga 100 ml.
1.2 Larutan Natrium Karbonat
Ditimbang 10 g Na2CO3 kemudian dilarutkan dengan 50 ml akuades.
1.3 Larutan Standart
Dibuat larutan standar etanol konsentrasi 0,1; 0,2; 0,5; 0,7; 0,9 g/dL dengan cara
pipet etanol 70 % sebanyak 0.04 mL, 0.08 mL, 0.20 mL, 0.28 mL, 0.36 mL.
Kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 25 mL dan ditambahkan aquadest
sampai tanda batas.
2. Penentuan panjang gelombang maksimum
Dipipet larutan dikromat asam sebanyak 1 mL dimasukkan kedalam labu ukur
10 mL kemudian ditambahkan aquadest sampai tanda batas. Dibaca absorbansi
pada panjang gelombang 400-800 nm.
3. Penentuan operating time
Bagian tengah cawan Conway diisi 3 mL dikromat asam, pipetkan bersebelahan
pada bagian (lingkaran) luar cawan Conway 0,5 mL larutan standar (konsentrasi
0,5 g/dL) dan 1 mL Na2CO 3. Cawan ditutup dengan penutupnya yang telah
diberi silicon grease, kemudian dikeram pada suhu 90˚C selama 20 menit.Ambil
larutan dikromat, masukkan dalam labu takar 25 mL. Bilas tempat tadi dua kali
dengan aquabides dan masukkan hasil bilasan ke dalam labu, tambahkan
aquabides sampai 25 mL.Kemudian dibaca serapannya pada menit 5, 10, 15, 20
sampai 25, dibaca pada panjang gelombang maksimum sampai diperoleh
serapan yang stabil.
4. Pembuatan Kurva baku
Dibuat seri konsentrasi etanol baku yaitu
0,1; 0,2; 0,5; 0,7 dan 0,9 g/dL. Dipipet larutan dikromat asam sebanyak 3 mL
dan dimasukkan kebagian tengah cawan conway. Pada bagian luar lingkaran
cawan conwey dipipet masing-masing konsentrasi sebanyak 0,5 mL dan 1 mL
natrium karbonat. Cawan ditutup dengan penutupnya yang telah diberi vaseline,
kemudian dipanaskan pada suhu 90°C selama 20 menit. Diambil larutan
dikromat asam, masukkan kedalam labu ukur 25 mL dan dibilas bagian tengah
cawan conwey dua kali menggunakan aquadest. Kemudian tambahkan aquadest
sampai tanda batas. Dibaca absorbansi pada panjang gelombang maksimum.
Data serapan yang diperoleh kemudian digunakan untuk membuat kurva baku.
Dari data hasil serapan, selanjutnya dihitung persamaan Lambert-Beernya.
Diperoleh persamaan garis :
y = bx +a
5. Validasi penetapan kadar etanol secara Spektrofotometri UV-Vis
5.1 Ketelitian (precision)
Dipipet larutan dikromat asam sebanyak 3 mL dan dimasukkan kebagian tengah
cawan conway. Pada bagian luar lingkaran cawan conwey dipipet larutan
standar sebanyak 0,5 mL dari konsentrasi 0,5 g/dL dan 1 mL natrium karbonat.
Cawan ditutup dengan penutupnya yang telah diberi vaseline, kemudian
dipanaskan pada suhu 90°C selama 20 menit. Diambil larutan dikromat asam,
masukkan kedalam labu ukur 25 mL dan dibilas bagian tengah cawan conwey
dua kali menggunakan aquadest. Kemudian tambahkan aquadest sampai tanda
batas. Dibaca absorbansi pada panjang gelombang maksimum. Diulangi
sebanyak enam kali selama tiga hari.
5.2 Linearitas (linierity)
Dipipet larutan dikromat asam sebanyak 3 mL dan dimasukkan kebagian tengah
cawan conway. Pada bagian luar lingkaran cawan conwey dipipet larutan
standar dari konsentrasi 0,1; 0,2; 0,5; 0,7 dan 0,9 g/dL sebanyak 0,5 mL dan 1
mL natrium karbonat. Cawan ditutup dengan penutupnya yang telah diberi
vaseline, kemudian dipanaskan pada suhu 90°C selama 20 menit. Diambil
larutan dikromat asam, masukkan kedalam labu ukur 25 mL dan dibilas bagian
tengah cawan conwey dua kali menggunakan aquadest. Kemudian tambahkan
aquadest sampai tanda batas. Dibaca absorbansi pada panjang gelombang
maksimum.
5.3 Batas deteksi dan batas kuantitasi (LOD dan LOQ)
Batas deteksi dan batas kuan-titasi dengan metode Spektrofotometri UV-Vis
dapat dihitung secara statistik melalui garis linier dari kurva baku. Nilai
pengukuran akan sama dengan b pada persamaan garis linier y = a + bx,
sedangkan simpangan baku blanko sama dengan simpangan baku residual
(𝑆𝑦/x).
3𝑆𝑦
𝑥
Batas deteksi (LOD) : 𝑆𝐼
10𝑆𝑦
𝑥
Batas quantitasi (LOQ) : 𝑆𝐼

Keterangan :
Sy/x = simpangan baku respon analitik dari blanko
SI = arah garis linier (kepekaan arah kurva) dari kurva antara respon terhadap
konsentrasi = slope (b dari persamaan garis linier).
5.4 Ketepatan (accuracy)
Diambil sampel secara duplo. Pada salah satu pengukuran secara duplo
ditambahkan larutan baku etanol sebanyak 0,2 mL dengan konsentrasi 0,5 g/dL.
Dipipet larutan dikromat asam sebanyak 3 mL dan dimasukkan kebagian tengah
cawan conway. Pada bagian luar lingkaran cawan conwey dipipet larutan
 sampel sebanyak 0,5 mL dan 1 mL natrium karbonat. Cawan ditutup dengan
penutupnya yang telah diberi vaseline, kemudian dipanaskan pada suhu 90°C
selama 20 menit. Diambil larutan dikromat asam, masukkan kedalam labu ukur
10 mL dan dibilas bagian tengah cawan conwey dua kali menggunakan
aquadest. Kemudian dibaca absorbansi pada panjang gelombang maksimum.
Selanjutnya larutan sampel dimasukkan kebagian tengah cawan conway
sebanyak 3 mL dan pada bagian luar lingkaran cawan conway dipipet larutan
standar dengan konsentrasi 0.5 g/dL sebanyak 0.2 mL dan tambahkan 1 mL
natrium karbonat. Cawan ditutup dengan penutupnya yang telah diberi vaseline,
kemudian dipanaskan pada suhu 90°C selama 20 menit. Diambil larutan sampel,
masukkan kedalam labu ukur 10 mL dan dibilas bagian tengah cawan conwey
dua kali menggunakan aquadest. Kemudian dibaca absorbansi pada panjang
gelombang maksimum. Hasil serapan digunakan untuk menghitung harga
perolehan kembali (recovery).
6. Uji Kuantitatif Kadar Alkohol
Pada uji kuantitatif penentuan kadar etanol dilakukan dahulu penetapan
kadar blanko, standar dan sampel. Untuk penetapan kadar pada blanko dipipet
3 mL larutan dikromat asam kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 25 mL
dan ditambahkan aquadest sampai tanda batas, kemudian dibaca absorbansi
pada panjang gelomban maksimum.
Penetapan kadar pada larutan standar dipipet larutan dikromat asam
sebanyak 3 mL dan dimasukkan kebagian tengah cawan conway. Pada bagian
luar lingkaran cawan conwey dipipet larutan standar dengan konsentrasi 0,5
g/dL sebanyak 0,5 mL dan 1 mL natrium karbonat. Cawan ditutup dengan
penutupnya yang telah diberi vaseline, kemudian dipanaskan pada suhu 90°C
selama 20 menit. Diambil larutan dikromat asam, masukkan kedalam labu ukur
25 mL dan dibilas bagian tengah cawan conwey dua kali menggunakan
aquadest. Kemudian tambahkan aquadest sampai tanda batas. Dibaca absorbansi
pada panjang gelombang maksimum.
Untuk penetapan kadar pada sampel dilakukan secara triplo dipipet
larutan dikromat asam sebanyak 3 mL dan dimasukkan kebagian tengah cawan
conway pertama, kedua dan ketiga. Pada bagian luar lingkaran cawan conwey
pertama, kedua dan ketiga dipipet larutan sampel sebanyak 0,5 mL dan 1 mL
natrium karbonat. Cawan ditutup dengan penutupnya yang telah diberi vaseline,
kemudian dipanaskan pada suhu 90°C selama 20 menit. Diambil larutan
dikromat asam, masukkan kedalam labu ukur 10 mL dan dibilas bagian tengah
cawan conwey dua kali menggunakan aquadest. Kemudian dibaca absorbansi
pada panjang gelombang maksimum.
Rumus perhitungan kadar :
𝐴𝑏−𝐴𝑢
Cu = x 0,5gr/dl
𝐴𝑏−𝐴𝑠

Keterangan :
Ab = absorbansi blanko
Au = absorbansi uji
As = absorbansi standart