BAB III

METODOLOGI

3.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini bersifat deskriptif kualitatif. Penelitian diawali dengan
pengambilan sampel buah apel. Buah apel didapatkan dari perkebunan apel di
Kota Batu. Buah apel dipreparasi dengan cara dicuci dengan air mengalir.
Selanjutnya buah apel dipotong tipis lalu dilumuri asam format. Buah apel
dikeringkan secara freeze-dried. Buah apel kemudian diserbukkan dan disimpan
dalam wadah tertutup (Alonso-Salces, dkk. 2004).
Pembuatan ekstrak buah apel dilakukan dengan metode maserasi (Ihsan,
dkk. 2020). Proses maserasi disertai dengan pengadukan menggunakan stirer.
Serbuk buah apel diektraksi menggunakan etanol 96%. Ektrak yang didapat
kemudian diupakan menggunakan rotary evaporator dan dihitung rendemen.
Langkah selanjutnya adalah fraksinasi ekstrak buah apel. Ekstrak buah
apel diektraksi menggunakan etil asetat. Campuran digojog dan didiamkan. Fraksi
etanaol dan fraksi etil asetat yang didapat kemudian diuapkan menggunakan
rotary evaorator. Selanjutnya fraksi yang didapat diidentifikasi menggunakan
spctrofotometer Uv-Vis, HPLC dan MS (Rustanti dan Lathifa, 2018).
Uji aktivitas anti-proliferasi sel kanker dilakukan menggunakan metode
Sulforodhamin B (SRB) dengan cara mengukur protein pada sel menggunakan
ELISA Plate Reader. Kultur sel difiksasi dengan tricchloroacetic acid (TCA) yang
kemudian diwarnai dengan SRB yang dilarutkan dengan asam asetat. Protein sel
yang tidak terwarnai dibils dengan menggunakan asam asetat dan protein sel yang
terwarnai dilarutkan menggunakan Tris Base untuk menentukan Optical Density
menggunakan ELISA Plate Reader. Kemudian dihitung konsentrasi sel yang
bertahan hidup dan nilai IC50 (Musfiroh, dkk. 2011)

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat gelas
laboratorium, Elisa Plat Reader, Uv-Vis, HPLC, dan LCMS.
 3.2.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Buah Apel
Malang, Etanol 96% (Merck), Etil Asetat (Merck), n-Heksan (Merck),
Standar Kuersetin (Merck) dan Asam Format.

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Preparasi Sampel
Buah apel yang telah dipanen dicuci menggunakan air mengalir.
Kemuaidan buah apel dipotong tipis lalu dilumuri dengan asam format 3%.
Buah apel kemuaidan dibekukan menggunakan larutan nitogen dan
dihaluskan. Buah apel yang sudah dihaluskan dimasukkan dalam wadah
tertutup.
3.3.2 Pembuatan Ekstrak
Sebanyak 400 gram sampel buah apel yang telah dipreparasi direndam
menggunakan 1 liter etanol 96% dan diamkan dalam bejana tertutup dan
didiamkan selama 24 jam. Perendaman dibantu dengan pengadukan
menggunakan stirer selama 30 menit. Setelah didiamkan, campuran disaring
dan diambil filtrat. Residu yang tersisa kemudian ditambah 500 mililiter dan
diamkan selama 24 jam. Proses ini diulangi hingga 2 kali. Filtrat yang
didapatkan kemudian digabung jadi satu. Hasil maserasi kemudian diuapkan
menggunakan rotary evaporator dengan suhu 40 oC dan tekanan rendah.
Ektrak kental yang didapat ditimbang untuk memperolah rendemen.
3.3.3 Fraksinasi Ektrak Buah Apel
Ekstrak buah apel dilarutkan menggunakan 100 mililiter etanol 96%
dan dimasukkan ke dalam corong pisah. Tambahkan 100 mililiter etil asetat
dan digojog selama 6 jam lalu didiamkan 24 jam. ulangi penambahan etil
asetats sebanyak dua kali. Pisahkan fraksi etanol dan fraksi etil asetat.
Pekatkan kedua fraksi dengan menggunakan rotary evaporator. Suhu 60 oC
digunakan untuk fraksi etanol dan 50 oC untuk fraksi etil asetat.
3.4 Identifikasi Senyawa Kuersetin
3.4.1 Identifikasi menggunakan Uv-Vis
3.4.1.1 Pembuatan Larutan Baku
Larutan stok kuersetin 500 ppm . Sebanyak 25 miligram
kuersetin dilarutkan dengan 25 mililiter etanol 96% dipindahkan dalam
labu ukur 50 mililiter. Tanda bataskan menggunakan etanol.
Selanjutnya dibuat larutan kuersetin 50 ppm. Diambil 0.5 mililiter
larutan kersetin dari larutan stok 500 ppm lalu pindahkan ke dalam labu
ukur 25 mililiter. Tambahkan etanol sampai tanda batas. Diamkan
selama 5 menit dan ukur menggunakan Spektrofotometer Uv-Vis.
Didapatkan panjang gelombang maksimum.
3.4.1.2 Pembuatan Larutan Sampel
Hasil fraksi yang telah dikeringkan masing-masing ditimbang
25 miligram dan dilarutkan dengan 10 mliliter etanol 96%. Pindahkan
dalam labu ukur dan tanda bataskan menggunakan etanol. Diamkan 5
menit lalu ukur menggunakan Spektrofotometer Uv-Vis dan identifikasi
hasil yang didapat.
3.4.2 Identifikasi Menggunakan HPLC dan MS
Sampel difilter menggunakan membran Bulk GHP Acrodisc® 25 mm
Syringe Filter dan 20 µL sampel diinjeksi untuk analisis HPLC. Blanko
disiapkan dengan menambahkan 3,8 mL larutan baku kuersetin (50 µM)
dalam 0,2 mL etanol yang disiapkan sesaat sebelum analisis. Preparasi
sampel dilakukan sama seperti blanko.
HPLC yang digunakan adalah Shimadzu LC-20 Prominence dimana
sistemnya terdiri dari auto sampler (SIL-20A HT). Data dianalisis dan
diproses menggunakan software LabSolutions (Versi 5.54 SP5). Analisis
menggunakan kolom Purospher® STAR RP-18e (250 mm x 4 mm, 5 µM)
(Merck, Darmstadt, Germany). Eluen yang digunakan adalah ethanol/air
(80:20 v/v) dengan laju alir 1 mL/menit. Puncak kuersetin dideteksi pada
panjang gelombang nm. Selanjutnya sampel diujikan menggunakan HPLC
dengan kondisi serupa dengan blanko. Setelah didapat hasil berupa
kromatogram bandingan hasil antara blanko dan sampel.
Analisis LC-MS dilakukan dengan menggunakan Mariner
Biospectrometry dilengkapi dengan pompa biner. HPLC dihubungkan dengan
spektrometer massa Q-TOF dilengkapi dengan sumber electrospray ionization
(ESI). Mode extracted ion chromatogram (EIC) dari m/z 100-1200 dilakukan
dengan suhu 140°C. Kolom HPLC yang digunakan untuk analisis yaitu
Phenomenex 5 µm C18, 150 × 1 mm. Pelarut metanol dengan 0,3% asam
asetat, laju alir total 0,05 mL/menit dan untuk menjalankan pelarut digunakan
metode elusi isokratik.
3.4.3 Uji Aktivita Anti-proliferasi
Pengujian aktivitas antiprolifesi sel kanker dilakukan dengan metode
Sulfor- hodamine B (SRB) dengan cara mengukur protein pada sel
menggunakan ELISA plate reader. Kultur sel difiksasi dengan trich-
loroacetic acid (TCA) yang kemudian diwarnai dengan 0.4% SRB yang
dilarutkan dalam 1% asam asetat. Protein sel yang tidak terwarnai dibilas
dengan 1% asam asetat sebanyak empat kali dan protein sel yang terwarnai
dilarutkan dengan Tris base untuk menentukan Optical Density meng-
gunakan ELISA plate reader. Dari peng- ujian ini dapat dihitung persentase
sel yang bertahan hidup dan nilai IC50 , yaitu konsentrasi ekstrak, fraksi
etilasetat dari buah apel malang yang diperlukan untuk membunuh 50% sel
kanker payudara T47D.