1

BAB III
METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan pada bulan Desember-Februari 2020 dengan lokasi
pengambilan sampel berada di perairan GOR Aji Umbut Tenggarong, Kutai
Kartanegara, Kalimantan Timur dan Laboratorium Fisiologi Perkembangan dan
Molekuler Hewan FMIPA UNMUL Jl. Barong Tongkok, Gn. Kelua, Samarinda Ulu,
Kota Samarinda, Kalimantan Timur.

3.2 Alat dan Bahan

Alat-alat ynag digunakan dalam penelitian ini antara lain pH meter, DO meter,
mikroskop, GPS (Global Potitioning System), plankton net, pipet tetes, cover glass,
objeck glass, autoclaf, neraca analitik, gelas ukur, oven, erlenmeyer 100 mL, 250 mL
dan 500 mL, spatula, labu ukur 100 ml, aerator, lampu uv, kain satin, labu soxhlet dan
camera handphone
Bahan yang digunakan antara lain alumunom foil, aquadest, NaNO3, NH4NO3,
MgSO4, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2.2H2O, CaCO3, 2 mg Fe-citrate, citric acid, biotin,
thiamine, vitamin B6 dan vitamin B12, larutan NaOH, pelarut heksana, kertas label,
larutan aseton, kromatografi kolom

3.3 Prosedur kerja

3.3.1 Observasi lapangan dan pengambilan sampel
3.3.1.1 Pengambilan sampel dilapangan
Sebelum pengambilan sampel dilakukan pengamatan kualitas perairan ditempat
saamping dengan mengukur kadar pH dan DO perairan pad 3 titik pegambilan sampel
yang telah ditentukan sebelumnya. Setelah dilakukan uji kualitaas perairan
selanjutnya dilakukan pengambilan sampel dilakukan dengan melemparkan plankton
net kedalam air dengan kedalam tertentu. Selanjutnya diamkan plankton net selama
beberapa menit didalam air kemudian tarik plankton net secara vertikal. Sampel yang
telah diambil dimasukkan dalam botol sampel dan laukan ppengambilan sampel
secara berulag-ulang hingga mencapai 1 liter pada setiap titik pengambilan.
Selanjutnya sampel yang telah dimasukkaan kedalam botol di beri label pengambilan
dengan keterangan waktu pengambilan sampel, lokasi titik pengambilan sampel dan
 2

kode sampel. Kemudian botol yang berisi sampel dibawa ke Laboratorium Fisiologi
Perkembangan dan Molekuler Hewan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, untuk dilakukaan tahapapan selanjutnya.
Penanganan sampel dilaboratorium
Setelah dilakukan pengambilan sampel di lapangan didiamkan sselam 24 jam
didalam ruangan laboratorium. Selanjutnya sampel yang telah diambil dilakukan
pengamayn dibawah mikroskop untuk mengecek Botryococcus barunii yang terdapat
didalam sampel dengan mengidentifikasinya menggunakan buku identifikasi. Setelah
didapatkan Botryococcus braunii kemudian diambil 30 mL larutan sampel dan
dimasukkan kedalam wadah sampel, kemudian sampel didiamkan selam 48 jam untuk
dilakukan tahapan selanjutnya.Persiapan dan pemeliharaan ampel di laboratorium
Pembuatan media ekstrak daun lamtoro
Daun lamtoro yang digunakan dalam pembuatan ekstrak meiliki warna yang
Tahapan awal dalam pembuatan ekstrak daun lamtoro diawali dengan memilih daun
lamtoro yang normal (tidak rusak dan berlubang) dan segar bewarna hijau.
Selanjutnya daun lamtoro dicuci menggunakan air mengalir hingga bersih, setelah
dicuci bersih dan ditiriskan dari air. Selanjutnya ditimbang daun lamtoro sebanyak
100 gram dan ditambahkan 500 mL aquades. Penggunaan akuadest (H2O) yang
merupakan senyawa polar sebagai pelarut dalam pembuatan ekstrak sehingga daat
berikatan senyawa maupun nutrien yang terkandung didalam daun lamtoro (Paul
dengan dalam lalu haluskan dengan menggunakan blender. Setelah halus saring
menggunakan kain satin, kemudian ekstrak daun lamtoro yang telah disaring
kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf selama 15-30 menitkemudian ekstrak
diendapkan selama 24 jam hingga terbentuk dua lapisan (supernatan dan endapan)
ekstrak daun lamtoro yang digunakan adalah bagian supernatan, dan digunakan sesuai
dengan perlakuan yang ditentukan (Septiana, 2016).
Isolasi dan Perbanyakan Botryococcus braunii
Sampel Botryococcus braunii yang telah didiamkan selam 48 jam, kemudian di
isolasi dengan mengambil sampel dengan pipet tetes untuk kemudian diamti kembali
koloni Botryococcus braunii dibawah mikroskop. Kemudian dilakukan isolasi
bertingkat koloni Botryococcus braunii hingga didaptkan 1 koloni. Selanjutnya koloni
tersebut diinokulasi dengan masukkan kedalam media cair dan diinkubasi pada pada
 3

suhu ruangan (25 -28o C) bawah dengan intensitas cahaya perbandingan 16: 8 jam
cahaya penyinaran.
Pengamatan pertumbuhan sel
Pengamatan pertumbuhan Botryococcus braunii dilakukan dengan perhitungan
jumlah sel setiap 24 sekali selama 4-6 minggu. perhitungan dilakukan dengan
mengambil sampel sebanyak 1 ml pada setiap perlakuan dengan menggunakan
mikropipet dan teteskan diatas haemocytometer dan ditutup dengan cover glass lalu
diamati dibawah mkroskop dengan perbesaran 4x10 selanjutnya untuk memudahkan
perhitungan kepadatan sel menggunakan alat hand counter.
Kepadatan sel dihitung menggunakan 5 titik pandang dengan rumus
Jumlaℎ sel dalam5 blok
N ( sel/ml)= x 104
5
Namun bila sampel berada dalam kepadatan yang sangat tinggi dapat melakukan
pengenceran terlebih dahulu sebelum dilakukan perhitungan. Pengenceran dilaukan
dengan mengambil 1 ml sampel dan licampurkan dalam 9 ml aquadest pada gelas
ukur, maka setelah dlakuka pengenceran dapat menggunakan rumus

Jumlaℎ sel dalam5 blok

N ( sel/ml)= xfaktor pengenceran x 104
5

Parameter uji
Uji Kandungan Klorofil
Uji kandungan klorofil dilakuk dengan mengambil 1 ml sampel ke dalam tube dan
disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang berada
diatas endapan dibuang sedangkan endapan yang terbentuk ditambahkan pelarut
aseton dengan perbandingan 9:1 dari jumlah endapan yang terbentuk dan
dihomogenkan dengan vorteks selama 1-2 menit, kemudian sampel disentrifuse
kembali dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya dilakuka
pengukuran sampel dengan spektrofotometer.
Dalam mengukur nilai absorbansi dengan menggunakan pelarut aseton dengan
panjang gelombang 664 nm (klorofil a) dan 647 nm. (klorofil b) dapat memakai
perhitungan (Arnon, 1949 dalam Duarte. et. al, 2020)

Klorofil a : 12.25 ·Abs.664 - 2.55·Abs.647

Klorofil b : 20.31 ·Abs.6476 - 4.91·Abs.664
Klorofil total :17.76 ·Abs.647 + 7.34·Abs.664
 4

Uji Kandungan Karotenoid

Analisis kandungan karotenoid Botryococcus braunii dilakukan dengan mengambil
sampel sebanyak 1 ml kedalam tube dan disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm
selama 5 menit dan terbentuknya endapan. selanjutnya endapan yang tersebut
ditambahkan 0,3 ml ethanol dan 0,55 ml dietil eter , penambahan dietil eter dapat
mempercepat pembacaan sampel pada spektrofotometer. Kemudian sampel di
homogenkan dengan vorteks selama 2 menit lalu ditambahkan 0,2 ml aquadest.
Sampel kemudian dikocok dengan kuat untuk menghomogenkan dan disentrifugasi
kembali dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya sampel diukur
menggunakan panjang gelombang 450 nm pada spektrofotometer dengan hasil
karotenoid yang diperoleh dalam µg/ml. Rumus perhitungan kandungan karotenoid
dapat menggunakan rumus menurut Prieto et al., (2011) dalam Mahardani (2017):

Konsentrasi karotenoid (µg/ml) = 25,2x A450

Keterangan :
25,2 = Nilai konstanta pengkuran karotenoid
A450 = Serapan pada panjang gelombang 450 nm
3.3.2.6 Uji Kandungan Protein
Pembuatan Water solution dan larutan standard
Dalam pembuatan water solution perhitungan dengan meyiapkan 16 sampel dan 3
larutan standar serta 1 tube sampel sehingga totalnya menjadi 20 µLsampel, kemudian
dikali 200 menjadi 4000 µL larutan. Selanjutnya 4000 µL dikurangi dengan 20 µL
sampel sehingga didapatkan 3980 µL qubit protein buffer. Selanjutnya untuk
pembutan larutan standar dengan mengambil 190 µL water solution dan 10 µL larutan
standar 1, 2 dan 3 protein sehingga total larutan menjadi 200 µL,,lalu lautan
dimasukkan kedalam tube dan di vorteks selama beberapa saat untuk
menghomogenkan larutan kemudian diukur range dari ketiga larutan standar
menggunakan alat qubit flurometer.
Pengujian sampel
 5

Pengujian sampel dengan mengambil menimbang sampel yang telah di frezee

drying sebanyak 1 mg kemudian campurkan 1 ml NaCl 0,9 % kedalam tube yang
berisi bite dan di vorteks hingga homegen. Selanjutnya sampel diambil sebanyak 10
µL dan dicampurkan dengan water solution sebanyal 190 µL kedalam tube qubit. Lalu
sampel divorteks hingga homogen untuk uji kandungan proteinnya menggunakn alat
qubit flurometer.

3.3.2.7 Analisis data

Penelitian ini data akan dianalisis dengan metode sidik ragam dengan
menggunakan analisis rancangan acak lengkap (RAL) dengan taraf (satanar error) 5%
(α = 0,5) dan data diolah dengan menggunakan software IBM SPSS Statistic 21.