BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1. Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Sintesis, dan Laboratorium
Mikrobiologi Universitas Muhammadiyah Malang.

4.2. Alat Penelitian

4.2.1. Pembuatan Serbuk Simplisia
1. Mesin penggiling (Blender)
2. Timbangan analitik balance Scout Pro 400 g
3. Pengayak mesh 20 dan 40
4. Oven BINDER

4.2.2. Proses Ekstraksi

1. Timbangan analitik balanceScout Pro 400 g
2. Gelas ukur
3. Desikator
4. Cawan porselen
5. Penyaring Buchner 100 mm
6. Oven BINDER
7. Pipet tetes
8. Batang pengaduk
9. Sudip
10. Erlenmeyer
11. Beaker glass
12. Rotary evaporator vacuumBuchi R-215

4.2.3. Pengujjian Difusi Cakram

1. Autoklaf
2. Inkubator
3. Erlenmeyer

32
 33

4. Micro pipet
5. Kertas saring
6. Laminar Air Flow
7. Tabung reaksi
8. Bunsen
9. Hot plate
10. Pipet volume
11. Kawat ose
12. Penjepit
13. Cawan petri
14. Sterile Blank Discs

4.2.4. Identifikasi Senyawa dengan KLT

1. Cawan porselen
2. Chamber
3. Lempeng KLT (Silika gel TLC 60 F254)
4. Hot plate
5. Pinset
6. Pipa kapiler 5µl
7. Sinar UV
8. Timbangan analitik balance Scout Pro 400 g

4.3. Bahan Penelitian

4.3.1. Bahan Uji
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging buah
Limonia acidissima L..yang didapatkan dari daerah Kecamatan Rasanae Barat,
Kota Bima, NTB dan telah diidentifikasi oleh UPT. Balai Materia Medika, Dinas
Kesehatan, Jawa Timur. Mikroba uji adalah Escherichia coliyang diperoleh dari
Laboratorium Mikrobiologi dan Parasitologi Universitas Muhammadiyah
Malang.
4.3.2. Proses Ekstraksi
1. Pelarut etil asetat teknis
2. Serbuk daging buah Kinca
 34

4.3.3. Pengujian Difusi Cakram

1. Fraksi etil asetat daging buah Limonia acidissima L..
2. Nutrient Agar (NA)
3. Aqudest steril
4. Kloramfenikol
5. Bakteri Escherichia coli
6. DMSO 1%

4.3.4. Identifikasi Senyawa dengan KLT

1. N-Heksan teknis
2. Etil asetat teknis
3. Asam sulfat 10%
4. Larutan KOH 10%
5. FeCl3 1%
6. Pereaksi Dragendorff
7. Pereaksi Anisaldehida-asamsulfat

4.4 Variabel Penelitian

4.4.1 Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah komponen senyawa kimia pada
fraksi etil asetat daging buah Limonia acidissima L..dengan konsentrasi fraksi
sebesar 1,0 %, 2,0 %, dan 4,0 %.

4.4.2 Variabel Terikat

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah diameter zona hambat yang
dihasilkan oleh senyawa uji.

4.5. Sterilisasi Alat dan Bahan

Semua alat yang akan digunakan terlebih dahulu disterilkan melalui proses
sterilisasi yaitu dengan cara sterilisasi kering dan sterilisasi basah. Alat dan bahan
yang akan disterilkan antara lain yaitu cawan petri, penjepit, erlenmeyer, spatula,
Nutrient agar (NA) dan alat serta bahan lain yang akan digunakan pada sterilisasi
di autoklaf.
 35

4.5.1. Sterilisasi Kering

Sterilisasi kering meliputi cara sterilisasi menggunakan api langsung dan cara
sterilisasi dengan oven pemanas.
a. Sterilisasi dengan api langsung
Sterilisasi ini dilakukan pada peralatan seperti jarum ose, spatel, pinset, mulut
tabung dan batang pengaduk.
b. Sterilisasi dengan oven pemanas
Oven pemanas digunakan untuk sterilisasi peralatan gelas yang tidak berskala
seperti cawan petri, pipet, penjepit serta tabung reaksi. Alat-alat yang disterilkan
dimasukkan ke dalam oven setelah mencapai suhu 160ºC selama 1-2 jam

4.5.2. Sterilisasi Basah

Sterilisasi basah dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Peralatan yang
disterilkan dengan sterilisasi basah antara lain yaitu media pertumbuhan bakteri
Escherichia coli, media pertumbuhan Escherichia coli (nutrien agar), erlenmeyer,
gelas ukur, dan pipet tetes. Proses sterilisasi basah ini dilakukan pada suhu 121ºC
selama 15-20 menit.

4.6. Metode Penelitian

4.6.1. Rancangan Penelitian
Penelitian ini bersifat eksperimental yang bertujuan untuk mengetahui
aktivitas antibakteri senyawa dalam fraksi etil asetat daging buah Limonia
acidissima L..terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia colisecara in vitro dengan
metode difusi cakram yang di tunjukkan dengan zona hambat serta mengetahui
golongan senyawa yang terdapat pada fraksi etil asetat.
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan dua perlakuan yakni kelompok
uji yaitu fraksi etil asetat dan kelompok kontrol yaitu kloramfenikol. Dalam
penelitian ini juga dilakukan melalui beberapa tahap yaitu:
1) Persiapan simplisia
2) Penarikan komponen senyawa (fraksinasi bertingkat)
3) Identifikasi kandungan kimia
4) Pengujian antibakteri dengan metode difusi cakram
 36

4.6.2. Kerangka Operasional

Pembuatan simplisia daging buah Limonia acidissima L.

Pembuatan fraksi etil asetat daging buah Limonia acidissima L.

Optimasi eluen Sterilisasi alat dan bahan

Eluasi Preparasi media Na

Identifikasi senyawa dengan KLT Preparasi bakteri Escherichia coli

Pengujian antibakteri dengan metode difusi cakram

Kelompok uji Kelompok kontrol

Fraksi etil asetat daging buah  Kontrol positif : Kloramfenikol
Limonia acidissima L. dengan 30 µg/disk
konsentrasi 1,0 %, 2,0 %, 4,0 %  Kontrol negatif : 0,1 mL DMSO
1% + aquadest ad 1 mL

Analisis data

Gambar 4.1. Skema Kerangka Operasional

4.7. Prosedur Kerja

4.7.1. Preparasi Simplisia
Sampel yang akan diteliti adalah daging buah Limonia acidissima
L.Terlebih dahulu buah dicuci dengan air hingga bersih kemudian dipisahkan
bagian daging buah dari cangkang dan dilakukan pengeringan pada suhu 40°C
dengan cara diangin-anginkan tanpa terkena sinar matahari langsung. Kemudian,
setelah kering daging buah dihaluskan dengan mesin penggilingan, sehingga
diperoleh serbuk halus.Selanjutnya diayak menggunakan Shieve Shaker dengan
derajat kehalusan tertentu.
 37

4.7.2. Proses Fraksinasi Bahan Uji dengan Pelarut Etil Asetat

Proses yang akan dilakukan pada penelitian ini adalah dengan metode
fraksinasi bertingkat menggunakan 3 macam pelarut sesuai kepolarannya yaitu
pelarut n-heksan, etil asetat dan etanol.
Dalam pembuatan fraksi etil asetat digunakan serbuk daging buah Limonia
acidissima L..sebanyak 1300 gram yang telah di ekstraksi terlebih dahulu dengan
pelarut n-heksan, dilakukan ekstraksi dengan menggunakan metode maserasi
(perendaman) selama 24 jam dengan cara sebagai berikut :
1. Masukkan 1300 gram serbuk halus daging buah Limonia acidissima L..yang
telah direndam dengan n-heksan ke dalam sebuah bejana bermulut besar.
2. Serbuk daging buah ditambahkan dengan 13000 mL (Perbandingan 1:10) etil
asetat direndam selama 24 jam dan disaring dengan corong Buchner dan
tampung filtratnya (filtrat 1 dan residu 1).
3. Residu 1 dimaserasi kembali dengan etil asetat sebanyak 6500 mL
(Perbandingan 1:5) di rendam selama 24 jam. Saring dan tampung filtratnya
(filtrat 2 dan residu 2).
4. Residu 2 dimaserasi kembali dengan etil asetat sebanyak 6500 mL
(Perbandingan 1:5) direndam selama 24 jam. Saring dan tampung filtratnya
(filtrat 3 dan residu 3).
5. Proses maserasi ini dilakukan dengan metode yang sama secara berulang sampai
pada filtrat tidak lagi menunjukkan adanya komponen yang tertarik dengan
pelarut etil asetat. Pada pengujian KLT dilakukan penotolan sebanyak 5 µl pada
masing-masing filtrat untuk melihat kepekatan dari filtrat yang didapat. Hal ini
ditandai dengan tidak ada noda yang terbentuk pada plat KLT.
6. Filtrat dikumpulkan lalu dipekatkan dengan Rotary evaporator vacuum dengan
suhu 50°C sampai diperoleh larutan ekstrak kental. Kemudian pindahkan ekstrak
kental ke cawan porselen. Ekstrak kental dikeringkan di oven pada suhu 40ºC
sampai bobot konstan.
7. Ekstrak disimpan dilemari pendingin sampai siap digunakan.

4.7.3. Pemisahan Senyawa dengan KLT

Fraksi etil asetat daging buah Limonia acidissima L..ditimbang sebanyak 50
mg dilarutkan dalam 1 mL etil asetat pada wadah tertutup rapat. Totolkan sebanyak
 38

5 μl pada lempeng KLT, kemudian di eluasi dengan berbagai macam fase gerak.
Eluen yang memiliki kemampuan terbaik dalam memisahkan komponen senyawa,
akan digunakan pada pengujian aktivitas antibakteri dengan metode difusi cakram
(Depkes RI, 2008).
(1) Fase diam : Silika Gel TLC 60 F254
(2) Optimasi fase gerak : n-heksan : etil asetat = 8 : 2
n-heksan : etil asetat = 6 : 4
n-heksan : etil asetat = 4 : 6

4.7.4 Identifikasi Komponen Senyawa

Terhadap komponen senyawa yang telah dipisahkan dengan metode KLT,
dilakukan identifikasi senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada ekstrak etil
asetat dengan penampak noda sebagai berikut :
a. Alkaloid : dragendorff
Hasil positif alkaloid di tunjukkan dengan adanya noda berwarna jingga
b. Terpenoid : anisaldehida-asam sulfat.
Panaskan lempeng pada suhu 100°C selama 5-10 menit. Hasil positif terpenoid
di tunjukkan dengan adanya noda berwarna ungu
c. Flavonoid : uap amonia atau asam sulfat 10 %
Hasil positif flavanoid di tunjukkan dengan adanya noda berwarna kuning
intensif
d. Polifenol dan Tanin : besi (III) klorida 1%
Hasil positif polifenol di tunjukkan dengan adanya noda berwarna hitam
e. Antrakuinon : larutan kalium hidroksida 10% dalam metanol
Hasil positif antrakuinon di tunjukkan dengan adanya noda berwarna kuning,
kuning coklat, merah ungu atau hijau ungu.

4.7.5. Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji

Pembuatan konsentrasi larutan uji dibuat dengan cara sebagai berikut :
1) Timbang fraksi etil asetat daging buah Limonia acidissima L.sebanyak 10 mg
larutkan dalam 0,1 mL DMSO 1%, ditambahkan aquadest steril sampai 1,0 mL.
Sehingga diperoleh larutan uji 1,0 %.
 39

2) Timbang fraksi etil asetat daging buah Limonia acidissima L.sebanyak 20 mg

larutkan dalam 0,1 mL DMSO 1%, ditambahkan aquadest steril sampai 1,0 mL.
Sehingga diperoleh larutan uji 2,0 %.
3) Timbang fraksi etil asetat daging buah Limonia acidissima L.sebanyak 40 mg
larutkan dalam 0,1 mL DMSO 1%, ditambahkan aquadest steril sampai 1,0 mL.
Sehingga diperoleh larutan uji 4,0 %.

4.7.6. Preparasi Media

Dalam pengujian antibakteri ini media yang digunakan sebagai
pertumbuhan Escherichia coli yaitu media Nutrient Agar (NA). Dalam pembuatan
media NA diperlukan 5 gram peptone, 3 gram beef extract, 5 gram NaCl, dan 15
gram bacto agar yang dilarutkan dalam 1 liter aquadest (Mew, Borromeo, Hardy,
2001). Media ini dibuat dengan melarutkan bahan NA sebanyak 28 gram ke dalam
1 liter aquadest dan dipanaskan sampai larut. Setelah larut, dituang ke labu
erlenmeyer, disumbat dengan kapas dan ditutup dengan aluminium foil kemudian
disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C dan dituang ke
dalam cawan petri (Astiani, Afghani, & Savante, 2014).
Pada pengujian kali ini, akan dibuat media NA sebagai pertumbuhan
Escherichia colisebanyak 250 mL, sehingga digunakan bahan NA sebanyak 7 gram
(1,25 gram peptone, 0,75 gram beef extract, 1,25 NaCl dan 3,75 gram bacto agar).

4.7.7. Identifikasi Bakteri Escherichia coli dengan pewarnaan gram

Sebelum dilakukan identifikasi bakteri, terlebih dahulu dilakukan kultur
bakteri pada media nutrient agar, yang dilakukan dengan mengambil satu ose
biakan bakteri, kemudian ditanam pada Nutrient agar, dan kemudian diinkubasi
selama 12-24 jam pada suhu 37°C.
Untuk identifikasi Escherichia coli, dilakukan dengan mengambil 1 ose
biakan pada Nutrient agar, kemudian diletakkan pada objek glass, lalu dilakukan
fiksasi dengan pemanasan diatas api bunsen. Kemudian ditetesi dengan pewarna
crystal violet, lalu didiamkan selama 2-3 menit, dan dibilas dengan air. Selanjutnya
ditetesi dengan larutan iodin, dan didiamkan selama 1 menit, lalu dibilas dengan
alkohol 96% selama ±10 detik hingga tidak terdapat zat warna diatas sediaan, lalu
bilas kembali dengan air. Kemudian tetesi kembali dengan larutan safranin, dan
 40

diamkan selama 30 detik, cuci dengan air, keringkan, lalu amati dibawah mikroskop
(Tim Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, 2003).

4.7.8. Preparasi Bakteri

Pada proses peremajaan bakteri Escherichia coliyang berasal dari biakan
murni disuspensikan dalam NaCl fisiologis steril selama 2 jam. Kemudian diambil
sebanyak 1 mL dan masukkan pada cawan petri yang berisi media Nutrient agar
aduk perlahan dengan memutar cawan petri hingga homogen kemudian di bekukan
dan diinkubasi dengan suhu 37°C selama 24 jam.
Ambil bakteri dari hasil peremajaan menggunakan jarum ose steril dan
masukkan dalam tabung reaksi yang berisi 9 mL aquadest.Kemudian vortex agar
suspense homogen.Digunakan standart McFarland untuk membandingkan hasil
kekeruhan suspensi bakteri yang dinyatakan dalam satuan CFU/mL (Sutton, 2011).
Dari kekeruhan yang sama dengan standart McFarland tersebut, maka didapatkan
suspensi bakteri dengan tingkat kekeruhan 108 CFU/mL (colony forming unit /
mililiter) yang sesuai dengan standart McFarland. Disiapkan 2 tabung kosong
masing-masing di isi 9 mL aquadest steril (tabung 2 dan tabung 3).Selanjutnya pipet
1 mL dari tabung 1 dan masukkan pada tabung 2 kemudian vortex hingga homogen.
Hasil dari tabung 2 didapatkan tingkat kekeruhan bakteri 10 7 CFU/mL.Kemudian
dari tabung 2 pipet 1 mL dan masukkan dalam tabung 3 lalu vortex hingga
homogen.Hasil dari tabung 3 di dapatkan tingkat kekeruhan bakteri 10 6 CFU/mL.
Dari tabung 3 larutan diambil dengan cotton bud steril, putar cotton bud
steril dan tekan dengan kuat ke dinding tabung untuk menghilangkan kelebihan
cairan, lalu oles inokulum ke seluruh permukaan media NA dengan memutar cawan
60° sebanyak 3 kali.Lalu oleskan ke sekeliling pinggiran agar, dan biarkan
mongering dengan cawan tertutup (WHO, 2009).
 41

Tabel IV.1. Standar Kekeruhan McFarland (Sutton, 2011).

Skala McFarland CFU (x108mL) 1% BaCl2/ 1% H2SO4(mL)

0.5 <300 0.05/9,95
1 300 0,1/9,9
2 600 0,2/9,8
3 900 0,3/9,7
4 1200 0,4/9,6
5 1500 0,5/9,5
6 1800 0,6/9,4
7 2100 0,7/9,3
8 2400 0,8/9,2
9 2700 0,9/9,1
10 3000 1,0/9,0

4.7.9. Pengujian Difusi Cakram

Proses pengujian antibakteri untuk metode difusi cakram antara lain sebagai
berikut:
1) Disiapkan vial yang telah berisi larutan uji dengan konsentrasi 1%, 2%, dan
4%.
2) Disiapkan preparasi bakteri dalam media cair dengan volume total kurang dari
100 mL.
3) Bakteri yang telah dipreparasi diambil dengan cara mencelupkan kapas lidi
steril satu kali, lalu diletakkan pada tepi tabung reaksi, kemudian kapas lidi
steril tersebut diputar agar bakteri yang akan dioleskan tidak terlalu banyak.
Setelah itu dioleskan pada Nutrient agar dan diratakan.
4) Media Nutrient agar yang telah dioleskan bakteri Escherichia colidibiarkan
dahulu 5 menit agar mengering. Disk kertas saring dengan diameter 6 mm
sebanyak 3 buah yang telah ditetesi sampel uji dan kontrol positif yaitu
kloramfenikol 1 buah kemudian diletakkan pada media pembenihan dengan
jarak tiap cakram 3 cm dan dari tepi lempeng sebesar 2 cm. Disk kertas saring
ditekan lembut dengan menggunakan pinset pada permukaan lempengan
 42

sehingga terdapat kontak yang baik antara disk lempengan agar. Jarak diatur
sedemikian rupa sehingga satu disk dengan disk lainnya berjauhan.
5) Selanjutnya semua media Nutrient agar diinkubasi pada suhu 37°C selama 24
jam.
6) Pengujian senyawa antibakteri dilakukan dengan pengamatan yang dilakukan
setiap 24 jam dengan melihat adanya zona (area) jernih disekitar Disk kertas
saring. Zona (area) hambatan yang terbentuk diukur dengan penggaris dalam
satuan millimeter (mm) dan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.

4.8. Bagan Alur Penelitian

a) Proses Pembuatan Fraksi Etil Asetat Daging Buah Limonia acidissima L..
Ditimbang serbuk daging buah Limonia acidissima L. yang telah di ekstraksi
terlebih dahulu dengan pelarut n-heksan sebanyak 1300 gram

Serbuk daging buah ditambahkan dengan 13000 mL (Perbandingan 1:10)

Etil Asetat direndam selama 24 jam dan disaring dengan corong buchner
dan tampung filtratnya.

Dimaserasi kembali dengan Etil Asetat sebanyak 6500

mL (Perbandingan 1:5) di rendam selama 24 jam.Saring Residu 1
dan tampung filtratnya.

Dimaserasi kembali dengan Etil Asetat sebanyak 6500 Residu 2

mL (Perbandingan 1:5) di rendam selama 24 jam.Saring
dan tampung filtratnya.

Proses maserasi ini dilakukan dengan metode yang sama

secara berulang sampai pada filtrat tidak lagi
menunjukkan adanya komponen yang tertarik dengan Residu 3
pelarut etil asetat, ditandai dengan tidak ada noda yang
terbentuk pada plat KLT.

Filtrat 1 + 2 + 3

Pekatkan seluruh filtrat dengan rotary evaporator

vacuum sampai diperoleh larutan ekstrak kental dan Fraksi etil
dikeringkan di oven pada suhu 40°C asetat

Gambar 4.2.Bagan Alur Proses Pembuatan Fraksi Etil Asetat Daging Buah
Limonia acidissima L.
 43

b) Proses Pengujian Antibakteri dengan Metode Difusi Cakram

1 2 3 KN

1,0 % 2,0 % 4,0 %

K- (0,1mL DMSO 1% +
aquadest 1 mL)
2
cm

KP
3 cm
Kloramfenikol 30 µg/disk
Sampel uji, kontrol
positif, dan kontrol
negatif diteteskan Permukaan Nutrient agaryang telah
pada disk cakram diolesi bakteri Eschericia coli
dengan diameter
6 mm yang telah
ditanam pada Diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam
media NA dengan
jarak tiap cakram
Diukur zona hambat
3 cm dan 2 cm dari
tepi cakram.
(Kurniawan, Replikasi sebanyak 3x untuk tiap-tiap ekstrak
2015). yang di uji

Analisis data

Gambar 4.3. Prosedur Pengujian Antibakteri dengan Metode Difusi Cakram

4.10 Analisis Data

Analisis data dilakukan secara deskriptif dengan melakukan pengamatan
terhadap pengukuran diameter zona hambat dari daerah berwana bening dari
masing–masing komponen senyawa yang telah dipisahkan dari daging buah
Limonia acidissima L. dengan fraksi etil asetat.