BAB III

METODE PENLITIAN

3.1 Desain Penelitian

Metode Penelitian pada uji antibakteri ini yaitu Penelitian eksperimental dengan

Cincau Hijau (Cocculus Orbiculatus) untuk menentukan KHM dengan menggunakan

metode difusi terhadap bakteri Escherichia Coli.

3.2 Kerangka Konsep

Variabel Idependen Variabel Dependen

Konsentrasi Cincau hijau
(Cocculus Orbiculatus) dengan
Metose Difusi dengan
konsentrasi 25%, 50%, 75%,
dan 100%.
Efektivitas antibakteri cincau
hijau (Cocculus Orbiculatus)
terhadap bakteri Escherichia
coli dengan cara menghambat

Bagan 3.2 Kerangka Konsep

3.3 Sampel Penelitian

Sampel yang digunakan pada penelitian ini yaitu cincau hijau (Cocculus Orbiculatus)

dari daerah Desa Prabumulih Sumatera Selatan.

3.4 Populasi Penelitian

Populasi pada penelitian ini adalah bakteri Escherichia Coli yang diperoleh dari

Universitas Indonesia.
3.5 Variabel Penelitian

3.5.1 Variabel independen (variabel bebas) :

a. Senyawa yang terkandung dalam cincau hijau (Cocculus orbiculatus)

b. Konsentrasi cincau hijau (Cocculus Orbiculatus) dengan metode difusi 25%, 50%,

75% dan 100%.

3.5.2 Variabel Dependen (variabel terikat) :

Efektivitas antibakteri cincau hijau (Cocculus Orbiculatus) terhadap bakteri

Escherichia Coli.

3.6 Tempat dan Waktu Penelitian

3.6.1 Tempat Penelitian

Tempat Penelitian dilakukan di Laboraturium Mikrobiologi STIK Siti Khadijah

Palembang.

3.6.2 Waktu Penelitian

Waktu Penelitian dilaksanakan pada bulan 2022

3.7 Alat dan Bahan

3.7.1 Alat

Alat yang digunakan pada dalam penelitian ini adalah blender, timbangan digital,

toples kaca gelap untuk maserasi, batang pengaduk, pipet tetes, pinset, gelas ukur,

beaker gelas, tabung reaksi, rak tabung reaksi, cawan petri, jarum ose, inkubator,
 autoclave, rotary evaporator, penjepit tabung reaksi, lampu spiritus, korek api, kapas,

kertas whatman, spidol, jangka sorong, kamera, mikro pipet, dan pipet ukur.

3.7.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun cincau hijau (cocculus

orbiculatus) dari Pasar prabumulih Kota Palembang, Bakteri Escherichia Coli yang didapat

dari Universitas Indonesia etanol 96 persen, Asam Clorida, Amoniak, kloroform, H2SO4

0,3 N, BaCl, reagen mayer, reagen dragendrof, reagen shinoba, Naoh, Asam sulfat pekat,

MgHCL, Pereaksi Lieberman-Burchard, Nutrient agar (NA), Nutrient Broth (NB), Kristal

violet, safranin, alkohol, aquadest, paper disk, dan Cotrimoxazol.

3.8 Prosedur Penelitian

3.8.1 Pembuatan Simplisia cincau hijau (Cocculus Orbiculatus).

Cincau hijau (Cocculus Orbiculatus) yang diambil kemudian dipilih cincau hijau

(Cocculus Orbiculatus) yang mempunyai kualitas baik dan tidak terserang hama.

Selanjutnya cincau hijau (Cocculus Orbiculatus) dibersihkan terlebih dahulu dengan

air yang mengalir. Setelah proses pencucian selesai cincau hijau (Cocculus

Orbiculatus) dirajang. cincau hijau (Cocculus Orbiculatus) yang telah dirajang dengan

tujuan untuk mempercepat proses pengeringan simplisia itu kemudian ranjangan

(Cocculus Orbiculatus) di Jemur di bawah sinar matahari langsung yang dapat

menyebabkan hilangnya kandungan zat kimia didaun cincau hijau (Cocculus

Orbiculatus) tersebut. Setelah rajangan Cincau hijau (Cocculus Orbiculatus) kering

lalu dihaluskan menggunakan blender untuk memperbesar untuk memperbesar luas

permukaan partikel supaya kontak antara zat dan pelarut lebih besar.
 3.8.2 Pembuatan larutan konsentrasi.

Konsentrasi Beratsimplisia Aquadest

25 % 2,5 gram ad 10 ml

50 % 5 gram ad 10 ml

75 % 7,5 gram ad 10 ml

100 % 100 gram ad 10 ml

3.9 Skrining Fitokimia

Menurut Hanani (2017), menyatakan bahwa untuk menguji skrinninfg fitokimia dapat

dilakukan dengan cara sebagai berikut :

a. Identifikasi Alkaloid

Ekstrak sebanyak 2 ml dilarutkan dalam 2 ml asam klorida, dipanaskan 5 menit

dan disaring. Filtrat yang diperoleh ditambah 2-3 tetes perekasi Dragendrof. Adanya

senyawa alkaloid ditunjukkan dengan endapan jingga (Hanani, 2017).

b. Identifikasi Flavonoid

Ekstrak sebanyak 2 ml sampel dilarutkan dalam 2 ml metanol, kemudian

ditambahkan serbuh Mg dan HCL pekat sebanyak 5 tetes. Adanya senyawa flavonoid

ditunjukkan denga terbentuknya warna merah atau jingga (Hanani, 2017).

c. Identifikasi Saponin

Ekstrak Saponin 0,5 gram dalam tabung reaksi ditambahkan 10 ml air panas, di

dinginkan dan kemudian dikocok selama 10 detik. Hasil yang positif dengan

terbentuknya buih yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit, pada penambahan asam

klorida 2 N buih tidak hilang (Hanani, 2017)

d. Identifikasi Steroid atau Triterpenoid

Ekstrak 500 mg ditambahkan etanol 96 persen 2 ml ditambahkan 2 ml kloroform

dan 2 ml H2SO4 yang ditambahkan pada dinding tabung reaksi. Terbentuknya cincin

warna merah menunjukkan adanya steroid (Hapsari, 2017).

e. Identifikasi Tanin

Ekstrak sebanyak 500 mg ditambahkan etanol 96 persen 2 ml kemudia.

Diteteskan FeCl3 3 tetes dan akan terbentuk warna biru, biru-kehijauan, biru-hijau

endapan. Perubahan warna dapat terjadi karena adanya reaksi antara senyawa hidroksil

pada tanin dengan pereaksi (Hanani, 2017).

f. Identifikasi Minyak Atsiri

Dilakukan Ekstrak Sebanyak 1 ml ditambahkan larutan Kalium permanganat,

warna akan terjadi pucat atau hilang ketika dipanaskan akan mengeluarkan bau khas

minyak atsiri (Hanani, 2017).

g. Identifikasi Glikosida

Sebanyak 0,1 ml larutan uji diuapkan diatas penangas air, larutkan sisa dalam 5

ml asam asetat anhidrat P. Tambahkan 10 tetes asam sulfat P terjadi warna biru atau

hijau, menunjukkan adanya glikosida. (Hanani, 2017).

3.9.1 Pembuatan Larutan Uji

1. Pembuatan larutan uji metode difusi cincau hijau (cocculus orbiculatus) dengan

konsentrasi hambat minimum (KHM), pada konsentrasi 25 %, 50%, 75%, dan 100 %.

Konsentrasi Berat Aquadest

Simplisia

25 % 2,5 gram ad 10 ml

50 % 5 gram ad 10 ml

75 % 7,5 gram ad 10 ml

100 % 10 gram ad 10 ml

2. Pembuatan control positif (Cotrimokazol)

Pada penelitian ini control negative menggunakan pelatut aquadest steril.

Sedangkan control positif menggunakan Cotrimokazol. Pembuatan larutan antibiotik

Cotrimokazol yaitu sebanyak 1 gram serbuk Cotrimokazol dilarutkan dengan aquadest

steril 10 ml sehingga diperoleh konsentrasi 10 %(b/v).

3. Pembuatan Pembuatan Media

a. Nutrient Agar (NA)

Timbang sebanyak 2,8 gram serbuk Nutrient Agar (siap pakai), larutkan dalam 100

ml aquadeat lalu panaskan sampai mendidih dan larut seluruhnya. Kemudian

disterilkan dalam autoclaf pada suhu 121 derajat celcius dan selama 15-20 menit.

Media Nutrient agar dituang sebanyak 20 ml kedalam cawan petri dan 10 ml

 kedalam tabung reaksi untuk media agar miring, biarkan memadat, dan disimpan

dalam lemari pendingin.

4. Pembuatan Standar Mac.Farland

Larutan H2SO4 1 persen sebanyak 99,5 ml dicampurkan dengan larutan BaCl2

1persen sebanyak 0,5ml dalam erlemeyer, Kemudian dikocok sampai terbentuk

larutan yang keruh. Kekeruhan Ini dipakai sebagai standar kekeruhan suspensi

bakteri uji.

5. Peremajaan Bakteri

Bakteri yang telah dimurnikan diinokulasi dengan bantuan jarum ose kemedia

agar, kemudian diinkubasikan pada suhu 37 derajat C selama 24-48 jam hingga

diperoleh pertumbuhan.

6.Pembuatan Suspensi Bakteri Biakan bakteri disubkultur dalam media Nutrient agar

diinkubasikan pada suhu 37 derajat celcius selama 24 jam. Hasil subkultur biakan

bakteri diambil dengan jarum ose dan dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi

10 ml larutan Nacl 0,9. Setelah itu di homogenkan dengan cara divoteks dan

disamakan kekeruhannya dengan standar Mac.Farland 0,5 sehingga diperoleh

suspensi bakteri dengan kerapatan sel 10 CFU/ml.yang normal.

3.9.2 Metode Pengolahan dan Analisis Data

Uji Efektivitas antibakteri dengan difusi agar menggunakan kertas cakram dengan

bakteri uji Escherichia coli media agar muller Hinton Agar (MHA) Suhu 40 ℃ sebanyak

10 ml dituangkan kedalam masing-masing cawan petri steril dan goyangkan cawan agar

media merata, diamkan sampai media padat selama 15 menit. Setelah itu usapkan
 suspensi bakteri Escherichia Coli dengan menggunakan ose dan ratakan bakteri.

Lempengan agar dibiarkan mengering selama 5 menit. Kemudian letakkan kertas cakram

steril dan teteskan sesuai konsentrasi 25%, 50%, 75%, dan 100% sebanyak 20 ℳl, serta

teteskan control positif Cotrimokazol 0,1 %, serta control negative aquadest steril.

Setelah itu diinkubasikan pada suhu 37℃ selama 24 jam, pengujian dilakukan sebanyak

3 kali.

Penentuan nilai konsentrasi hambat minimum (KHM) ditandai denga nada atau

tidaknya pertumbuhan bakteri pada media tersebut. Kemudian diukur dengan diameter

zona bening yang terbentuk dengan menggunakan jangka sorong (Sholihah, 2019).

3.10 Metode pengumpulan data

Data-data digunakan pada penelitian ini adalah primer. yaitu Data yang diperoleh dari

hasil penelitian eksperimental di Laboraturium Mikrobiologi STIK Siti Khadijah

Palembang dan data sekunder, yaitu data yang diperoleh selain data pada hasil penelitian,

keperpustakaan dan skripsi yang berkaitan dengan penelitian.

3.11 Analisi Data

Untuk mengetahui data tersebut maka data yang diperoleh dianalisis dengan

menggunakan program statistika SPSS, dan beda nyata antara perlakuan uji dengan one way

ANOVA. One way ANOVA adalah analisi yang menggunakan varians dan pengamatan

yang digunakan untuk mengetahui hubungan dan besar resiko (Odd ratio/OR) variabel bebas

dengan terikan secara sendiri-sendiri dengan uji One way ANOVA sehingga diperoleh nilai

p value, 95 persen CL dan OR.

3.12 Defenisi Operasional

 Tabel 3.12 Defenisi Operasional

No Variabel Defenisi Alat Ukur Cara Ukur Hasil Ukur Skala Ukur
Metode pengumpulan data

Data-data digunakan pada penelitian ini adalah primer. yaitu Data yang diperoleh dari hasil
penelitian eksperimental di Laboraturium Mikrobiologi STIK Siti Khadijah Palembang dan data
sekunder, yaitu data yang diperoleh selain data pada hasil penelitian, keperpustakaan dan skripsi
yang berkaitan dengan penelitian.

Analisi Data

Untuk mengetahui data tersebut maka data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan
program statistika SPSS, dan beda nyata antara perlakuan uji dengan one way ANOVA. One
way ANOVA adalah analisi yang menggunakan varians dan pengamatan yang digunakan untuk
mengetahui hubungan dan besar resiko (Odd ratio/OR) variabel bebas dengan terikan secara
sendiri-sendiri dengan uji One way ANOVA sehingga diperoleh nilai p value, 95 persen CL dan
OR.