LAPORAN PRAKTIKUM

PENGEMBANGAN METODE ANALISIS

VALIDASI METODE ANALISIS FLAVONOID EKSTRAK ETANOL
DAUN BINAHONG SECARA KOLORIMETRI

Disusun Oleh :
KELOMPOK 2
Regi Yustini 191FF03105 (Pembahasan)
Devita Saukina 191FF03107 (Kesimpulan+Nyatuin)
Iksan Nasyrulloh 191FF03115 (Judul+Tujuan+Prinsip)
Hanny Citranur 191FF03121 (Dasar Teori)
Liling Dwi Ambaga 191FF03138 (Pembahasan)
Al – Fira Putriyanti 191FF03141 (Hasil Pengamatan)
Fariz Miftah Hidayat 191FF03142 (Kesimpulan+Nyatuin)
Hilma Maulani 191FF03150 (Hasil Pengamatan)
Ryan Sofyan 191FF03153 (Pembahasan)
Dwi Indri 191FF03154 (Prosedur)

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS BHAKTI KENCANA BANDUNG
2022
Jl. Soekarno-Hatta No.754, Cipadung Kidul, Kec. Panyileukan, Kota Bandung, Jawa Barat
40614
 VALIDASI METODE ANALISIS FLAVONOID EKSTRAK ETANOL DAUN
BINAHONG SECARA KOLORIMETRI

I. Tujuan
Kompetensi yang dicapai :
Mahasiswa mampu melakukan dan memahami validasi metode analisis
senyawa dalam bahan alam meliputi metode pemeriksaan, parameter
pemeriksaan,penetapan kadar pengolahan data serta penarikan kesimpulan.
Tujuan Praktikum :
1. Melakukan validasi metode analisis penetapan kadar flavonoid pada ekstrak
etanol daun binahong
2. Menentukan kadar flavonoid pada ekstrak etanol daun binahong

II. Prinsip
Validasi metode analisis kadar flavonoid dilakukan dengan spektrofotometri UV-
Vis menggunakan metode Chang dengan larutan standar kuersetin. Alumunium
klorida 10 % dan natrium asetat 1 M sebagai pereaksi yang diukur pada panjang
gelombang 424 nm. Parameter validasi meliputi linearitas, akurasi, presisi, batas
deteksi dan batas kuantitasi.

III. Dasar Teori

a. Metode
Pengembangan penetapan kadar flavonoid telah dilakukan dengan menggunakan
spektrofotometri UV-Vis (kolorimetri), akan tetapi selama ini belum pernah
dilaporkan penelitian mengenai validasi metode analisis kadar flavonoid dengan
menggunakan spektrofotometri UVVis (kolorimetri), untuk ekstrak binahong. Metode
ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Pelarut yang digunakan adalah etanol
70%. Etanol digunakan karena dapat mengekstrak senyawa aktif lebih banyak
dibanding pelarut organik lainnya. (Sudarmadji dkk, 2003).
b. Validasi Metode Analis
Penetapan kadar senyawa aktif sebagai salah satu bentuk pengukuran analitik
yang pada prinsipnya bertujuan untuk mencari nilai sebenarnya. Nilai sebenarnya
dapat diperoleh dengan baik jika menggunakan instrumen yang telah terkalibrasi dan
memenuhi parameter parameter validasi. Validasi metode analisis merupakan suatu
tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium,
untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk
penggunaannya (Harmita, 2006). Apabila metode tersebut dapat dipertanggung
jawabkan secara keseluruhan (presisi, akurasi, selektivitas, batas deteksi, batas
kuantitasi, stabilitas dan lain lain), tidak menyimpang dan diakui, maka metode ini
dianggap valid dan dapat digunakan untuk analisis rutin (Hidayat, 1999).
c. Analit yang dianalisis
Tanaman binahong merupakan tanaman obat yang mengandung metabolik
sekunder berupa flavonoid, alkaloid, dan saponin. Hasil uji fitokimia ekstrak etil
asetat daun binahong ditemukan senyawa polifenol, alkaloid, dan flavonoid (Mufid,
2010). Rachmawati (2007), telah melakukan skrining fitokimia daun Binahong
(Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) menggunakan pelarut n-heksana dan metanol
diperoleh kandungan kimia berupa saponin, triterpenoid, flavonoid dan minyak atsiri.
Menurut Sukandar dkk (2011), kandungan senyawa dalam daun binahong berupa
senyawa flavonoid, alkaloid, terpenoid dan saponin serta dalam rimpangnya
terkandung senyawa ancordin. Berdasarkan penelitian, senyawa metabolit sekunder
yang terdapat pada daub binahong antara lain steroid, terpenoid, alkaloid, flavonoid,
saponin, polifenol dan tanin (Mustikasari dkk, 2012).
Anasta dkk (2013) telah melakukan skrining fitokimia metabolit sekunder pada
daun Binahong untuk uji In Vitro daya hambat pertumbuhan bakteri Aeromonas
hydrophila dan hasilnya positif bahwa daun binahong dapat menghambat
pertumbuhan bakteri A. hydrophila penyebab penyakit Motile Aeromonads
Septicaemia (MAS) secara In Vitro.
Makalunsenge dkk (2014) melakukan uji aktivitas antibakteri ekstrak daun
binahong terhadap Staphylococcus aureus dan dapat disimpulkan bahwa ekstrak
metanol dan fraksi n-heksan mampu menghambat pertumbuhan bakteri
staphylococcus aureus. Hasil uji lain yang dilakukan oleh Dersana dkk (2012)
menyebutkan bahwa perasan daun binahong memiliki aktivitas antibakteri terhadap
Escherichia coli secara In Vitro.
Ariani dkk (2013) dalam penelitiannya yang berjudul khasiat daun binahong
terhadap pembentukan jaringan granulasi dan reepitalisasi penyembuhan luka terbuka
kulit kelinci menyimpulkan bahwa pembentukan granulasi lebih banyak dan
reepitalisasi terjadi lebih cepat pada luka kelici yang diberi daun binahong, sehingga
membuat luka lebih cepat sembuh.
Sukandar dkk (2011) melakukan uji efek ekstrak metanol daun binahong terhadap
gula darah pada mencit model diabetes militus dan menyimpulkan bahwa pada dosis
50, 100, dan 200 mg/kg ekstrak metanol daun binahong dapat menurunkan glukosa
darah.
IV. Prosedur
1. Pembuatan serbuk simplisia Daun Binahong

Daun binahong yang telah dikumpulkan lalu dicuci dengan air mengalir sampai bersih

Lalu tiriskan untuk menghilangkan air sisa-sisa pencucian dan kemudian ditimbang

keringkan di dalam oven pada suhu 500ºC sampai dengan kadar air tidak lebih dari
10%, lalu dibersihkan kembali dari kotoran yang mungkin tidak hilang saat sortasi
kering

selanjutnya digrinder hingga menjadi simplisia serbuk lalu diayak dengan ayakan mesh
20 lalu ditimbang untuk mendapatkan bobot akhir simplisia

Disimpan dalam wadah yang kering dan bersih

2. Pembuatan Ekstrak Daun Binahong

Daun binahong 50 g dimaserasi dengan pelarut etanol 70% sebanyak 250 ml selama 24
jam

Saring sehingga diperoleh filtrat dan ampas

Kembali dilakukan maserasi terhadap ampas dengan 150 ml dan 100 ml etanol selama
24 jam, kemudian filtrat hasil maserasi digabungkan dan dimasukkan ke dalam labu ukur
500 ml

Encerkan sampai batas dengan etanol. Filtrat didiamkan selama 24 jam dan dituangkan.

3. Uji Liniaritas

Dibuat deret standar kuersetin 2,4,6,8, dan 10 ppm dari larutan standar kuersetin (100
ppm) sebanyak 1,2,3,4 dan 5 ml ke dalam labu ukur 50 ml.

Pada masing-masing labu ukur ditambahkan 15 mL etanol 95%, 1 mL AlCl 3 10%, 1 mL

Na asetat 1 M dan air suling sampai tanda batas.

Dikocok homogen lalu dibiarkan selama waktu optimum, diukur absorbannya pada
panjang gelombang maksimum.

Setelah pengukuran absorban dibuat kurva antara konsentrasi larutan standar kuersetin
dengan nilai absorban yang diperoleh dan dihasilkan persamaan regresi linier.
4. Uji Sensitifitas (BD & BK)
Dibuat larutan standar kuersetin yang mengacu pada kurva kalibrasi, dari standar
kuersetin dihitung konsentrasi dan dihitung standar deviasi.

5. Uji Selektivitas (Akusisi&Presisi)

Perlakuan 1
Dibuat larutan standar kuersetin 2, 6, dan 10 ppm dengan jumlah 7 labu ukur untuk masing
– masing konsentrasi

Diambil sebanyak 1, 3, dan 5 mL larutan standar kuersetin 100 ppm kedalam labu ukur 50
mL

Ditambahkan 15 mL etanol 95%, 1 ml AlCl3 10%, 1 mL Na Asetat 1 M dan air suling sampai
tanda batas

Dikocok homogen lalu dibiarkan selama waktu optimum

Diukur absorban pada panjang gelombang maksimum

Perlakuan 2
Dibuat larutan standar kuersetin 2, 6, dan 10 ppm dengan jumlah 7 labu ukur untuk
masing – masing konsentrasi

Diambil sebanyak 1, 3, dan 5 mL larutan standar kuersetin 100 ppm kedalam labu
ukur 50 mL

Ditambahkan 1 mL sampel ekstrak cair daun binahong, 15 mL etanol 95%, 1 mL

AlCl3 10%, 1 mL Na Asetat 1 M dan air suling sampai tanda batas

Dikocok homogen lalu dibiarkan selama waktu optimum

Diukur absorban pada panjang gelombang maksimum dan dilakukan 7 kali analisis
 6. Penetapan Kadar

Dipipet 1 ml sampel (filtrat hasil maserasi) masukan ke dalam labu ukur 50 ml,

Ditambahkan pereaksi yang terdiri dari 15 mL etanol 95 %, 1 mL AlCl3 10 %, 1 mL

Na Asetat, dan air suling sampai tanda batas.

Dikocok homogen lalu dibiarkan selama waktu optimum, diukur absorbannya pada
panjang gelombang maksimum.

Absorban yang dihasilkan dimasukkan ke dalam persamaan regresi dari kurva

standar kuersetin

V. Data Pengamatan
1. Linieritas

Grafik Uji Linearitas

0,7
0,6 y = 0,025x - 0,0119
Waktu
No Absorbansi (a)
R² = 0,999 (Menit)
0,5
absorbansi

Absorbansi 1 5 0,112
0,4
(a) 2 10 0,245
0,3
3 15 0,353
0,2 Linear
(Absorbansi 4 20 0,49
0,1
(a)) 5 25 0,614
0
0 10 20 30
waktu

Uji Linearitas
y = bx+a
y = 0,025x - 0,0119
b= 0,025
a= 0,0119
r² = 0,999
r= 0,999499875
(memenuhi syarat, yaitu >0,99)
 2. Uji Selektivitas
Uji Selektifitas
Sy/x 0,008749286
BD 1,049914282
BK 3,499714274
SX0 0,349971427
VX0 0,145821428
memenuhi syarat, karena vx0
<2,0%

3. Uji Presisi

Absorbansi (y) Konsentrasi (x)

0,78 31,676
0,776 31,516
0,767 31,156
0,753 30,596
0,729 29,636
Rata-Rata 30,916
SD 0,827042925
RSD(%) 2,675129141
memenuhi syarat, yaitu <5%

4. Uji Akurasi

Uji Akurasi
Absorbansi (Y)
Pengulangan % Recovery
Sampel Spike
1 0,73 0,78 100
2 0,72501 0,776 101,98
3 0,71601 0,767 101,98
1 0,60243 0,753 100,38
2 0,57873 0,729 100,18
3 0,6257 0,776 100,2
1 0,529 0,78 100,4
2 0,5162 0,767 100,32
3 0,5015 0,753 100,6
 5. Penetapan Kadar
Penetapan Kadar
Konsentrasi Rata-Rata
Sampel Abs
(mcg/ml) Kadar
0,713 1,189
1 0,72501 1,20101 59,685
0,71601 1,19201
0,60243 1,07843
2 0,6087 1,0847 54,41266667
0,6257 1,1017
0,629 1,105
3 0,6162 1,0922 54,578
0,6015 1,0775
Rata –Rata Kadar 56,22522222

VI. Pembahasan
Pada perhitungan linearitas nilai absorbansi yang diperoleh terhadap setiap
konsenterasi analit digunakan untuk menentukan regresi linier. Hubungan antara
waktu dan absorbansi dapat dilihat pada gambar regreli linear dihasilkan persamaan
yaitu y = 11.738x + 22295 dengan koefisien korelasi R² = 0,999. dari hasil yang
diperoleh daripersamaan y: 0,025x-0,0119 dengan koefisien kolerasi R2 : 0999,
Kemudian yaitu melakukan validasi metode sensitifitas yaitu mencari nilai batas
deteksi (BD) atau Limit of Detection (LoD) dan batas kuantitasi (BK) atau Limit of
Quantitation (LoQ). Jadi batas kuantitasi merupakan konsentrasi atau jumlah yang
rendah dari analit yang masih dapat ditentukan dan memenuhi kriteria akurasi dan
presisi. Berdasarkan hasil pengamatan yaitu didapatkan nilai BD 1,04991/mL dan
nilai BK yaitu 3,4997µg/mL dengan v0 yaitu 0,145%. Jadi dari hasil tersebut dapat
disimpulkan memenuhi syarat karena kurang dari 2%.
Selanjutnya dilakukan perhitungan presisi dan akurasi pada ekstrak cair daun
binahong. Ketelitian (presisi) adalah kesesuaian diantara beberapa data pengukuran
yang sama yang dilakukan secara berulang. Tinggi rendahnya tingkat ketelitian hasil
suatu pengukuran dapat dilihat dari harga deviasi hasil pengukuran (Adam
Wiryawan) dan ketepatan (akurasi) adalah kesamaan atau kedekatan suatu hasil
pengukuran dengan angka atau data yang sebenarnya (true value / correct result)
(Adam Wiryawan,2011). Uji akurasi dan presisi dilakukan dengan dua perlakuan.
Perlakuan pertama yaitu Uji akurasi dan presisi dilakukan dengan membuat larutan
standar kuersetin 2, 6, dan 10 ppm, masing - masing larutan tersebut dibuat sebanyak
7 labu ukur. Sebanyak 1, 3, dan 5 mL larutan standar kuersetin 100 ppm kedalam labu
ukur 50mL. Selanjutnya pada masing-masing labu ukur ditambahkan 15 mL etanol 95
%, 1 mL AlCl3 10%, 1 mL na asetat 1 M dan air suling sampai tanda batas. Dikocok
homogen lalu dibiarkan selama waktu optimum, diukur absorbannya pada panjang
gelombang maksimum. Perlakuan kedua yaitu Uji akurasi dan presisi dilakukan
 dengan membuat larutan standar kuersetin 2, 6, dan 10 ppm, masing - masing larutan
tersebut dibuat sebanyak 7 labu ukur. Sebanyak 1, 3, dan 5 mL larutan standar
kuersetin 100 ppm kedalam labu ukur 50 mL. Selanjutnya pada masing-masing labu
ukur ditambahkan 1 mL sampel ekstrak cair daun binahong, 15 mL etanol 95 %, 1
mL AlCl3 10 %, 1 mL Na asetat 1 M dan air suling sampai tanda batas. Dikocok
homogen lalu dibiarkan selama waktu optimum, diukur absorbannya pada panjang
gelombang maksimum dan dilakukan 7 kali analisis.
Berdasarkan hasil yang diperoleh setelah dihitung absorbansinya nilai presisi
dengan rata – rata yaitu sebesar 30,916, nilai SD yaitu 0,827042925 dan nilai RSD
(%) yaitu 2,675129141. Nilai presisi yang diperoleh dapat dikatakan memenuhi syarat
karena nilai RSD (%) yang diperoleh yaitu <5%. Dan nilai akurasi diperoleh hasil
rentang recovery pada jurnal dengan konsentrasi 2 ppm perhitungan yang diperoleh
yaitu 101,98%, konsentrasi 6 ppm perhitungan yang diperoleh yaitu 100,18% dan
pada konsentrasi 10 ppm perhitungan yang diperoleh yaitu 100,32%. Sedangkan
dalam jurnal yang diperoleh berbeda yaitu pada jurnal 2 ppm yaitu 101,190%, 6 ppm
yaitu 100,655% dan 10 ppm yaitu 100,778%. Maka dapat dikatakan recovery telah
memenuhi persyaratan persen recovery yaitu sebesar 98 – 102%, sehingga metode uji
yang digunakan valid.
Penetapan kadar flavonoid dilakukan terhadap ekstrak cair daun binahong yang
direaksikan dengan alumunium klorida dan terbentuk perubahan warna menjadi
kuning. Penetapan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan larutan kuersetin
sebagai kontrol atau pembanding yang direaksikan dengan alumunium klorida 10%
dan Natrium asetat 1M yang akan membentuk warna kuning dari hasil reaksi tersebut
(Markham, 1988).
Berdasarkan hasil penetapan kadar flavonoid bahwa kadar flavonoid harus
dihitung dengan memasukkan nilai absorban tersebut ke dalam persamaan linier y =
0,025x - 0,0119. Sehingga diperoleh % kadar flavonoid sebesar 56,225%.

VII. Kesimpulan
1. Validasi Metode Analisis
 Linearitas pada konsentrasi 2-10 ppm dengan koefisien korelasi (r2)
sebesar 0,999
 Batas Deteksi (LOD) sebesar 1,0499 dan Batas Kuantitasi (LOQ) sebesar
3,4997.
 Nilai akurasi yang diperoleh dengan konsentrasi 2 ppm yaitu 101,98%,
konsentrasi 6 ppm yaitu 100,18% dan pada konsentrasi 10 ppm diperoleh
yaitu 100,32%, artinya telah memenuhi persyaratan persen recovery yaitu
dalam rentang 98 – 102%, sehingga metode uji yang digunakan valid.
2. Kadar Flavonoid yang didapat dari ekstrak cair daun binahong dengan hasil
perhitungan sebesar 56,225%.
VIII. Daftar Pustaka
 Mufid, K. 2010. Skripsi Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Binahong
(Anredera cordifolia (Tens) Steenis) Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus dan
Pseudomonas aeruginosa. Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim.
Malang
 Rachmawati, S. 2007. Studi Mikroskopi, dan Skrining Fitokimia Daun Binahong
(Anredera cordifolia (Tens) Steenis). Fakultas Farmasi UNAIR Surabaya.
Surabaya.
 Sukandar, YE., Qowiyyah, A., Minah, N. 2011. Efek Ekstrak Metanol Daun
Binahong (Anredera cordifolia) Terhadap Gula Darah Pada Mencit Model
Diabetes Militus. Jurnal Medika Planta. Vol 01 No : 4.
 Ariani S, Loho L, Durry MF. 2013. Khasiat Daun Binahong (Anredera cordifolia
(Tens) Steenis) terhadap Pembentukan Jaringan Granulasi dan Reepitalisasi
Penyembuhan Luka Terbuka Kulit Kelinci. Universitas Sam Ratulangi. Manado
 Makalunsenge F., Salimi YK., Duengo S. 2014. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak
Daun Binahong terhadap bakteri Staphylococcus aureus. Skripsi. FMIPA.
Universitas Negeri Gorontalo. Gorontalo
 Mustikasari V, Sutanto, Wardatun S. 2012. Potensi Ekstrak Daun Binahong
(Anredera cordifolia (Tens) Steenis) sebagai Antioksidan. Kumpulan Jurnal
Farmasi. Program Studi Farmasi FMIPA Universitas Pakuan. Bogor. Hal : 8-14
 Sudarmadji, Slamet, H.Bambang, Suhardi. 2003 Analisa Bahan Makanan dan
Pertanian. Liberty. Yogyakarta
 Hidayat, A. 1999. Validasi Metode Analisis Kimia. Agro Bio. Vol. 2, No. 2: 22-
28. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. 2011. Farmakope Herbal
Indonesia Edisi 1. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta.
 Harmita. 2006. Analisis Fisikokimia. Departemen Farmasi FMIPA Universitas
Indonesia: Depok

IX. Lampiran