TEKNIK LABORATORIUM

MIKROBIOLOGI

Oleh

Dra. Yulneriwarni, Msi

Dra. Noverita, MSi.

FAKULTAS BIOLOGI
UNIVERSITAS NASIONAL JAKARTA
2020

25
 BAB III

ISOLASI MIKROORAGANISME

Tujuan

1. Untuk mempelajari teknik isolasi bakteri dan jamur

2. Mengisolasi bakteri dan jamur dari berbagai sumber
3. Untuk mendapatkan kultur murni

Pendahuluanm

Populasi mikroorganisme di alam baik di tanah, air, udara, maupun yang

berinteraksi dengan manusia, hewan dan tanaman, tidak terdapat secara terpisah
atau tersendiri melainkan bercampur dengan jenis mikroorganisme lain, Dilain
hal, keberadaan mikroorganisme disuatu habitat ataupun substrat penting untuk
diketahui atau dipelajari baik dibidang industri, pangan, kesehatan dan lain
sebagainya. Misalnya mencari mikroorganisme yang berpotensi dalam industri
kimia, mendeteksi keberadaan suatu mikroorganisme patogen pada pangan atau
mendeteksi mikroorganisme penyebab penyakit guna menegakkan diagnosis pada
pasien dan sebagainya. Agar mendapatkan suatu jenis mikroorganisme untuk
keperluan tersebut, maka langkah pertama yang harus dilakukan adalah
mengisolasi atau memisahkan sel mikroorganisme dari campuran/lingkungannya.
Satu koloni terpisah yang tumbuh dalam medium diasumsikan berasal dari satu
sel mikroorganisme, yang selanjutnya harus dipindahkan secara aseptik supaya
tidak terjadi kontaminasi kedalam medium baru dan disebut sebagai kultur murni.
Teknik pemisahan suatu sel mikroorganisme dari lingkungannya dapat
dilakukan dengan dua cara, yakni dengan metoda streak plate atau penipisan
Koch dan metoda pengenceran.

- Metoda Penipisan Koch

Merupakan suatu metoda yang relatif cepat, yakni dengan menggoreskan
secuplik mikroorganisme dari sample atau kultur campuran menggunakan
Jarum ose ke atas permukaan agar cawan (gambar 3.1).

26
 Gambar 3.1: Isolasi mikroorganisme dengan metoda penipisan Koch
a. Teknik penipisan Koch b. Hasil Isolasi

- Metoda Pengenceran

Pada metoda ini sampel yang mengandung mikroorganisme diencerkan

beberapa kali untuk mendapatkan koloni yang terpisah ketika ditumbuhkan
dalam medium yang sesuai seperti terlihat pada gambar 3.2. Pada prinsipnya
sampel dengan konsentrasi tinggi mengandung lebih banyak mikroorganisme,
sehingga koloni yang tumbuh cendrung lebih rapat dan sulit dipisahkan,
sebaliknya sampel dengan konsetrasi rendah mengandung lebih sedikit
mikroorganisme, sehingga akan tumbuh dengan membentuk koloni yang
terpisah satu sama lain.

Gambar 3.2: Isolasi mikroorganisme dengan metoda pengenceran

27
A. Teknik Isolasi Mikroorganisme dengan Metoda Penipisan Koch
Bahan dan Alat
1. Kultur campuran mikroorganisme
2. Agar cawan steril
3. Jarum ose
4. Lampu spirtus
Cara Kerja
1. Sterilkan jarum ose
2. Ambil cuplikan kultur dengan Jarum ose. Mulut tabung kultur harus
selalu dipanaskan sebelum dan setelah mengambil kultur.
3. Goreskan Jarum ose berisi sampel pada area pertama agar cawan steril
kira-kira 10 kali.
4. Bakar kembali Jarum ose, dinginkan sejenak. Putar posisi cawan ke
area kedua. Ambil biakan dari goresan terakhir pada area pertama,
kemudian goreskan pada area kedua 5-10 kali
5. Kerjakan hal no 4 untuk area ketiga dan seterusnya, terakhir sterilkan
kembali Jarum ose (gambar 3.3).
6. Inkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam
7. Amati pertumbuhan koloni, pindahkan koloni terpisah ke dalam
medium baru untuk mendapatkan kultur murni

Gambar 3.3: Teknik isolasi mikroorganisme dengan metoda penipisan Koch

28
B. Teknik Isolasi Mikroorganisme dengan Metoda Pengenceran
Bahan dan Alat
1. Kultur campuran mikroorganisme
2. Larutan fisiologis (NaCl 0,9%) steril
3. Medium Nutrient Agar
4. Pipet volumetri 10 mL dan 1 mL steril
5. Erlenmeyer dan tabung reaksi steril
6. Cawan steril
7. Vortex
8. Lampu spirtus
Cara Kerja
1. Buat seri pengenceran sampel 10-1, 10-2, 10-3, 10-4dan 10-5 dengan
menggunakan larutan fisiologis sebagai pengencer.
a. Pengenceran 10-1: Pipet 10 ml sampel masukkan kedalam 90 ml
larutan fisiologis, kocok sampai homogen.
b. Pengenceran 10-2: Pipet 1 mL sampel pengenceran 10-1 masukkan
kedalam 9 mL larutan fisiologis, kocok sampai homogen dengan
menggunakan vortex.
c. Pengenceran 10-3: Pipet 1 mL sampel pengenceran 10-2 masukkan
kedalam 9 mL larutan fisiologis, kocok sampai homogen.
d. Pengenceran 10-4: Pipet 1 mL sampel pengenceran 10-3 masukkan
kedalam 9 mL larutan fisiologis, kocok sampai homogen.
e. Pengenceran 105: Pipet 1 mL sampel pengenceran 10-4 masukkan
kedalam 9 mL larutan fisiologis, kocok sampai homogen.
2. Ambil 1 mL sampel dari setiap pengenceran, masukkan kedalam
cawan steril.
3. Tuangkan medium nutrient agar cair (suhu ± 45°C) sebanyak 15 -20
mL pada setiap cawan (no 2) dan sampel di aduk secara merata.
4. Setelah medium memadat, inkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.
5. Amati pertumbuhan koloni, pindahkan koloni terpisah ke dalam
medium baru untuk mendapatkan kultur murni.

29
C. Isolasi Mikroorganisme Dari Berbagai Sumber

1. Isolasi Mikroorganisme Dari Tanah

Tanah mengandung, air, oksigen, senyawa organik dan anorganik sebagai

penunjang kehidupan mikroorganisme. Sehingga tanah mengandung banyak lebih
jenis mikroorganisme baik yang merugikan ataupun yang menguntungkan. Jenis
dan jumlah mikroorganisme dalam tanah dipengaruhi oleh jumlah dan macam
nutrien yang tersedia kedalaman tanah, kelembaban, oksigen, pH, suhu, kualitas
dan sifat tanah.

Bahan Dan Alat

a. Sampel tanah
b. Medium nutrient broth 100 mL dalam Erlenmeyer
c. Medium nutrient agar dalam cawan untuk isolasi bakteri
d. Medium potato dekstrosa agar dalam cawan untuk isolasi jamur
e. Soil Corer
f. Jarum ose
g. Lampu spirtus

Cara Kerja
a. Ambil sampel tanah menggunakan corer pada kedalaman 10 cm
dibawah permukaan dan masukkan kedalam kantong plastik secara
aseptik
b. Sampel tanah sebanyak ± 10 gr masukkan kedalam medium nutrien
broth, dikocok merata dan biarkan pada suhu kamar selama 1 jam
c. Sterilkan Jarum ose, kemudian ambil cuplikan sampel tanah dalam
medium nutrient broth dan inokulasikan secara penipisan Koch pada
medium nutrient agar dan potato dekstrosa agar
d. Untuk isolasi bakteri, kultur pada medium nutrient agar diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam. Sedangkan untuk isolasi jamur kultur
pada medium potato deksrosa agar diinkubasi pada suhu kamar
selama 4- 7 hari

30
 e. Amati morfologi koloni yang tumbuh pada setiap medium.
f. Untuk mendapatkan kultur murni, maka koloni bakteri terpilih di
pindahkan kedalam medium nutrien agar (agar miring), diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam, sedangkan koloni jamur terpilih
dipindahkan kedalam medium potato dekstrosa agar (agar miring),
dan diinkubasi pada suhu kamar selama 4-7 hari.

2. Isolasi Mikroorganisme Dari Air

Air tawar mengandung mikroorganisme yang berasal dari tanah, dan

mungkin terkontaminasi oleh mikroorganisme yang berasal dari limbah industri,
rumah tangga dan dari faeces yang berasal dari hewan dan manusia. Beberapa
mikroorganisme tanah dapat hidup secara normal dalam air tawar, tapi sangat
sedikit yang dapat hidup diair laut. Mikroorganisme air laut tumbuh lebih baik
pada konsentrasi garam tinggi dan beberapa tidak dapat hidup pada air tawar.
Untuk mengisolasi mikroorganisme dari air, maka kondisi medium seperti pH dan
salinitas harus disesuaikan dengan habitat alami asal mikroorganisme.

Bahan Dan Alat

a. Sampel air
b. Medium nutrient broth 100 mL dalam Erlenmeyer
c. Medium nutrient agar dalam cawan untuk isolasi bakteri
d. Medium potato dekstrosa agar dalam cawan untuk isolasi jamur
e. Jarum ose
f. Lampu spirtus

Cara Kerja
a. Ambil sampel air dengan menggunakan botol sampling secara aseptik.
Jumlah air dalam sampel tidak boleh terlalu penuh (3/4 botol) untuk
menjaga kondisi tetap aerob.

31
 b. Sterilkan jarum ose, kemudian ambil cuplikan sampel air dan
inokulasikan secara penipisan Koch pada medium nutrient agar dan
potato dekstrosa agar
c. Untuk isolasi bakteri, kultur pada medium nutrient agar diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam. Sedangkan untuk isolasi jamur kultur
pada medium potato deksrosa agar diinkubasi pada suhu kamar
selama 4- 7 hari
d. Amati morfologi koloni yang tumbuh pada setiap medium.
e. Untuk mendapatkan kultur murni, maka koloni bakteri terpilih di
pindahkan kedalam medium nutrien agar (agar miring), diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam, sedangkan koloni jamur terpilih
dipindahkan kedalam medium potato dekstrosa agar (agar miring) dan
diinkubasi pada suhu kamar selama 4-7 hari.

3. Isolasi Mikroorganisme Dari Udara

Udara merupakan habitat sementara bagi mikroorganisme.

Mikroorganisme udara dapat berasal dari air, tanah, manusia, hewan dan tanaman.
Sel mikroorganisme berada dalam udara hanya sebagai kontaminan bersama
debu/tetesan ludah dan sebagainya. Populasi mikroorganisme di udara
dipengaruhi oleh kondisi lingkungan seperti sinar matahari, suhu, kelembaban dan
sebagainya.

Bahan Dan Alat

a. Medium nutrient agar dalam cawan untuk isolasi bakteri
b. Medium potato dekstrosa agar dalam cawan untuk isolasi jamur

Cara kerja
a. Medium agar cawan nutrient agar maupun potato dekstrosa agar,
dibiarkan terbuka pada lokasi yang telah ditentukan selama 30 menit.
b. Untuk isolasi bakteri, kultur pada medium nutrient agar diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam. Sedangkan untuk isolasi jamur kultur

32
 pada medium potato deksrosa agar diinkubasi pada suhu kamar
selama 4- 7 hari
c. Amati morfologi koloni yang tumbuh pada setiap medium.
d. Untuk mendapatkan kultur murni, maka koloni bakteri terpilih di
pindahkan kedalam medium nutrien agar (agar miring), diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam, sedangkan koloni jamur terpilih
dipindahkan kedalam medium potato dekstrosa agar (agar miring) dan
diinkubasi pada suhu kamar selama 4-7 hari.

4. Isolasi Mikroorganisme Dari Makanan

Makanan mengandung sejumlah nutrient yang dibutuhkan oleh

mikroorganisme untuk pertumbuhan, seperti karbohidrat, protein, lipid, air,
mineral dan vitamin. Mikroorganisme yang dapat hidup dalam makanan adalah
kelompok heterotrof, yakni kelompok mikroorganisme menggunakan senyawa
organik sebagai sumber karbon dan energi. Mikroorganisme pada makanan dapat
berasal dari bahan makanan itu sendiri secara alami, ataupun merupakan
kontaminan yang berasal air, tanah, udara, manusia mapun hewan, atau sebagai
fermentatif atau biopreservatif yang sengaja ditambahkan pada saat proses
pengolahan. Keberadaan mikroorganisme dalam pangan tergantung komposisi
nutrient, pH, aw, salinitas, suhu, tekanan osmotik, proses pengolahan, interaksi
antar mikroorganisme dalam makanan dan lain-lain.

Bahan Dan Alat

a. Sampel makanan
b. Medium nutrient broth 100 mL dalam Erlenmeyer
c. Medium nutrient agar dalam cawan untuk isolasi bakteri
d. Medium potato dekstrosa agar dalam cawan untuk isolasi jamur
e. Jarum ose
f. Lampu spirtus

33
 Cara Kerja
a. Sampel makanan secara presentatif (mewakili sebanyak ± 10 gr
masukkan kedalam medium nutrien broth, dikocok merata dan
biarkan pada suhu kamar selama 1 jam
b. Sterilkan jarum ose, kemudian ambil cuplikan sampel makanan dalam
medium nutrient broth dan inokulasikan secara penipisan Koch pada
medium nutrient agar dan potato dekstrosa agar
c. Untuk isolasi bakteri, kultur pada medium nutrient agar diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam. Sedangkan untuk isolasi jamur kultur
pada medium potato deksrosa agar diinkubasi pada suhu kamar
selama 4- 7 hari
d. Amati morfologi koloni yang tumbuh pada setiap medium.
e. Untuk mendapatkan kultur murni, maka koloni bakteri terpilih di
pindahkan kedalam medium nutrien agar (agar miring), diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam, sedangkan koloni jamur terpilih
dipindahkan kedalam medium potato dekstrosa agar (agar miring),
dan diinkubasi pada suhu kamar selama 4-7 hari.

5. Isolasi Mikroorganisme Dari Tanaman

Mikroorganisme pada tanaman dapat ditemukan pada hampir semua

bagian, yakni batang, daun, bunga, buah dan akar. Interaksi mikroorganisme
dengan tanaman dapat merugikan ataupun menguntungkan. Beberapa jenis
mikroorganisme yang hidup pada tanaman ada yang bersifat patogen
menimbulkan penyakit pada tanaman, sebaliknya keberadaan mikroorganisme
pada tanaman juga ada yang menguntungkan, seperti penyediaan unsur hara yang
diperlukan tanaman, menghambat perkembangan patogen tumbuhan,
menghasilkan hormon yang dapat merangsang pertumbuhan tanaman tersebut.
Keberadaan mikroorganisme pada tanaman dipengaruhi oleh beberapa faktor,
antara lain jenis nutrient yang tersedia pada tanaman, kandungan air, oksigen, pH,
suhu dan kelembaban,

34
 Bahan Dan Alat
a. Bagian tanaman sebagai sampel (akar, daun, ranting/batang)
b. Medium nutrient broth 100 mL dalam Erlenmeyer
c. Medium nutrient agar dalam cawan untuk isolasi bakteri
d. Medium potato dekstrosa agar dalam cawan untuk isolasi jamur
e. Jarum ose
f. Lampu spirtus

Cara Kerja
a. Sepotong kecil sampel masukkan kedalam medium nutrien broth, dan
dibiarkan pada suhu kamar selama 2 jam
b. Sterilkan jarum ose, kemudian ambil cuplikan sampel dalam medium
nutrient broth dan inokulasikan secara penipisan Koch pada medium
nutrient agar dan potato dekstrosa agar
c. Untuk isolasi bakteri, kultur pada medium nutrient agar diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam. Sedangkan untuk isolasi jamur kultur
pada medium potato deksrosa agar diinkubasi pada suhu kamar
selama 4- 7 hari
d. Amati morfologi koloni yang tumbuh pada setiap medium.
e. Untuk mendapatkan kultur murni, maka koloni bakteri terpilih di
pindahkan kedalam medium nutrien agar (agar miring), diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam, sedangkan koloni jamur terpilih
dipindahkan kedalam medium potato dekstrosa agar (agar miring),
dan diinkubasi pada suhu kamar selama 4-7 hari.

6. Isolasi Mikroorganisme dari Manusia

Mikroorganisme pada tubuh manusia secara normal dapat ditemukan di

kulit, mulut, nasopharynx, telinga, mata, saluran pernafasan, saluran pencernaan,
saluran urin dan saluran reproduksi. Sementara itu pada tubuh manusia bagian
dalam seperti jaringan, darah dan urin adalah steril, kecuali bila dalam keaadan
terinfeksi. Mikroorganisme yang ditemukan pada tubuh manusia dapat bersifat

35
normal, patogen, oportunis atau probiotik. Populasi mikroorganisme pada tubuh
manusia dipengaruhi oleh: pH, suhu, kelembaban, nutrien yang tersedia dan
substansi inhibitor.

Bahan Dan Alat

a. Medium nutrient agar dalam cawan untuk isolasi bakteri
b. Medium potato dekstrosa agar dalam cawan untuk isolasi jamur
c. Swab steril
d. Lampu spirtus

Cara Kerja
a. Pengambilan sampel dilakukan tergantung pada jenis sampel.
1) Sampel pada permukaan kulit, mata, hidung, tenggorakan, anus
diambil dengan menggunakan swab steril
2) Sampel dari air saliva, sputum dan urin ditampung dalam botol
sampel steril
b. Inokulasi ke dalam medium nutrient agar dan potato dekstrosa agar
c. Untuk isolasi bakteri, kultur pada medium nutrient agar diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam. Sedangkan untuk isolasi jamur kultur
pada medium potato deksrosa agar diinkubasi pada suhu kamar
selama 4- 7 hari
d. Amati morfologi koloni yang tumbuh pada setiap medium.
e. Untuk mendapatkan kultur murni, maka koloni bakteri terpilih di
pindahkan kedalam medium nutrien agar (agar miring), diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam, sedangkan koloni jamur terpilih
dipindahkan kedalam medium potato dekstrosa agar (agar miring),
dan diinkubasi pada suhu kamar selama 4-7 hari.

36
D. Teknik Pembiakan Mikroorganisme

Pembiakan mikroorganisme dapat dilakukan untuk berbagai tujuan, antara

lain: meremajakan atau mempermuda umur biakan, memperbanyak jumlah
mikroorganisme, memindahkan mikroorganisme dari suatu medium ke medium
lain untuk berbagai keperluan dalam laboratorium, memisahkan koloni yang
tumbuh dalam suatu medium dan lain-lain.

Bahan dan Alat

1. Kultur mikroorganisme dalam medium padat dan cair
2. Nutrient Agar miring
3. Nutrint agar semi solid
4. Nutrient Broth
5. Jarum ose
6. Lampu spirtus

Cara Kerja

1. Beri label (nama mikroorganisme dan tanggal inokulasi) pada tabung

medium yang akan diinokulasi.
2. Sterilkan jarum ose
3. Buka tutup tabung kultur dan panaskan mulut tabung dengan
melewatkan di atas nyala api, dinginkan jarum ose dipinggir dalam
tabung, kemudian ambil cuplikan kultur.
4. Panaskan kembali mulut tabung kultur sebelum ditutup.
5. Inokulasikan kultur kedalam medium baru yang steril secara aseptik
(lakukan dekat api menyala dan mulut tabung medium selalu
dipanaskan sebelum dan setelah inokulasi):
a. Jika menggunakan medium agar miring, maka inokulasikan
dengan cara menggoreskan secara zigzag dari ujung sampai
kepangkal medium,
b. Jika menggunakan medium semisolid, maka inokulasikan dengan
cara menusukkan pada posisi tengah ke ujung medium.

37
 c. Jika menggunakan medium cair, maka inokulasikan dengan cara
mengocok kedalam medium
6. Sterilkan kembali jarum inolukasi
7. Inkubasi biakan baru, untuk bakteri pada suhu 37°C selama 24 jam,
sedangkan untuk jamur pada suhu kamar selama 4-7 hari.
8. Simpan biakan dalam lemari es untuk menghentikan pertumbuhan
atau untuk memelihara biakan mikroorganisme mikroorganisme.

38