Bahan dan Metode

1. Bahan tanaman

Bahan tanaman yang digunakan yaitu Roylea cinerea ( D. Don) Baill. (Daun

dan batang), Clematis grata Wall. (Seluruh tanaman), Evolvulus nummularis ( L.) L.

(seluruhtanaman) dan Cornus capitata Wall. Semua bahan diidentifikasi dan

dideterminasi, kemudian dilakukan ekstraksi dengan maserasi selama 48 jam dengan

metanol 1:10 (w/v). Lalu dievaporasi menggunakan rotary evaporator. Metanol

dipilih sebagai pelarut ekstrak karena kepolaran dan kemampuannya untuk

mengekstrak kandungan dalam bahan secara maksimum. Ekstrak kering selanjutnya

digunakan untuk penentuan polifenol.

2. HPLC instrumentasi dan kondisi kromatografi

Sistem instrument HPLC (Shimadzu, Kyoto, Jepang) terdiri dari pompa

kuaterner dengan degasser vakum, stabil termostatik kompartemen kolom, auto-

sampler, dan detektor UV. Kolom yang digunakan adalah fase terbalik

memungkinkan C18G kolom dengan dimensi 250 × 4,6 mm, 5 m ukuran pori dan

suhu kolom dipertahankan pada 30oC.

Fase gerak terdiri dari sistem pelarut biner, Solvent A: 900 mL air (HPLC

grade), 1,36 g KH2PO4 dan 5 mL asam orto-fosfat. Volume dibuat hingga 1000 mL

dan disaring melalui 0,22 μm membran filter. Solvent B: Asetonitril (HPLC grade).

Elusi gradien digunakan untuk menjalankan fase gerak 0 min, 5% pelarut B; 8 menit,

5% pelarut B; 15 menit, 40% pelarut B; 30 menit, pelarut B 45%; 35 menit, 5%

pelarut B; 40 menit, 5% pelarut tingkat B. Arus dipertahankan pada 1,0 mL/menit,

Volume injeksi 20 µL dan puncak terdeteksi pada 280 nm.

3. Larutan standar

Dibuat dengan gallic acid, catechin, rutin, quercetin, asam ellagic,

umbelliferone dan kaempferol. Berdasarkan kelarutan, larut pada 100 mL metanol

dengan konsentrasi akhir 1000 ppm. Larutan disonikasi, disaring melalui filter

membran 0,22 µm dan diisi ke dalam botol HPLC untuk analisis.

4. Larutan uji

Sampel uji (ekstrak tumbuhan) disiapkan dalam metanol HPLC grade (10

mg/mL) dalam labu ukur dan selanjutnya disonikasi lalu sampel disaring melalui 0,22

pM filter dan diisi ke dalam botol HPLC untuk analisis.

5. Metode validasi

Metode divalidasi sesuai dengan pedoman ICH [15] untuk memastikan

konsistensi, kehandalan dan akurasi dalam analisis data.

a. Linearitas

Kurva kalibrasi dibangun selama tujuh sampel referensi (asam galat, catechin,

rutin, asam ellagic, umbelliferone, quercetin, dan kaempferol) dari larutan stok

disiapkan secara terpisah. Seri larutan stok diencerkan dengan konsentrasi yang

diketahui untuk mendapatkan kurva linear.

b. Selektivitas

sampel uji dianalisis dengan membandingkan puncak diperoleh dengan

overlay
spektrum dan retensi waktu dengan orang-orang dari sampel referensi yaitu.

asam galat, catechin, rutin, ellagic acid, umbelliferone, quercetin, dan kaempferol.

Berdasarkan analisis, selektivitas ditentukan untuk metode yang dikembangkan

c. LOD dan LOQ

Solusi saham sampel referensi (1000 ppm) yang serial diencerkan dengan

konsentrasi yang diketahui dengan pengencer yang sesuai dan disuntikkan untuk

menghitung LOD dan LOQ. Deteksi dilakukan atas dasar sinyal untuk rasio

kebisingan (S / N) yaitu> 3 kali untuk LOD dan> 10 kali untuk LOQ.

d. Presisi dan pemulihan

Sampel disuntikkan enam kali dalam satu hari serta dalam hari yang berbeda

untuk membandingkan pemulihan dan retensi waktu.

e. Kekhususan

Kekhususan metode ini dikonfirmasi dengan menjalankan kosong, sampel

referensi (senyawa standar) dan sampel uji. Sebuah metode dikatakan spesifik jika

dapat membedakan antara analit dan komponen lain dalam sampel. Puncak yang

diperoleh dalam kromatogram sampel referensi dan sampel uji dibandingkan untuk

memeriksa ada tidaknya analit.

6. Dixanthine oxidase

Aktivitas inhibisi vitro Empat ekstrak metanol dari empat spesies tanaman

dievaluasi untuk Xanthine Oxidase aktivitas penghambatan melalui metode

spektrofotometri. allopurinol obat standar yang digunakan sebagai kontrol positif.

 {( A−B )−(C−D) }
% Penghambatan = x 100%
( A−B)

Dimana A adalah aktivitas enzim tanpa ekstrak uji, B adalah tanpa ekstrak uji

serta xantin oksidase, C adalah kegiatan sampel uji dengan xantin oksidase dan D

adalah kegiatan sampel uji tanpa xantin oksidase.