BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Jenis dan Desain Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimen dengan

desain penelitian menentukan daya hambat bakteriosin yang dihasilkan oleh

Lactobacillus sp terhadap pertumbuhan P.aeruginosa pada Media Mueller Hinton.

3.2 Populasi dan Sampel

Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah BAL Lactobacillus

sp yang berada di Laboratorium Teknologi Pangan Institut Pertanian Bogor.

Sampel yang digunakan adalah isolat murni L.bulgaricus, L.acidophilus,

dan L.casei yang diperoleh dari Laboratorium Teknologi Pangan Institut Pertanian

Bogor.

Bakteri uji yang digunakan adalah isolat murni P.aeruginosa yang

diperoleh dari Laboratorium Farmakologi-Toksikologi Sekolah Farmasi Institut

Teknologi Bandung.

3.3 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Politeknik Kesehatan

Kementerian Kesehatan Bandung Jurusan Analis Kesehatan pada bulan Mei

sampai dengan bulan Juni 2014.

15
 16

3.4 Rencana Pengumpulan Data

Data dalam penelitian ini merupakan data primer. Data primer tersebut

diperoleh dari hasil pengamatan daya hambat bakteriosin terhadap pertumbuhan

P.aeruginosa pada media Mueller Hinton Agar dan Mueller Hinton Broth.

Pengujian daya hambat bakteriosin terhadap pertumbuhan P.aeruginosa masing-

masing dilakukan sebanyak 3 kali (triplo). Selanjutnya data yang diperoleh

disajikan dalam bentuk tabel.

3.4.1 Metode Pemeriksaan

Penelitian ini menggunakan dua metode yaitu :

- Metode : Difusi sumur (hole method)

Prinsip : P.aeruginosa diinokulasikan pada MH agar kemudian

dibuat sumur ditambah ekstrak kasar bakteriosin, semakin jauh dari titik

difusi maka semakin rendah kekuatan bakteriosin untuk menghambat

pertumbuhan bakteri.

- Metode : Mikrodilusi

Prinsip : Suspensi bakteri ditambah bakteriosin, semakin tinggi

pengenceran bakteriosin maka semakin rendah kekuatan bakteriosin untuk

menghambat pertumbuhan bakteri.

3.4.2 Alat dan Bahan

3.4.2.1 Alat

- Cawan petri
 17

- Tabung reaksi

- Rak tabung

- Ose bulat dan ose tusuk

- Spirtus

- Kaca objek

- Erlenmeyer 250 mL

- Gelas kimia 500 mL

- Gelas ukur 100 mL

- Mikropipet

- Tip biru dan tip kuning steril

- Lidi Kapas steril

- Milipore ø 0,22 μm

- Corong kecil

- Tabung ependorf

- Inkubator

- Oven

- otoklaf

- Neraca teknis

- Jangka sorong

- Ultra centrifuge

- Microwell plat

- Bio safety cabinet

 18

3.4.2.2 Bahan

- Isolat L.bulgaricus, L.acidophilus, dan L.casei.

- Isolat P.aeruginosa

- Isolat Enterococcus faecalis

- Media Mac Conkey agar

- Media Mueller Hinton agar dan Mueller Hinton broth

- NaCl fisiologis steril

- Aquades steril

- Media MRS broth

- Media uji biokimia gula-gula panjang (Glukosa, Laktosa, Manitol,

Maltosa, Sukrosa, Indol, TSIA, Urea, MR, VP, Simon sitrat, dan Semi

solid)

- Larutan BaCl2 1%

- Larutan H2SO4 1%

- Reagen zat pewarnaan Gram

- Xilol dam minyak imersi

- Antibiotik ciprofloksasin dan tetrasiklin

3.4.3 Cara Kerja

3.4.3.1 Sterilisasi Alat

Dicuci bersih semua alat-alat gelas yang digunakan dalam

penelitian, kemudian dikeringkan lalu dibungkus dengan kertas coklat dan

 19

dimasukkan ke dalam oven pada suhu 180o C selama 1 jam atau pada suhu

160o C selama 2 jam.

3.4.3.2 Pembuatan Media Mueller Hinton Agar

Pembuatan media Mueller Hinton (MH) agar adalah dengan cara

dilarutkan 38 g bubuk MH agar dengan 1000 mL aquades ke dalam labu

erlemneyer, kemudian dipanaskan hingga homogen. Media MH disterilkan

dalam otoklaf selama 15 menit pada suhu 121 o C. kemudian diangkat dan

tunggu sampai suhu media ± 40o C lalu dituangkan ke dalam cawan petri

dengan jumlah tuangan ± 20 mL pada setiap cawan petri secara aseptik

didiamkan sampai beku.

3.4.3.3 Pembuatan Media Mac Conkey Agar

Ditimbang sebanyak 50 g serbuk MC Agar, dimasukkan ke dalam

labu Erlenmeyer kemudian ditambahkan 1000 mL aquadest, lalu

dididihkan sampai agar larut. Selanjutnya labu Erlenmeyer ditutup dengan

kain kassa dimasukkan ke dalam otoklaf, disterilkan pada suhu 1210C

selama 15 menit. Setelah itu dituangkan secara aseptik ke dalam cawan

petri steril sebanyak ± 20 mL secara merata, didiamkan sampai beku.

3.4.3.4 Pembuatan Media Mueller Hinton Broth

Pembuatan media Mueller Hinton (MH) broth adalah dengan cara

dilarutkan 38 g bubuk MH broth dengan 1000 mL aquades ke dalam gelas

 20

kimia, kemudian dipanaskan hingga homogen. Media MH broth kemudian

dimasukan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 10 mL

kemudian ditutup dengan kapas kassa lalu dibungkus dengan kertas coklat.

Media MH broth disterilkan dalam otoklaf selama 15 menit pada suhu

121o C kemudian diangkat.

3.4.3.5 Pembuatan Media MRS Broth

Pembuatan media MRS broth adalah dengan cara dilarutkan 52 g

bubuk MRS broth dengan 1000 mL aquades ke dalam gelas kimia,

kemudian dipanaskan hingga homogen. Media MRS broth kemudian

dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 10 mL

kemudian ditutup dengan kapas kassa lalu dibungkus dengan kertas coklat.

Media MRS broth disterilkan dalam otoklaf selama 15 menit pada suhu

121o C kemudian diangkat.

3.4.3.6 Pembuatan Standar Mc Farland 0,5

Disediakan tabung reaksi yang bersih, kering dan steril, kemudian

diisi larutan asam sulfat (H2SO4) 1% sebanyak 9,95 mL dan Larutan

barium klorida (BaCl2) 1% sebanyak 0,05 mL kemudian dikocok. Endapan

barium sulfat (BaSO4) yang terbentuk dalam tabung setara dengan jumlah

bakteri 1,5 x 108 CFU/mL.

 21

3.4.3.7 Pembuatan Ekstrak Kasar Bakteriosin

Isolat L.bulgaricus, L.acidophilus, dan L.casei masing-masing

ditanam pada MRS broth, kemudian diinkubasi pada suhu 35o C selama

24 jam. Kemudian suspensi isolat tersebut disentrifugasi dengan kecepatan

8000 rpm selama 30 menit pada suhu 4o C, supernatan yang terbentuk

disaring dengan milipore filter ø 0,22 μm dan filtrat yang didapatkan

merupakan ekstrak kasar bakteriosin.

3.4.3.8 Pembuatan Suspensi P.aeruginosa

Disediakan tabung reaksi yang bersih, kering, dan steril kemudian

dimasukkan NaCl fisiologis masing-masing sebanyak 10 mL. Diambil

menggunakan ose beberapa koloni bakteri dari biakan murni P.aeruginosa

kemudian dicampur dalam tabung reaksi sampai homogen, lalu

dibandingkan kekeruhan yang terjadi dengan standar Mc Farland 0,5.

3.4.3.9 Uji Penegasan

1) Uji penegasan P.aeruginosa yang dilakukan meliputi:

- Pemeriksaan mikroskopis

Isolat murni P.aeruginosa dibuat pulasan kemudian diwarnai dengan

pewarnaan Gram. Setelah diwarnai, preparat tersebut diamati dibawah

mikroskop dengan lensa objektif 100x menggunakan minyak imersi.

- Isolasi
 22

Isolasi dilakukan dengan penanaman Isolat murni P.aeruginosa pada

media Mac Conkey agar, diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam.

- Uji Biokimia

Koloni yang tumbuh pada MC agar diambil dengan ose lalu ditanam

pada uji biokimia (Glukosa, Laktosa, Manitol, Maltosa, Sukrosa,

Indol, TSIA, Urea, MR, VP, Simon sitrat, dan Semi solid) diinkubasi

pada suhu 37o C selama 24 jam.

2) Uji penegasan Lactobacillus sp yang dilakukan meliputi:

- Pemeriksaan mikroskopis

Isolat murni L.bulgaricus, L.acidophilus dan L.casei dibuat pulasan

kemudian diwarnai dengan pewarnaan Gram. Setelah diwarnai,

masing-masing preparat tersebut diamati dibawah mikroskop dengan

lensa objektif 100x menggunakan minyak imersi.

- Uji Biokimia

Isolati murni L.bulgaricus, L.acidophilus dan L.casei masing-masing

ditanam pada media uji biokimia (Glukosa, Laktosa,Manitol, Maltosa,

Sukrosa, Indol, TSIA, Urea, MR, VP, Simon sitrat, dan Semi solid)

diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam.

3.4.3.10 Uji Penelitian

1) Metode Difusi Sumur (Hole Methode)

- Disiapkan alat dan bahan yang deperlukan.

 23

- Dibuat ekstrak kasar bakteriosin.

- Dengan menggunakan lidi kapas steril dipulaskan suspensi bakteri

P.aeruginosa yang setara dengan standar Mc Farland 0,5 pada

permukaan media MH agar secara merata dan aseptik.

- Dibuat lubang atau sumur dengan menggunakan tabung kecil steril (ø

± 1 cm) pada MH agar yang telah dipulaskan suspensi bakteri

P.aeruginosa.

- Dipipet ekstrak kasar bakteriosin dengan menggunakan mikropipet

sebanyak 50 μL kemudian dimasukkan ke dalam sumur.

- Dilakukan pengujian sebanyak 3 kali (triplo) pada setiap jenis ekstrak

kasar bakteriosin yang sama.

- Dibuat kontrol positif (+) menggunakan antibiotik ciprofloksasin dan

kontrol negatif (-) menggunakan NaCl fisiologis, aquades steril dan

MRS broth.

- Diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam dalam inkubator.

- Diamati adanya zona hambat yang terbentuk terhadap pertumbuhan

P.aeruginosa di sekitar sumur yang telah ditambahkan ekstrak kasar

bakteriosin.

- Zona hambat diukur dengan menggunakan jangka sorong dan dicatat

diameter zona hambat yang terbentuk.

 24

2) Metode Mikrodilusi

- Disiapkan plat microwell 12 kolom yang bersih, kering, dan steril.

Dipipet sebanyak 100 μL MH broth kemudian dimasukkan pada

masing-masing kolom.

- Kolom 1 dan 3 ditambahkan 100 μL sampel bakteriosin kemudian

dihomogenkan. kolom 1 sebagai kontrol positif (+).

- Dari kolom 3 diambil 100 μL kemudian dipindahkan ke kolom 4

(pengenceran sampel bakteriosin). Pengenceran dilakukan sampai

kolom ke 12 yang memiliki konsentrasi terkecil. Pada kolom 12

kelebihan sampel dibuang.

- Pada kolom 2-12 dimasukkan sebanyak 100 μL suspensi bakteri

P.aeruginosa yang setara dengan standar Mc Farland 0,5 kemudian

dihomogenkan, kolom 2 sebagai kontrol negatif (-).

- Microwell diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam. Konsentrasi

terkecil yang tidak ada pertumbuhan bakteri (jernih) adalah

Konsentrasi Hambat Minimum (KHM).

- Sebanyak 1 ose setiap bagian jernih dipindahkan pada MH agar,

diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam, kemudian dibaca hasil.

Konsentrasi terkecil yang tidak ada pertumbuhan bakteri adalah

Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM).

 25

Isolat murni P.aeruginosa

Langsung Tidak Langsung

pewarnaan Gram Ditanam pada media MC agar

Uji Biokimia

Gula-gula Panjang

Glukosa Laktosa Manitol Maltosa Sukrosa Indol TSIA Urea MR VP SC SS

Gambar 3.1 Skema Uji Penegasan P.aeruginosa

 26

Isolat murni L.bulgaricus, L.acidophilus dan L.casei

Langsung Tidak Langsung

pewarnaan Gram Uji Biokimia Gula-gula Panjang

Glukosa Laktosa Manitol Maltosa Sukrosa Indol TSIA Urea MR VP SC SS

Gambar 3.2 Skema Uji Penegasan L.bulgaricus, L.acidophilus dan L.casei

 27

Isolat L.bulgaricus, L.acidophilus, dan L.casei

10 mL MRS broth

Di inkubasi suhu 35o C selama 24 jam

Sentrifugasi 8000 rpm, selama 30 menit pada suhu 4o C

Supernatan disaring dengan milipore ø 0,22 μm

Ekstrak kasar bakteriosin

Gambar 3.3 Skema Pembuatan Bakteriosin

 28

Mc Farland 0,5 suspensi P.aeruginosa

MH Agar

3 sampel Bakteriosin
@ 50 μL diuji
sebanyak 3 kali (triplo)

Diinkubasi suhu 37o C selama 24 jam

diamati ada tidaknya zona hambat dan diukur diameternya

Gambar 3.4 Skema Kerja Uji Penelitian P.aeruginosa metode difusi

 29

Mc Farland 0,5 P.aeruginosa

Kolom 2-12 dimasukkan

Kolom 1 dan 3 100 μL suspensi bakteri uji

+ 100μL Bakteriosin

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
K+ K- ½ ¼ 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024

100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL
dibuang

kolom 1-12 dimasukkan 100 μL MH broth

Diinkubasi suhu 37o C selama 24 jam

Hasil dibaca. Konsentrasi terkecil yang tidak ada pertumbuhan(KHM).

5 μL dari setiap bagian jernih ditanam pada MH agar

Diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam

Hasil dibaca. Konsentrasi terkecil yang tidak ada pertumbuhan koloni (KBM).

Gambar 3.5 Skema Kerja Uji Penelitian P.aeruginosa metode mikrodilusi