25

III. METODE PENELITIAN

3.1. Bahan dan Alat Beras merah yang digunakan dalam penelitian ini merupakan beras yang telah disosoh dan dikumpulkan dari beberapa daerah yaitu dari Nusa Tenggara Timur sebanyak 2 jenis (galur) yaitu pare laka dan are dota, jati luwih asal Bali, aek sibundong asal Balai Penelitian Padi Sukamandi, beras bandung asal Bandung, beras raja hitam dan ratu merah asal Tangerang, beras ujung kulon asal Ujung Kulon, beras halimun asal Gunung Halimun, beras sirampong dan jowo melik asal Yogyakarta. Rimpang kencur dan jahe didapatkan dari Unit Konservasi Budidaya Biofarmaka Pusat Studi Biofarmaka LPPM-IPB Cikabayan Bogor. Gula jawa didapatkan dari Desa Tegal Arum Kecamatan Sempu Banyuwangi Jawa Timur. Bahan tambahan pangan lain sebagai pelengkap minuman beras kencur didapatkan dari pasar swalayan terdekat. Minuman beras kencur sebagai pembanding merupakan minuman komersial 1 (tetrapack) dan komersi 2 (instan) yang didapatkan di swalayan terdekat dengan masa kadaluarsa lebih dari 10 bulan, sedangkan minuman komersial 3 (tradisional) merupakan minuman tradisional yang dibeli dari pasar tradisional. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis adalah radikal bebas stabil DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), metanol, etanol, HCl, larutan besi (II) klorida, larutan buffer sodium asetat, larutan buffer asam asetat, larutan buffer potassium klorida, akuades, asam askorbat, asam tanat, pereaksi Folin-Denis, potassium ferisianida dan ferric klorida. Alat-alat yang digunakan untuk mendapatkan ekstrak jahe dan kencur adalah blender. Baskom, pisau, talenan dan panci digunakan untuk

mempersiapkan bahan baku. Botol kaca, pipet tetes dan neraca analitik digunakan untuk membuat formulasi minuman. Alat-alat yang digunakan untuk analisis adalah oven, pH meter, refraktometer, chromameter, mikropipet, spektrofotometer UV-Vis dan peralatan gelas untuk analisis.

26

3.2. Metode Penelitian ini dibagi menjadi lima tahap, yaitu penelitian 1) karakteristik sifat fisikokimia beras merah, 2) ekstraksi dan analisis kandungan total fenol, total flavonoid, dan aktivitas antioksidan beras merah, 3) formulasi minuman beras kencur berbasis beras merah, 4) karakteristik minuman beras kencur formula terpilih, dan 5) pengamatan stabilitas minuman beras kencur formula terpilih. Diagram alir metodologi penelitian selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 17 dan 18 3.2.1. Karakteristik sifat fisiko kimia beras merah Karakteristik sifat fisikokimia beras merah terdiri dari dua analisis yaitu analisis warna untuk analisis fisik dan analisis proksimat untuk analisis kimia beras merah. Metode analisis warna dan proksimat sebagai berikut: 3.2.1.1. Analisis warna, Metode Hunter (Hutching, 1999) Analisa dilakukan dengan menggunakan alat Minolta Chroma Meters. Pada prinsipnya, Minolta Chroma Meters bekerja berdasarkan pengukuran perbedaan warna yang dihasilkan oleh permukaan sampel. Pengukuran dilakukan dengan meletakkan sampel di dalam wadah sampel berukuran seragam (misalnya cawan petri). Selanjutnya dilakukan pengukuran nilai L, a, dan nilai b terhadap sampel. Nilai L menyatakan parameter kecerahan (lightness) yang mempunyai nilai dari 0 (hitam) sampai 100 (putih). Nilai a menyatakan cahaya pantul yang menghasilkan warna kromatik campuran merah-hijau dengan nilai +a (positif) dari 0100 untuk warna merah dan nilai a (negatif) dari 0(-80) untuk warna hijau. Nilai b menyatakan warna kromatik campuran biru-kuning dengan nilai +b (positif) dari 070 untuk kuning dan nilai b (negatif) dari 0(-70) untuk warna biru. Selanjutnya dihitung Hue dari nilai a dan b yang diperoleh dengan persamaan Hue = arc tan (b/a) (Tabel 3). 3.2.1.2. Analisis proksimat (AOAC 1995) Kadar air (%) diukur dengan metode oven. Kadar protein (%) diukur dengan metode mikro-kjeldahl. Kadar lemak diukur dengan metode ekstraksi soxhlet; kadar abu/mineral (%) dengan tanur; total karbohidrat (%) dengan metode By Difference.

27

Tabel 1 Deskripsi warna berdasarkan Hue Hue [arc tan (b/a)] 18 54 54 90 90 126 126 162 162 198 198 234 234 270 270 306 306 342 342 18

Deskripsi warna Red (R) Yellow Red (YR) Yellow (Y) Yellow Green (YG) Green (G) Blue Green (BG) Blue (B) Blue Purple (BP) Purple (P) Red Purple (RP)

3.2.2. Ekstraksi, Analisis Senyawa dan Aktivitas Antioksidan Beras Merah Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan pelarut terbaik dalam mengekstraksi beras merah, mengetahui kandungan kelompok senyawa polifenol dan flavonoid, dan mengetahui aktivitas antioksidan beras merah. Hasil penelitian ini akan didapatkan pelarut terbaik dan beras merah terbaik yang akan digunakan dalam formulasi minuman beras kencur berbasis beras merah. Metode analisis yang digunakan pada tahap penelitian ini sebagai berikut: 3.2.2.1 Ekstraksi (Chotimarkron et al, 2008). Sebanyak 5 g tepung beras diekstrak 5 kali masing-masing dengan 10 mL metanol, etanol dan air selama 30 menit dengan shaker. Supernatan dievaporasi dalam kondisi vakum pada suhu 40oC hingga kering. Ekstrak kering ini kemudian dilarutkan dengan methanol untuk selanjutnya dianalisis. 3.2.2.2 Uji Kuantitatif Polifenol ( Shahidi dan Naczk, 1995). Sebanyak 1 ml sampel (diencerkan 2-4x dengan akuades) ditambahkan kedalam pereaksi Follin-Ciocalteau sebanyak 1 mL dan diinkubasi pada ruang gelap suhu kamar selama 5 menit. Kemudian ditambahkan 0,25 mL Na2CO3 (60g/L) dan 1.75 mL akuades. Setelah dilakukan inkubasi pada ruangan gelap suhu kamar selama 30 menit dilakukan pembacaan absorbasi dengan spektrofotometer pada 760 nm. Hasil pengukuran total fenol

28

dihitung berdasarkan kesetaraan dengan asam tanat yang dinyatakan dalam mg per gram EAT (ekivalen asam tanat) 3.2.2.3. Uji Kuantitatif Flavonoid (Shen et al, 2009 ): Sebanyak 0.5 ml ekstrak atau larutan standar dipipet kedalam tabung reaksi 15 ml, 2 ml air bidestilasi ditambahkan kedalam tabung reaksi dan dicampur dengan 0.15 ml 5% NaNO2. Setelah 5 menit ditambahkan 0.15% AlCl3.6H20 lalu didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit ditambahkan NaOH 1 M sebanyak 1 ml dan didiamkan selama 15 menit. Kemudian diukur pada panjang gelombang 415 nm. Total flavonoid dihitung berdasarkan kesetaraan dengan standar kuercetin yang dinyatakan dalam mg per gram EK (ekivalen kuercetin). 3.2.2.4. Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH (Nikolova dan Dzhurmanski, 2009). Sebanyak 3 ml ekstrak dengan konsentrasi 1000, 600, 300, 100, dan 50 g/mL ditambah dengan 1 mL larutan DPPH (2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl) 0.3mM dalam methanol dan dilakukan pengocokan dengan menggunakan vortex. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit. Absorbansi sampel dibaca pada panjang gelombang 517 nm. Persen inhibisi dihitung berdasarkan persamaan ((Ablanko- Asampel)/Ablanko)x100%. Nilai IC50 dihitung berdasarkan persamaan regresi sigmoid non-linier menggunakan hasil persen inhibisi dan konsentrasi. IC50 menunjukkan nilai konsentrasi sampel yang diperlukan untuk menghambat 50% radikal bebas DPPH 3.2.2.5 Uji aktivitas antioksidan metode FRAP (Benzie dan Strain, 1996). FRAP (ferric reducing ability of plasma) reagen dibuat dengan mencampurkan 0.1 mol/L buffer asetat (pH 3,6), 10 mMol/L TPTZ, dan 20 mmol/L besi klorida (10:1:1 v:v:v). 4,5 ml reagen, 450 l air dan 150 l sampel dicampurkan kedalam tabung reaksi dan diinkubasi 37 C selama 30 menit, sedangkan blank sampel digunakan 4,5 ml reagen dan 600 l air. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 593 nm.

29

Aktivitas antioksidan metode FRAP dihitung berdasarkan kesetaraan dengan standar FeCl3 yang dinyatakan dengan mol Fe(II) per gram.

3.2.3. Formulasi minuman beras kencur berbasis beras merah Formulasi awal untuk megetahui berapa banyak total bahan penyusun minuman beras kencur berbasis beras merah yang dapat ditambahkan kedalam minuman sehingga tidak menimbulkan kendala pada citarasa. Prinsip dasar pembuatan minuman yang dilakuan adalah mencampur bahan baku dan bahan tambahan minuman kedalam blender berdasarkan bobot per volume (b/v). Basis minuman dibuat dengan total volume 1000 ml untuk mempermudah formulasi. Optimasi formula minuman dilakukan dengan metode Mixture Experiment, menggunakan bantuan piranti lunak Design Expert 7.0. Proporsi relatif beras merah, kencur dan jahe dimasukkan sebagai data masukan. Selanjutnya ditentukan pula proporsi relatif minimum masing-masing rempah (lower limit) dan proporsi relatif maksimum masing-masing rempah (upper limit) sebagai data masukan sebelum didapatkan model rancangan percobaan. Hasil keluaran berupa model rancangan percobaan selanjutnya dilakukan pembuatan minuman untuk mengukur respon masing-masing model rancangan percobaan tersebut. Dalam pembuatan minuman ditambahkan gula jawa dan asam jawa dengan jumlah tetap. Variabel respon minuman diukur berdasarkan hasil uji aktivitas antioksidan minuman (metode penangkapan senyawa radikal bebas) dan hasil uji organoleptik minuman (metode hedonik dengan parameter citarasa dan warna). Variabel respon tersebut digunakan sebagai parameter untuk menetapkan nilai target optimasi formulasi minuman. Selanjutnya variabel respon yang didapat dari masing-masing model dimasukkan kembali ke dalam piranti lunak Design Expert 7.0 sebagai data masukan untuk mendapatkan formula minuman yang optimal berdasarkan nilai target yang sudah ditetapkan. Setelah itu dilakukan kembali pembuatan minuman dengan formula optimal. Metode yang digunakan pada tahap ini adalah pembuatan minuman beras kencur, pengujian aktivitas antioksidan minuman beras kencur dan pengujian organoleptik skala hedonik.

30

3.2.3.1. Pembuatan minuman beras kencur (Saidi Z , 1985). Beras digiling sampai halus dan disangrai menggunakan api kecil. Beras dan bahan segar serta bahan tambahan lain dihomogenkan didalam waring blender hingga hancur dan tercampur rata. Setelah tercampur, kemudian disaring dengan kain bersih 4 lapis dan diperas hingga air habis, dimasukkan kedalam kemasan pounc yang terbuat dari alumunium dilapis plastik dan dilakukan pasteurisasi. Minuman beras kencur siap dihidangkan. 3.2.3.2 Pengukuran aktivitas antioksidan minuman Metode DPPH (Kubo et al., 2002; Molyneux, 2004). Sebanyak 2 ml larutan buffer asetat (pH 5,5) ditambah dengan 3.75 metanol, 200 l larutan DPPH 3mM dalam metanol dan dilakukan pengocokan dengan menggunakan vortex. Kemudian ditambahkan 50 l larutan sampel atau larutan standar antioksidan dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit. Absorbansi sampel dibaca pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas antioksidan dihitung berdasarkan kesetaraannya dengan aktivitas antioksidan asam askorbat yang dinyatakan dalam ppm AEAC (Ascorbic acid Equivalent Antioxidant Capacity). 3.2.3.3 Uji Organoleptik metode skala hedonik (Meilgaard et al., 1999) Uji organoleptik dilakukan dengan skala kesukaan atau hedonik terhadap formula minuman yang telah dibuat. Sebanyak lima puluh panelis diminta mencicipi sampel dan diantara masing-masing pencicipan sampel

diharuskan mengkonsumsi air minum sebagai penetral, kemudian panelis diminta untuk memberikan penilaian tingkat kesukaannya terhadap warna dan citarasa (aroma dan rasa) sampel dengan menggunakan 5 tingkat skala hedonik [dimulai dari sangat tidak suka (=1) sampai sangat suka (=5)]. Formulir lembar uji kesukaan panelis terhadap citarasa dan warna model minuman dapat dilihat pada lampiran 21.

3.2.4. Karakteristik minuman beras kencur formula terpilih Penelitian ini bertujuan membandingkan karakteristik minuman beras kencur berbasis beras merah formula terpilih dengan minuman beras kencur komersial dilihat dari aktivitas antioksidan dan aspek sensori atribut warna,

31

aroma, rasa, dan after taste. Metode yang digunakan pada tahap ini adalah pembuatan minuman beras kencur, pengujian aktivitas antioksidan minuman beras kencur dan pengujian organoleptik skala hedonik seperti yang telah dijelaskan pada penelitian sebelumnya.

3.2.5 Pengamatan kestabilan minuman formula terpilih Pengamatan kestabilan minuman formula terpilih dilakukan selama 15 hari penyimpanan. Metode yang digunakan adalah analisis total mikroba (total plate count), analisis sensori individu, analisis pH, dan analisis aktivitas antioksidan. analisis antioksidan pada minuman menggunakan metode yang telah dijelaskan diatas, sedangkan metode yang lain sebagai berikut: 3.2.5.1 Total Mikroba (Total Plate Count) (Maturin dan Peeler, 2001) Sebanyak satu ml sampel diambil dan dimasukkan ke dalam 9 ml larutan pengencer. Selanjutnya dilakukan pengocokan hingga homogen dengan vorteks. Pengenceran dan pemupukan dilakukan hingga tingkat pengenceran 10-2. Dari tiap-tiap pengenceran, dipipet secara aseptis 1 ml untuk dimasukkan ke dalam cawan petri steril (pemupukan) secara duplo dan ditambahkan media PCA (Plate Count Agar) steril sebanyak 15-20 ml. Segera setelah penuangan, cawan petri digerakkan di atas meja secara hati-hati untuk menyebarkan sel-sel mikroba secara merata, yaitu dengan gerakan melingkar atau angka delapan. Setelah medium membeku, cawan petri diinkubasikan dengan posisi terbalik pada inkubator suhu 37C selama 2 hari (48 jam). Perhitungan jumlah total mikroba dilakukan dengan menggunakan Standard Plate Count (SPC) metode Harrigan. 3.2.5.2. Nilai pH (AOAC, 2005) Sebanyak 30-50 ml sampel langsung diukur nilai pH-nya dengan menggunakan pH meter. Sebelum digunakan, pH meter harus dikalibrasi terlebih dahulu dengan larutan buffer pH 4.0 dan pH 7.0. 3.3 Analisis Data Data kuantitatif yang diperoleh merupakan hasil rata-rata dari tiga ulangan. Untuk melihat perbedaan kemampuan antioksidan, kandungan flavonoid, komposisi kimia dan warna maka akan diuji nilai tengahnya secara statistik

32

(ANOVA) dengan rancangan percobaan acak lengkap menggunakan program SPSS pada taraf =0.05 dan dilakukan uji lanjut menggunakan uji beda nyata terkecil pada taraf =0.05. Rancangan percobaan formulasi minuman instan digunakan program statistik Design Expert 7.0 dengan tipe studi mixture, mode D-optimal dan model desain quadratic pada taraf =0.05.