LEMBAR KERJA

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI ANALISIS

ANALISIS MIKROBIOLOGIS SPESIMEN KLINIS

NAMA MAHASISWA : MUTIARA FATIMAH AR ROZAN

GOLONGAN : SENIN SIANG (A)
KELOMPOK : EMPAT (IV)

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN
2020

105
 III.8. MODUL 8: UJI AKTIVITAS ANTIMIKROBA SENYAWA BAHAN ALAM

a) Urgensi Praktikum
Resistensi antimikroba, terutama antibiotika sering terjadi di klinis. Bahan
alam yang bersifat antimikroba sering dijadikan fokus penelitian dalam
mencari senyawa antimikroba baru, sehingga pengetahuan mengenai
pengujian aktivitas antimikroba dari bahan alam penting untuk dikuasai.
b) Deskripsi Singkat Praktikum
Dalam praktikum ini mahasiswa akan mempraktekkan prosedur pengujian
aktivitas senyawa bahan alam meliputi skrining aktivitas antimikroba ekstrak
dan KLT bioautografi.
c) Sasaran Pembelajaran
Setelah mengikuti praktikum ini maka mahasiswa diharapkan
dapat:
1. Menentukan aktivitas antimikroba dari bahan alam
2. Menulis laporan ilmiah berdasarkan hasil eksperimen di laboratorium
dan pustaka
3. Mempresentasikan opini/argumen secara runut berdasarkan hasil
eksperimen dan pustaka
4. Aktif dalam pengerjaan maupun diskusi dengan asisten serta mampu
bekerja sama dengan teman kelompoknya dalam melaksanakan
d) Alokasi Waktu Praktikum
Alokasi waktu praktikum ialah 340 menit terbagi dalam dua minggu
praktikum
(1 minggu = 170 menit).
e) Tempat Praktikum
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin.
f) Teori/Prinsip Dasar
Senyawa bahan alam yang bersifat antimikroba terdapat melimpah di
alam. Bahan tersebut dapat dikembangkan menjadi senyawa antimikroba
baru maupun sebagai modulator untuk meningkatkan efek dari antibiotika.
Untuk menguji aktivitas senyawa bahan alam, terdapat berbagai metode:
difusi agar, dilusi padat/cair/mikrodilusi, checkerboard assay, dan lain-lain.
Setelah ekstrak aktif ditemukan, KLT bioautografi dapat digunakan untuk
menentukan golongan senyawa yang aktif dengan tujuan memudahkan
proses isolasi. Biautografi berasal dari kata bio = makhluk dan autografi =
106
 melakukan aktivitas sendiri, bioautografi merupakan metode senyawa
antimikroba yang belum teridentifikasi dengan cara melokalisir aktivitas
antimikroba pada suatu kromatogram. Metode ini dilakukan dengan
memanfaatkan pengerjaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Pengeringan
lempeng KLT dilakukan secara hati-hati untuk menghilangkan sisa eluen
yang dapat berpengaruh pada pengujian antimikroba. Senyawa pada
lempeng KLT terlebih dahulu dideteksi dengan menggunakan sinar UV pada
panjang gelombang 254 dan 366 nm untuk mengetahui letak spot. Prosedur
KLT bioautografi didasarkan atas teknik difusi agar, zona hambatan akan
muncul di sekeliling spot KLT yang memiliki aktivitas antimikroba.
Bioautografi terbagi atas tiga kelompok yaitu: bioautografi langsung,
bioautografi kontak dan bioautografi pencelupan.
Biautografi langsung dilakukan dengan cara menyemprotkan suspensi
mikroorganisme uji dalam media cair ke permukaan lempeng KLT kemudian
dilakukan inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Terbentuknya zona
hambat dapat diketahui dengan cara menyemprot lempeng dengan
pewarna tetrazolium. Zona hambat akan tetap berwarna putih sedangkan
latar akan berwarna ungu.
Bioautografi kontak dilakukan dengan cara menempatkan lempeng KLT
di atas medium agar yang telah diinokulasikan dengan mikroorganisme uji
dan dibiarkan berdifusi selama 15-30 menit kemudian dilepaskan dari media
sebelum diinkubasi sedangkan bioautografi pencelupan/agar overlay
dilakukan dengan cara menempelkan lempeng KLT pada base layer
kemudian dituangi seed layer yang ditambahi suspensi mikroba uji dan
diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pewarna tetrazolium dapat
ditambahkan ke dalam media untuk mempermudah pengamatan.
g) Peralatan
Cawan petri, tabung reaksi, spreader glass, chamber glass, botol
pengencer, spoit (1 ml, 3 ml, 5 ml), pinset, inkubator, rak tabung, vortex
mixer
h) Bahan
Media Mueller Hinton Agar (MHA), biakan Bacillus subtilis, biakan
Escherichia coli, biakan Salmonella thyposa, biakan Staphylococcus aureus,
biakan Pseudomonas aeruginosa, biakan Streptococcus mutans, metanol,
pipa kapiler, etil asetat, kloroform, heksan, alkohol 96%, DMSO 10%,
lempeng
 silica GF254, larutan tetrazolium klorida (TTC) 2%, medical gloves, tip
mikropipet
i) Prosedur Kerja
1) Skrining Aktivitas Antimikroba Ekstrak
• Tuang ± 15 ml media MHA ke dalam cawan petri steril secara
aseptis, biarkan media memadat.
• Larutkan 1 g ekstrak dalam 10 ml DMSO 10%, homogenkan
menggunakan sonikator selama 1-5 menit.
• Pipet ekstrak menggunakan mikropipet ke dalam paper disk blank,
biarkan selama 10 menit.
• Siapkan suspensi biakan uji usia 18 jam (diencerkan sesuai standar
McFarland 0,5)
• Ambil 1 swab hasil pengenceran biakan uji, goreskan secara mereata
di permukaan media.
• Tempel paper disk secara aseptis di atas media, inkubasikan suhu
37°C, 1 x 24 jam
• Amati dan catat diameter zona hambat.
2) Uji KLT Bioautografi
• Campur eluen dengan perbandingan tertentu, jenuhkan terlebih
dahulu.
• Larutkan 1 g ekstrak dalam 10 ml cairan penyari, homogenkan
menggunakan vortex mixer
• Pipet ekstrak menggunakan pipa kapiler dan totolkan di atas
permukaan lempeng yang telah ditandai batas atas dan batas
bawah. Lakukan secara duplo.
• Elusi noda menggunakan fase gerak yang sesuai
• Amati noda di bawah sinar UV 254 dan 366, tandai noda
menggunakan pensil.
• Biarkan lempeng mengering selama 1 jam atau bantu pengeringan
menggunakan hair dyrer.
• Suspensikan 200 µl biakan uji usia 18 jam (setara standar McFarland
0,5) dengan 15-20 ml media MHA. Tambahkan 0,5-1 ml larutan TTC
2%.
 • Untuk bioautografi kontak, tuang media dan biarkan memadat
kemudian tempel lempeng KLT selama 15-30 menit di dalam kulkas
kemudian cabut lempeng.
• Untuk bioautografi pencelupan, siapkan base layer (media tanpa
biakan) kemudian biarkan memadat dan tempel lempeng KLT.
Tuangkan seed layer yang berisi biakan uji di atas lempeng.
• Inkubasikan cawan petri selama 1 x 24 jam pada suhu 37°C.
• Amati zona bening yang terbentuk dan bandingkan dengan lempeng
KLT kontrol.
j) Referensi dan Bahan Bacaan
1. Djide, M,N. dan Sartini. 2012. Analisis Mikrobiologi Farmasi. Penerbit
Lephas. Unhas.
2. Choma, I.M. and Grzelak, E.M. 2010. Bioautography Detection in Thin
Layer Chromatography. J. Chromatogr.
3. Bleeming, R.J. et al. 1970. The Application of Tetazolium Bioautography
to The Identification of Folic Acid Derivatives. J. clin. Path. 23: 411-413
Lembar Kerja
Skema Kerja
Skrinning Aktivitas Mikroba

Metode KLT Bioautografi

a. Proses Elusi
Lembar Kerja
Tanggal disetujui: Nama & Paraf asisten:

Nur Afifah Ardiningtyas

109
 Skema Kerja

b. Metode Kontak KLT Bioautografi

c. Metode Langsung KLT Bioautografi

Tanggal disetujui: Nama & Paraf asisten:

Nur Afifah Ardiningtyas

110
Hasil Pengujian Skrining Aktivitas Antimikroba Ekstrak
Nama sampel Ekstrak Lada Hitam (Piper nigrum)

Pelarut DMSO

Biakan uji Staphylococcus aereus dan Escherichia coli

Tanggal 29/11/2020
pengerjaan
Tanggal 29/11/2020
pengamatan
Suhu inkubasi 37C
Lama inkubasi 1 x 24 jam

Gambar

K ode
ekstrak: Sy

Berdasarkan hasil yang didapatkan ekstrak Lada Hitam

(Piper nigrum) aktif terhadap mikroba uji Staphylococcus
aereus yang terlihat zona bening di sekitas paper disk yang
ditetesi ekstrak. Sedangkan pada mikroba uji Escherichia
Interprentasi
coli didapatkan hasil bahwa ekstrak Lada Hitam (Piper
nigrum) tidak aktif atau aktivitas antimikrobanya tidak
efektif, yang dilihat dari zona bening tidak terlalu transparan

Tanggal disetujui: Paraf dan Nama Asisten:

Nur Afifah Ardiningtyas

111
Hasil Pengujian KLT Bioautografi Ekstrak

Nama sampel Ekstrak Lada Hitam (Piper nigrum)

Rf 0,5

Metode uji Metode Kontak

Fase gerak n-Heksan : Etil asetat ( 3:1 )

Biakan uji Escherichia coli

Tanggal 29/11/2020
pengerjaan
Tanggal 29/11/2020
pengamatan
Suhu inkubasi 37°C

Lama inkubasi 1 × 24 jam

Hasil penyemprotan dengan reagen :
1. Reagen dragendorf : menunjukkan warna endapan
jingga
Uji Tambahan 2. Reagen FeCl3 : tidak menunjukkan warna hijau
gelap atau biru.
3. Reagen Pb asetat 10% : menunjukkan warna
endapan putih
Gambar

Berdasarkan hasil pengujian KLT bioautografi, lempeng

ekstrak lada hitam yang terdifusi di media terdapat zona
bening. Pada metode langsung KLT bioautografi untuk
Interprentasi pemberian reagen dragendorf menunjukkan warna endapan
jingga. Reagen FeCl3 tidak menunjukkan warna hijau gelap
atau biru. Sedangkan pada reagen Pb asetat 10%
menunjukkan warna endapan putih
Hasil Pengujian KLT Bioautografi Ekstrak

Tanggal disetujui: Paraf dan Nama Asisten:

Nur Afifah Ardiningtyas

112
Pembahasan
Berdasarkan hasil percobaan pengujian skrining aktivitas antimikroba
ekstrak Lada Hitam (Piper nigrum) didapatkan nilai Rf 0,5 berdasarkan pustaka
standar piperin terletak pada Rf = 0,5. Hal itu karena lada hitam memiliki
kandungan piperin yang terdapat aktivitas antibakteri dari buah lada hitam
terhadap bakteri yang disebabkan oleh adanya kandungan piperin aktif
terhadap mikroba uji (Pundir dan Pranay 2010). Sehingga menujukkan bakteri
yang diidentifikasi dengan KLT merupan ekstrak lada hitam yang memiliki
aktivitas antibakteri.
Hasil yang didapatkan pada mikroba uji Staphylococcus aereus terlihat
zona bening di sekitas paper disk yang ditetesi ekstrak. Pada mikroba uji
Escherichia coli didapatkan hasil bahwa ekstrak Lada Hitam (Piper nigrum)
tidak aktif atau aktivitas antimikrobanya tidak efektif, yang dilihat dari zona
bening tidak terlalu terlihat. Sehingga dapat diartikan pada uji ini ekstrak lada
hitam efektif menghambat pertumbuhan Staphylococcus aereus namun tidak
efektif menghambat pertumbuhan Escherichia coli. Berdsarkan pustaka di
dapat bahwa Lada hitam merupakan salah satu tanaman yang telah terbukti
memiliki aktivitas antibakteri. Aktivitas P. nigrum dalam menghambat
pertumbuhan beberapa bakteri telah dilaporkan pada penelitian sebelumnya
seperti Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Streptococcus facealis,
Pseudomonas aeruginosa dan Escherichia coli (Pavithra, 2019). Komponen
antibakteri dari lada hitam merusak membran sel dengan membatasi aktivitas
enzim dan mengubah permeabilitas, yang mengakibatkan senyawa antimikroba
dapat masuk ke dinding sel bakteri. Aktivitas Na/K-ATPase menurun,
mengakibatkan senyawa antibakteri buah lada hitam dapat menahan
metabolisme energi pada bakteri (Hui Tang, 2017). Sehingga hasil dari
percobaan skrining aktivitas antimikroba ekstrak Lada Hitam (Piper nigrum)
tidak sesuai, hal itu dapat disebabkan karena kesalahan dalam pengerjaan
skrinning seperti kurangnya pemberian ekstraksi pada paper disk.
Pada pengujian KLT bioautografi dilakukan dengan metode kontak
dan langsung. Berdasarkan hasil yang didapatkan pada metode kontak KLT
bioautografi ekstrak lada hitam yang terdifusi pada media bakteri uji terdapat
zona bening. Berdasarkan hasil pustaka bahwa Lada hitam merupakan salah
satu tanaman yang telah terbukti memiliki aktivitas antibakteri. Sehingga hasil

113
Pembahasan

114
Pembahasan
Pustaka sesuai dengan pengujian adanya zona hambat yang menadakan
adanya aktivitas senyawa antibakteri (Pavithra, 2019).
Pada metode langsung KLT bioautografi dengan pemberian reagen
didapatkan hasil dengan pemberian reagen dragendorf menunjukkan warna
endapan jingga. Pada reagen FeCl3 tidak menunjukkan warna hijau gelap
atau biru, sedangkan pada reagen Pb asetat 10% menunjukkan warna
endapan putih. Berdasarkan pustaka Uji alkaloid dilakukan dengan
menggunakan reagen Dragendorf dan Wagner yang dimana menujukkan
warna merah jingga. Pada reagen FeCl3 memberikan warna hijau tua dengan
uji FeCl 10% yang mengidentifikasikan adanya senyawa fenolik (Koulman,
2003). Untuk larutan Pb Asetat (timbal asetat) 10%, positif flavonoid jika
terdapat endapan kuning (Karim, 2015). Hal itu tidak sesuai dengan pustaka
kakrena lada hitam memiliki golongan senyawa alkaloid dan flavonoid, yang
dimana berdasarkan hasil uji lada hitam tidak menujukkan senyawa flavonoid
(Koulman, 2003).

Kesimpulan

Berdasarkan hasil yang didapatkan pada uji skrinning ekstrak lada hitam
efektif menghambat pertumbuhan Staphylococcus aereus namun tidak efektif
menghambat pertumbuhan Escherichia coli. Pada uji KLT bioautografi
didapatkan zona hambat pada metode kontak, sedangkan pada metode
langsung dengan beberapa reagen reagen dragendorf, reagen FeCl3 dan
reagen Pb asetat 10% menunjukkan bahwa lada hitam hanya memiliki
senyawa alkaloid.
Referensi

Hui Tang, et al, 2017, Antimicrobial effect of black pepper petroleum ether
extract for the morphology of Listeria monocytogenes and Salmonella
typhimurium, Journal food science technology (June 2017) 54 (7) pp.
2067-2076.
Koulman A, 2003, Podophyllotoxin, A Study of Biosynthesis, Evolution, Function
and Use of Podophyllotoxin and Related Lignans, Rijksuniversiteit,
Groningen, 16-18.
Karim, Karina., Minarni, R.Jura., Sri, Mulyani. S., 2015, Uji Aktivitas Antioksidan
Ekstrak Daun Patikan Kebo (Euphorbia hirta L.),FKIP, Universitas
Tadulako, Palu
Pundir, R.K. dan P. Jain. 2010. Comparative Studies on The Antimicrobial
Activity of Black Pepper (Piper nigrum) and Tumeric (Curcuma longa)
Extracts. International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical
Technology. Vol. 1. No. 2. pp. 491-500.
Pavitra, 2019. “Antibbacterial And Antioxidan Activity of Methanol Extract” Indian
journal of Pharmacology. Vol. 41

Tanggal ACC: Nama & Paraf asisten: Nilai:

Nur Afifah Ardiningtyas

116