Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Rabu/27 Oktober 2021

Teknik Analisis Biokimia Waktu : 08.00 – 11.00 WIB

PJP : Dr. Dimas Ardianto, S.Si., M.Si.
Asisten : Maulida Fitria

UJI ANTIOKSIDAN: DPPH

Kelompok 9
M. Alif Al-Farizi G84190075
Muhammad Hafizh Hibatullah G84190089
Riska Ainus Sifa G84190109

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2021
 PENDAHULUAN

Radikal bebas dapat didefinisikan sebagai spesies molekul yang mengandung

elektron tidak berpasangan dalam orbital atom dan bersifat independen. Adanya
elektron yang tidak berpasangan menghasilkan sifat-sifat umum tertentu yang
dimiliki oleh sebagian besar radikal bebas, salah satunya adalah sifat tidak stabil
dan sangat reaktif. Radikal bebas dapat menyumbangkan atau menerima elektron
dari molekul lain sehingga dapat berperan baik sebagai oksidator maupun
reduktor (Lobo et al. 2010).
Antioksidan merupakan golongan senyawa yang dapat menghambat reaksi
oksidasi, dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif. Salah
satu bentuk radikal reaktif yang ada pada tubuh merupakan spesi oksigen reaktif,
yang keberadaanya dipicu oleh bermacam-macam faktor. Berdasarkan sumbernya,
antioksidan dapat dibagi menjadi antioksidan endogen dan antioksidan eksogen.
Antioksidan endogen merupakan golongan enzim yang bersifat sebagai
antioksidan, seperti superoksida dismustase (SOD), katalase, dan glutation
peroksidase (Gpx). Sementara itu, antioksidan eksogen merupakan antioksidan
yang didapat dari luar tubuh atau dapat pula bersumber dari makanan. Contoh
antioksidan eksogen adalah beberapa vitamin, seperti vitamin C, vitamin A,
provitamin A, niasin, dan beberapa senyawa lainnya, seperti flavonoid,
organosulfur, statin, serta α-tokoferol (Werdhasari 2014)
Metode uji DPPH berprinsip pada keberadaan atom hidrogen dari senyawa
antioksidan yang berikatan dengan elektron bebas pada senyawa radikal sehingga
menyebabkan perubahan dari radikal bebas (diphenylpicrylhydrazyl) menjadi
senyawa nonradikal diphenylpicrylhidrazin. Adanya aktivitas ini akan
menyebabkan terjadinya perubahan pada DPPH, yaitu berubah warna dari ungu
menjadi kuning. DPPH merupakan senyawa radikal yang stabil pada suhu kamar
dan akan mengalami proses reduksi ketika terdapat senyawa antioksidan. Uji
antioksidan menggunakan DPPH merupakan uji yang memiliki beberapa
kelebihan, di antaranya adalah proses uji yang cepat untuk mendeteksi adanya
senyawa antioksidan menggunakan teknik spektrofotometri (Setiawan et al. 2018;
Garcia et al. 2012).
Tahapan awal persiapan sampel yang akan diuji aktivitas antioksidannya
merupakan ekstraksi, maserasi, dan rotary evaporation. Rangkaian teknik ini
merupakan salah satu metode umum yang digunakan dalam preparasi sampel,
yang bertujuan menghasilkan ekstrak dari suatu pelarut. Dalam prosesnya,
digunakan parameter rendemen yang merupakan perbandingan berat kering
produk yang dihasilkan dengan berat bahan baku. Rendemen dihitung berdasarkan
perbandingan berat ekstrak yang dihasilkan dengan berat biomassa sel yang
digunakan, sehingga berkaitan dengan banyaknya kandungan senyawa bioaktif
pada sampel tertentu (Sani et al. 2014). Praktikum ini bertujuan memahami
aktivitas antioksidan dari suatu bahan alam, memahami prinsip uji aktivitas
antioksidan (metode DPPH), serta menentukan persentase inhibisi dari suatu
bahan alam sebagai antioksidan.
 METODE
Tempat dan Waktu

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini diantaranya spektrofotometer
UV-Vis, labu ukur, gelas piala, pipet, pemanas, oven, blender, rotary evaporator,
kertas saring, dan neraca analitik. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini
yaitu bunga Telang (Clitoria ternatea L.) yang sebelumnya telah determinasi di
LIPI, etanol 80%, etanol 96% (Bratachem), air, pereaksi Mayer, pereaksi
Dragendorff, larutan HCL 1%, serbuk Mg, HCL pekat, HCL 1 N, H2SO4 pekat,
FeCl3 10%, NaOH 1 N dan DPPH (2,2-difenil-1-pikril hidrazil) (Aldrich)

Prosedur Percobaan

Ekstraksi Bunga Telang

Bunga Telang yang telah dipetik kemudian dikeringkan menggunakan

oven dengan suhu 40°C dan diperoleh simplisia bunga telang kering. Simplisia
tersebut diblender agar menjadi serbuk lalu dimasukkan ke dalam gelas piala dan
ditambahkan etanol 80% sebanyak 500 mL. Ekstraksi dilakukan dengan alat
ultrasonik selama 3x3 menit. Pengadukan dilakukan setiap 3 menit. Filtrat
disaring menggunakan corong Buchner untuk memisahkan filtrat dan maserat.
Filtrat yang diperoleh dimasukkan ke dalam botol kaca dengan perlakuan
sebanyak 3x. Filtrat tersebut dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu
40°C dan diperoleh ekstrak kental yang kemudian dikeringkan dengan oven pada
suhu 40°C.

Skrining Fitokimia

a. Alkaloid

Sebanyak 40 mg ekstrak bunga ditambahkan beberapa tetes HCl

1%, dilarutkan, dan ditambahkan 1 mL pereaksi mayer. Reaksi positif
ditandai dengan adanya endapan atau perubahan warna larutan menjadi
keruh.

b. Flavonoid

Sebanyak 40 mg ekstrak bunga ditambahkan dengan 100 mL air

panas, dididihkan selama 5 menit, kemudian disaring. Sebanyak 5 mL
filtrat ditambahkan 0,05 mg serbuk Mg dan 1 mL HCl pekat, lalu dikocok
dengan kuat. Reaksi positif ditandai dengan perubahan warna larutan
menjadi warna merah, kuning, atau jingga.
 c. Saponin

Sebanyak 40 mg ekstrak bunga ditambahkan 10 mL air, dikocok

selama 1 menit, kemudian ditambahkan 2 tetes HCl 1 N. Hasil positif
ditandai dengan terbentuknya busa yang stabil selama ± 7 menit.

d. Terpenoid

Sebanyak 100 mg ekstrak bunga dilarutkan dengan air sebanyak 10

mL. Sebanyak 2 mL larutan ekstrak dipisahkan lalu ditambahkan 3 tetes
HCl pekat dan 1 tetes H2SO4 pekat. Reaksi positif ditandai dengan
terbentuknya warna merah atau ungu.

e. Tanin

Sebanyak 40 mg ekstrak bunga dilarutkan dengan 4 mL air.

Sebanyak 2 mL larutan ekstrak dipisahkan lalu ditambahkan 1 mL FeCl3
10%. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna biru tua atau
hitam kehijauan.

f. Antrakuinon

Sebanyak 50 mg ekstrak bunga ditambahkan 10 mL air, dipanaskan

selama 5 menit, lalu disaring. Sebanyak 3 mL larutan ekstrak dimasukkan
ke dalam 2 tabung reaksi:

1. Tabung I sebagai blanko,

2. Tabung II ditambahkan beberapa tetes larutan NaOH 1 N. Reaksi
positif ditandai dengan terbentuknya warna merah pada larutan.

Pengujian Aktivitas Antioksidan

a. Pembuatan larutan baku induk

Larutan induk ekstrak etanol 80% bunga Telang dengan

konsentrasi 1000 ppm dibuat dengan cara sebanyak 10 mg ekstrak kental
dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, dilarutkan dengan etanol 96%
sampai tanda tera lalu dikocok hingga homogen.

b. Pembuatan sampel uji

Larutan ekstrak etanol 80% bunga Telang dengan konsentrasi 40,

50, 60, 70, 80, dan 90 ppm dibuat dengan cara sebanyak 0,4 mL, 05 mL,
0,6 mL, 0,7 mL, 0,8 mL, dan 0,9 mL larutan induk ekstrak etanol bunga
Telang dipipet ke dalam labu ukur 10 mL, ditambahkan etanol 96% hingga
tanda tera, lalu dikocok hingga homogen.
c. Pembuatan larutan baku induk DPPH konsentrasi 100 ppm

Sebanyak 10 mg serbuk DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur

100 mL, ditambahkan etanol 96% hingga tanda tera, lalu dikocok hingga
homogen.

d. Pembuatan larutan baku kerja DPPH konsentrasi 40 ppm

Sebanyak 40 mL larutan baku induk DPPH 100 ppm dipipet ke

dalam labu ukur 100 mL, ditambahkan etanol 96% hingga tanda tera, lalu
dikocok hingga homogen.

e. Penentuan panjang gelombang maksimum larutan baku DPPH 40 ppm

Sebanyak 4 mL larutan baku DPPH 40 ppm dipipet ke dalam

kuvet, diukur dengan spektrofotometer UV-Vis, diamati dan dicatat
absorbansinya pada panjang gelombang 400-800 nm. Larutan blanko
dapat ditambahkan 4 mL etanol 96%. Panjang gelombang maksimum
dapat ditentukan dari kurva serapan.

f. Pengukuran absorbansi DPPH

Sebanyak 2 mL larutan DPPH 40 ppm dipipet ke dalam tabung

reaksi, ditambahkan 2 mL etanol 96%, dikocok, dan didiamkan selama 30
menit. Setelah itu, larutan tersebut dimasukkan ke dalam kuvet dan
diamati absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada
panjang gelombang maksimum.

g. Pengukuran aktivitas peredaman radikal bebas DPPH dengan

spektrofotometer UV-Vis

Larutan sampel uji dengan konsentrasi 40, 50, 60, 70, 80, dan 90
ppm masing - masing dipipet sebanyak 2 mL, dimasukan ke dalam
masing-masing tabung reaksi, ditambahkan 2 mL larutan baku DPPH 40
ppm, lalu dikocok hingga homogen dan didiamkan selama 30 menit.
Setelah itu diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis.
Pengukuran aktivitas peredaman radikal bebas DPPH dilakukan tiga kali
pengulangan.

h. Penentuan nilai IC50 dan pembuatan kurva kalibrasi

Absorbansi yang diperoleh dari masing-masing konsentrasi

digunakan untuk menghitung nilai persentase peredaman dengan rumus:
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝐷𝑃𝑃𝐻−𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑢𝑗𝑖×100%
% 𝑝𝑒𝑟𝑒𝑑𝑎𝑚𝑎𝑛 = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝐷𝑃𝑃𝐻
 Berdasarkan nilai persentase peredaman masing-masing
konsentrasi dibuat kurva regresi yang akan menghasilkan persamaan y =
bx + a, dimana konsentrasi ekstrak sebagai sumbu x dan nilai persentase
peredaman sebagai sumbu y. Setelah itu dihitung nilai IC50, yaitu
konsentrasi sampel yang memiliki penghambatan absorbansi DPPH
sebesar 50% berdasarkan persamaan regresi linier. Semakin rendah nilai
IC50, maka aktivitas antioksidan semakin tinggi.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pembuatan simplisia yang dilakukan oleh Cahyaningsih et al. (2019) dari

bunga telang akan menghasilkan serbuk simplisia sebanyak 100 gram. Sebanyak
100 gram serbuk simplisia kemudian diekstraksi dengan pelarut etanol 80%
sehingga menghasilkan sejumlah filtrat. Filtrat ini kemudian dipekatkan
menghasilkan 23,12 gram filtrat. Jumlah rendemen yang dihasilkan dihitung
dengan membandingkan massa filtrat yang diperoleh dengan massa simplisia
secara utuh serta dikalikan dengan 100%. Berdasarkan rumus tersebut dapat
diperoleh bahwa rendemen yang dihasilkan berjumlah 23,12%. Semakin besar
rendemennya maka semakin tinggi pula nilai ekonomis produk tersebut, begitu
pula nilai efektivitas dari produk tersebut (Cucikodana et al. 2015).
Dalam penentuan absorbansi pada praktikum ini menggunakan
mircroplater spectrophotometer. Mekanismenya meliputi sampel yang dimasukan
ke dalam microplate kemudian dipasang pada holder. Microplate yang terpasang
pada holder ini lalu dimasukan ke dalam spektrofotometer kemudian di analisis
absorbansinya menggunakan software yang terintegrasi dengan program
komputer. Setelah uji selesai dilakukan, data dianalisis menggunakan excel untuk
pembuatan kurva.
Larutan baku DPPH yang digunakan diukur pada panjang gelombang
maksimum, yaitu berkisar di antara 400-800 nm. Berdasarkan hasil pengukuran
larutan DPPH yang dilakukan oleh Aningsih et al. (2019) menggunakan
spektrofotometer UV-Vis menghasilkan serapan maksimum pada panjang
gelombang 516,2 nm. Pengukuran pada panjang gelombang maksimum ini
dilakukan sebab perubahan absorbansi memiliki nilai yang paling besar untuk
setiap satuan konsentrasi pada panjang gelombang maksimum, sehingga akan
diperoleh kepekaan analisis yang maksimum (Tulandi 2015).
Proses penentuan aktivitas antioksidan sampel dengan metode DPPH
memiliki dua istilah penting, yaitu persentase inhibisi dan nilai IC50. Persentase
inhibisi didasarkan pada kemampuan senyawa antioksidan yang terdapat pada
sampel yang diuji dalam menangkap radikal bebas DPPH. Semakin besar nilai
persentase inhibisi yang dimiliki oleh suatu sampel, maka semakin besar pula
aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh sampel (Kurniawan 2011). Persentase
inhibisi atau persentase peredaman dihitung dari selisih absorbansi DPPH dan
absorbansi sampel uji dibagi absorbansi DPPH lalu dikalikan 100%. Efektivitas
suatu sampel untuk menangkal radikal bebas dari metode DPPH digambarkan
menggunakan nilai IC50. Nilai IC50 merupakan konsentrasi yang dapat meredam
sebanyak 50% radikal bebas DPPH. Nilai IC50 akan berkorelasi secara negatif
terhadap aktivitas antioksidan, sebab semakin kecil nilai IC50 yang dimiliki
sampel, maka semakin besar aktivitas antioksidan yang dimilikinya (Widyasanti et
al. 2016). Nilai IC50 pada penelitian yang dilakukan oleh Cahyaningsih et al.
(2019) didapatkan dari persamaan regresi linier y = bx + a, dimana x merupakan
konsentrasi (ppm) dan y merupakan persentase IC50 yang diperoleh dari kurva
hubungan konsentrasi sampel uji dengan persentase inhibisi.
Dari hasil penelitian yang diperoleh dapat diketahui bahwa metabolit
sekunder yang terkandung dalam ekstrak etanol bunga Telang (Clitoria ternatea
L.) yang tumbuh di Denpasar Barat yaitu: flavonoid, saponin, terpenoid, dan
tanin. Hasil persentase peredaman yang diperoleh diplotkan untuk mendapatkan
kurva regresi linier. Berdasarkan hasil pengujian aktivitas antioksidan diperoleh
persamaan regresi linier yaitu y = 0.5232x + 4.0289 dengan R² = 0.9733, yang
menunjukkan bahwa ekstrak etanol 80% bunga Telang memiliki aktivitas
antioksidan yang kuat dengan nilai IC50 sebesar 87,86 ppm. Bunga Telang
(Clitoria ternatea L.) yang tumbuh di Denpasar Barat memiliki aktivitas
antioksidan kategori kuat.

SIMPULAN

Antioksidan merupakan substrat yang dapat menghambat oksidasi dengan

mengikat senyawa radikal bebas. Uji aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan
metode DPPH dengan prinsip keberadaan atom hidrogen dari senyawa
antioksidan yang dapat berikatan dengan elektron bebas pada senyawa radikal
yang dapat mengubah senyawa radikal bebas (diphenylpicrylhydrazyl) menjadi
senyawa nonradikal (diphenylpicrylhidrazin). Hasil positif ditandai dengan
berubahnya warna DPPH dari ungu menjadi kuning. Persentase inhibisi
didasarkan pada kemampuan senyawa antioksidan yang terdapat pada sampel
yang diuji dalam menangkap radikal bebas DPPH.

DAFTAR PUSTAKA

Cahyaningsih E, Yuda PESK, Santoso P. 2019. Skrining fitokimia dan uji aktivitas
antioksidan ekstrak etanol bunga telang (Clitoria ternatea L.) dengan
metode spektrofotometri UV-Vis. Jurnal Ilmiah Medicamento. 5(1): 51-57.
Cucikodana Y, Supriadi A, Purwanto B. 2012. Pengaruh perbedaan suhu
perebusan dan konsentrasi NaOH terhadap kualitas bubuk tulang ikan
gabus (Channa striata). Jurnal Fishtech. 1(1): 91-101.
Garcia EJ, Oldoni TLC, Alencar SM de, Reis A, Loguercio AD, Grande RHM.
2012. Antioxidant activity by DPPH assay of potential solutions to be
applied on bleached teeth. Braz. Dent. J.
23:22–27.doi:10.1590/S0103-64402012000100004.
Kurniawan A. 2011. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal
1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dan penetapan kandungan fenolik total
 fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba seledri (Apium graveolens L.)
[skripsi]. Yogyakarta: Universitas Sanata Dharma.
Lobo V, Patil A, Phatak A, Chandra N. 2010. Free radicals, antioxidants and
functional foods: Impact on human health. Pharmacogn Rev.
4(8):118–126.doi:10.4103/0973-7847.70902.
Sani RN, Fithri CN, Ria DA, Jaya MM. 2014. Analisis rendemen dan skrining
fitokimia ekstrak etanol mikroalga laut Tetraselmis chuii. Jurnal Pangan
dan Agroindustri. 2(2): 121-126.
Setiawan F, Yunita O, Kurniawan A. 2018. Uji aktivitas antioksidan ekstrak etanol
kayu secang (Caesalpinia sappan) menggunakan metode DPPH, ABTS,
dan FRAP. MPI (Media Pharmaceutica Indonesiana). 2(2):82–89.
Tulandi GP. 2015. Validasi metode analisis untuk penetapan kadar parasetamol
dalam sediaan tablet secara spektrofotometri ultraviolet. PHARMACON.
4(4).doi:10.35799/pha.4.2015.10205.
Widyasanti A, Rohdiana D, Ekatama N. 2016. Aktivitas antioksidan ekstrak teh
putih (Camellia sinensis) dengan metode DPPH (2,2 difenil -1-
pikrilhidrazil). FORTECH. 1(1): 1-9.
Werdhasari A. 2014. Peran antioksidan bagi kesehatan. Jurnal Biotek Medisiana
Indonesia. 3(2): 59-68.