BAB V

ISOLASI, PEMBIAKAN ,
PEREMAJAAN &
PENYIMPANAN MIKROBA
ISOLASI MIKROBA
 Populasi mikroba di alam (tanah atau air)
sangat besar dan kompleks, tidak terpisah
sendiri menurut jenisnya tetapi terdiri dari
berbagai macam sel.

 Isolasi merupakan cara untuk memisahkan

atau memindahkan mikroba tertentu dari
lingkungannya, sehingga diperoleh kultur
murni atau biakan murni
ISOLASI MIKROBA
 Kultur murni adalah kultur yang sel-sel mikrobanya
berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal.

 Kultur murni sangat berguna didalam mikrobiologi

yaitu untuk menelaah dan mengidentifikasi
mikroorganisme.

 Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu

dilakukan pengambilan sampel.
 1. Sampel Tanah
 Didalam tanah keadaan mikroba sangat beragam baik
jumlah jenis, kepadatan populasi maupun aktifitas
fungsionalnya

 Berbagai jenis mikroba telah diketahui bermanfaat

bagi kesuburan tanah dan tanaman seperti mikroba
penambat nitrogen, fospor, dan penghasil hormon
pertumbuhan.

 Pengambilan sampel tanah disesuaikan dengan tujuan

dan kebutuhan
Pengambilan Sampel Tanah
 Sampel Tanah
1. Pengambilan Contoh
2. Kedalaman Pengambilan
3. Bahan, Peralatan dan Sterilisasi
4. Prosedur
5. Penyimpanan
Pengambilan Contoh Sampel Tanah (1)

 Pengambilan contoh tanah rhizofir/rhizoplane

dilakukan dengan :
1. Menggali tanah disekitar perakaran secara
perlahan-lahan
2. Akar di pisahkan dari bongkahan tanah besar dan
membiarkan sebanyak mungkin tanah yang
melekat di akar.
3. Secepat mungkin, akar beserta tanah dimasukkan
ke dalam kantong palastik dan diberi label
Pengambilan ContohSampel Tanah (2)

4. Dimasukkan ke dalam kotak berisi es

(termos) agar tidak cepat kering.

5. Contoh tanah secepat mungkin dibawa ke

laboratorium dan segera dianalisis untuk
menghindari perubahan dramatis terhadap
populasi dan aktivitas mikroba.
Kedalaman Pengambilan
 Tanah pertanian, contoh tanah diambil pada
lapisan olah (kedalaman 20 cm)

 Tanah padang rumput dan semak, contoh

tanah diambil pada lapisan tanah padat akar
(kedalaman 10 cm)
Bahan, Peralatan dan Sterilisasi
 Bahan dan Peralatan :
Sekop, bor tanah, kantong plastik, pisau/gunting,
ember/ baskom plastik (+/- 20 L), kotak es, kertas label.
Untuk contoh tanah anaerobik diperlukan botol yang
dilengkapi tutup & selotip

 Sterilisasi dilakukan dengan mencuci peralatan dengan

air bersih, kemudian di bilas dengan etil alkohol 95% &
dievaporasi dengan nyala api
Prosedur
 Tempat pengambilan contoh tanah terlebih dahulu
dibersihkan
 Contoh individu diambil di beberapa tempat dengan
ukuran dan berat yang sama dengan menggunakan
rangka besi /kayu yang berukuran 20cm x 20 cm dan
tinggi 10 atau 20 cm.
 Rangka ditekan ke dalam tanah
 Tanah bagian dalam diambil menggunakan sendok tanah
 Bor tanah untuk pengambilan contoh tanah yg lebih
dalam.
Penyimpanan
 Penyimpanan contoh tanah tidak dianjurkan,
kecuali jika jumlah sampel terlalu banyak dan tidak
dapat segera di analisis.
 Tekstrur tanah, kandungan air awal, waktu dan
suhu penyimpanan berpengaruh terhadap parameter
biomassa dan aktivitas mikroba.
 Penyimpanan contoh tanah dalam jangka pendek (4
minggu) pada suhu 2-4ºC
 Penyimpanan jangka panjang, dengan pembekuan -
20ºC
2. Pengambilan Sampel Air
 Pengambilan sampel air disesuaikan dengan
keadaan air itu sendiri.

a. Air sungai yang mengalir , botol dicelupkan

miring dengan bibir botol melawan arus air.
b. Air yang tenang, botol dapat dicelupkan dengan
tali.
c. Air keran, maka sebelumnya air keran dialirkan
beberapa saat dan mulut keran di bakar
Gambar cara-cara pengambilan sampel air

(a) (b)
(c)
Isolasi Mikroba
 Metode yang digunakan untuk mengisolasi bakteri,
kapang dan khamir dengan metode gores, metode
tuang, metode sebar, metode pengenceran dan
micromanipulator.
 Paling sering digunakan adalah teknik tuang dan
cawan gores.
 Prinsip kedua metode tersebut adalah mengencerkan
organisme sedemikian rupa sehingga spesies
individu dapat dipisahkan dari lainnya.
METODE PEMBIAKAN & PEREMAJAAN

 Pembiakan atau peremajaan adalah proses

perbanyakan organisme melalui penyediaan kondisi
lingkungan yang sesuai.

 Dalam pertumbuhan dan pembiakan

mikroorganisme akan mengadopsi nutrisi kedalam
sel hingga terjadi konversi nutrisi menjadi senyawa
yang dibutuhkan oleh mikroorganisme sehingga
terjadi pembelahan sel.
1. Metode Pembiakan
Istilah-istilah dalam pembiakan mikroba :
 Biakan murni :

Biakan yang terdiri atas satu spesies yang

ditumbuhkan dalam medium buatan.
 Piaraan campuran & piaraan murni

 Sterilisasi

Proses membebaskan/pemusnahan dengan

cara membunuh mikroorganisme pada suatu
bahan/peralatan
 Media (Medium)
Suatu substrat untuk menumbuhkan dan
mengembangbiakkan mikroba yang steril dari
mikroba lain.
 Media yang digunakan :
1. PCA (Plate Count Agar); media pertumbuhan bakteri
2. PDA (Potato Dextrose Agar); media pertumbuhan
khamir dan kapang
3. Pepton ; bahan pengencer
Macam-macam Media Pertumbuhan
1) Berdasarkan sifat fisik (bentuk)

 Medium padat : mengandung agar 15% sehingga setelah

dingin media menjadi padat. Digunakan untuk bakteri,
ragi, jamur dan kapang mikroalgae

 Medium setengah padat : mengandung 0,3-0,4% agar

sehingga menjadi agak kenyal, tidak padat, tidak begitu
cair. Digunakan untuk mikroba yg memerlukan air &
anaerobik

 Medium Cair : tidak mengandung agar/tidak ditambah

zat pemadat. Contohnya NB (Nutrient Broth), LB
(Lactose Broth). Digunakan untuk bakteri & ragi
Macam-macam Media Pertumbuhan
2) Berdasarkan komposisi (susunan)

 Medium sintesis : komposisi zat kimianya diketahui jenis dan

takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Concey Agar.

 Medium semi sintesis : sebagian komposisinya diketahui secara

pasti, misalnya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar,
dextrosa dan ekstrak kentang (komposisi senyawa penyusunnya
tidak diketahui secara detail).

 Medium non sintesis/alami : dibuat dengan komposisi yg tidak

diketahui secara pasti dan langsung diekstrak dari bahan dasarnya,
misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic
Extract
Macam-macam Media Pertumbuhan
3) Berdasarkan tujuan penggunaan (a)

 Media untuk isolasi : mengandung semua senyawa esensial untuk

pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth , Blood Agar

 Media selektif/penghambat : dibuat untuk menekan pertumbuhan

bakteri yang tidak diinginkan dan meningkatkan pertumbuhan
bakteri yang diinginkan. Contoh Luria Bertani , Salt Broth

 Media diperkaya (enrichment) : mengandung komponen dasar

untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks
seperti darah, serum, kuning telur. Contohnya Blood Tellurite
Agar, Bile Agar, Serum Agar
Macam-macam Media Pertumbuhan
3) Berdasarkan tujuan penggunaan (b)

 Media untuk peremajaan kultur :

 Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi

spesifik : digunakan untuk menganalisis
metabolisme suatu mikroba . Contoh Koser’s
Citrate Medium digunakan untuk menguji
kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai
sumber karbon.
Macam-macam Media Pertumbuhan
3) Berdasarkan tujuan penggunaan (c)

 Media untuk karakterisasi bakteri : digunakan untuk

mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang-
kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya
perubahan warna. Contoh Nitrate Broth, Lactose Broth,
Arginine Agar

 Media diferensial : dibuat untuk memudahkan mengenali

koloni organisme yang diinginkan. Bertujuan untuk
mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar
karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial.
Contoh TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Penanaman Mikroba (Inokulasi)
Tahap yang dilakukan sebelum melakukan teknik
penanaman mikroba, yaitu :

1. Menyiapkan ruangan
 Ruang tempat inokulasi kecil, bersih dan bebas angin.
 Dapat juga dilakukan didalam kotak berkaca (ent-
kas)
 Dalam laboratorium untuk membuat vaksin atau
serum maka udara yang masuk ruangan dilewatkan
pada saringan yang disinari sinar ultra ungu.
Ruang Inokulasi

(ent-kas)
Penanaman Mikroba (Inokulasi)
2. Pemindahan dengan inokulasi

 Ujung kawat inokulasi terbuat dari platina atau dari mikrom.

Bentuknya lurus atau lingkaran dengan diameter 1-3 mm.
 Ujung kawat dipijarkan sisanya cukup dilewatkan pada nyala
api, kemudian dinginkan.
 Mulut tabung tempat pemiaraan dipanasi sebelum sumbat
dibuka dan setelah pengambilan inokulum (sampel mikroba).
 Ujung kawat disentuhkan pada koloni dan digesekkan pada
medium baru.
Teknik Penanaman Mikroba
Untuk mendapatkan biakan murni dapat
dilakukan dengan teknik-teknik berikut :

 1. Teknik Pengenceran
 2. Teknik Penggoresan Agar

 3. Teknik Agar Tuang

 4. Teknik Agar Sebar

 5. Teknik Agar Tusuk

1. Teknik Pengenceran

 Sampel suspensi yang berisi campuran bermacam-

macam spesies diencerkan dalam suatu tabung.
 Dari tabung diambil 1 ml sampel untuk diencerkan
lebih lanjut.
 Jika pengenceran ketiga diambil 0,1 ml disebarkan
pada suatu medium, tumbuh satu jenis koloni maka
disebut koloni murni.
 Jika belum yakin satu jenis koloni saja, maka
mengulang pengenceran dengan koloni akhir sebagai
sampel.
Gambar Teknik
Pengenceran
2. Teknik Penggoresan Agar (i)

 Teknik ini lebih menguntungkan dari segi ekonomi

dan waktu, tetapi memerlukan keterampilan.

 Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan

koloni yang terpisah.

 Teknik-teknik goresan meliputi : Goresan T,

Goresan kuadran, Goresan Radian dan Goresan
Sinambung
Teknik Gores T Teknik Gores Radian
2. Teknik Penggoresan Agar (ii)

 Hal-hal yang diperhatikan

1. Mendinginkan ose yang telah dipijarkan

2. Saat menggores di lempengan agar, dibiarkan
meluncur diatas permukaan lempengan.
3. Pijarkan ose setelah digunakan
4. Gunakan tutup cawan petri
5. Balikkan lempengan agar untuk mencegah
kondensasi air
3. Teknik Agar Tuang

 Dilakukan pengenceran satu mata lup suspensi

mikroba ke dalam tiga tabung agar tuang, sehingga
akan diperoleh lempengan dengan jumlah bakteri
yang optimum untuk isolasi.

 Teknik ini lebih mudah karena untuk mendapatkan

koloni yang terpisah tidak diperlukan keterampilan
seperti teknik penggoresan.
Gambar Teknik Agar Tuang

Biakan
4. Teknik Agar Sebar
 Pengenceran contoh dilakukan seperti teknik agar
tuang
 Ambil 0,1 ml cairan dari botol pengencer dan biarkan
cairan mengalir ke atas permukaan agar.
 Sebarkan dengan alat penyebar terbuat dari gelas/kaca.
 Alat penyebar disterilisasi dengan alkohol dan
pemanasan.
 Penyebaran dilakukan dengan memutar lempengan
agar
Peralatan Teknik Agar Sebar
Gambar Teknik Agar Sebar
5. Teknik Agar Tusuk

 Metode tusuk yaitu dengan cara meneteskan

atau menusukkan ujung jarum ose yang
didalamnya terdapat inokulum (biakan
bakteri). Kemudian dimasukkan ke dalam
media.
Gambar Teknik Agar Tusuk
Pemindahan Biakan
 Dilakukan dengan teknik aseptik untuk
mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan
berulang kali.

 Pemindahan mikroorganisme dapat ditumbuhkan dalam

media cair maupun media padat (agar miring atau agar
lempeng)

 Agar miring digunakan untuk menyimpan biakan

murni, sedangkan agar lempeng digunakan untuk
memurnikan mikroba
Cara Pemindahan Biakan (1)
Hari Pertama
 Siapkan bahan berupa biakan ( E.coli /Bacillus
subtilis/ St aphylococcus epidermidis)
 Tandai 3 tabung (nutrient broth/agar miring)
dengan nama, tanggal dan biakan yang
diinokulasikan.
 Lakukan inokulasi sesuai dengan gambar
 Inkubasi biakan pada kaldu / agar miring pada suhu
35ºC selama 24 jam.
Cara Pemindahan Biakan (2)
Hari kedua
 Periksa pertumbuhan pada kaldu biakan dengan
melihat kekeruhan, ada tidaknya pelikel atau
sedimen.
 Tentukan jenis pertumbuhan pada setiap kaldu
biakan
 Amati pula pertumbuhan pada media agar miring
 Melaporkan hasil pertumbuhan.
Pertumbuhan biakan murni ke media cair

 Pertumbuhan mikroba dalam kaldu (media cair)

menggambarkan aktivitas metabolisme.
 Mikroba aerob obligat berkembang baik pada lapisan
permukaan karena terkandung oksigen tinggi dan
membentuk pelikel.
 Mikroba yang membentuk filamen, kapsel atau pili juga
membentuk lapisan tipis pada permukaan kaldu
 Mikroba yang bergerak dalam kaldu menyebabkan
kekeruhan.
 Mikroba yang tidak bergerak menumpuk pada bagian
dasar dan membentuk sediment.
Gambar Pertumbuhan mikroba dalam medium cair
Gambar Pertumbuhan mikroba dalam medium agar miring
2. Peremajaan Mikroba
 Peremajaan dengan cara memindahkan atau
memperbaharui biakan mikroba dari biakan
lama ke medium tumbuh yang baru secara
berkala

 Waktu sebulan atau dua bulan sekali.

 Peremajaan tidak dianjurkan untuk penyimpanan
dalam jangka panjang disebabkan karena :

 Kemungkinan terjadi perubahan genetik melalui

seleksi varian
 Peluang terjadinya kontaminasi
 Terjadi kekeliruan pemberian label.
Prosedur umum untuk meremajakan biakan murni
(isolat) adalah :

1. Isolat dikeluarkan dari lemari pendingin, diamkan

beberapa saat agar mencapai suhu ruang
2. Siapkan media agar cawan
3. Ambil kultur di dalam agar miring dan digoreskan
secara aseptis ke media agar cawan
4. Inkubasi agar cawan didalam suhu ruang selama
2-3 hari
5. Setelah isolat tampak tumbuh, bisa digunakan
untuk produksi mikroba.
METODE PENYIMPANAN MIKROBA

Biakan murni biasanya disimpan dalam media agar miring dan

disimpan dalam lemari es

Metode penyimpanan mikroba sangat tergantung pada sifat

mikroba yang meliputi :
Ciri-ciri morfologi mikroba (bakteri, kapang, khamir, virus
dll)
Ciri-ciri fisiologi dan biokimia mikroba
Kemampuan mikroba bertahan hidup baik dalam lingkungan
alamiyah maupun lingkungan buatan.
Tujuan penyimpanan mikroba
Tujuan jangka pendek
Untuk keperluan rutin penelitian yang disesuaikan
dengan kegiatan atau proyek tertentu.
Metode pemindahan secara berkala.

Tujuan jangka panjang

Untuk koleksi dan konservasi plasma nutfah mikroba
Metode liofilisasi / kering beku (freeze drying) dan
(cyrogenic preservation)
Freeze Drying
Thank
You