PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

P1

PEMBUATAN MEDIA DAN ISOLASI BAKTERI

NAMA : Alifathun Nurwinda Sari

NIM : 2100023122

KELAS : 1B

GOL :3

KEL :1

DOSEN : Ibu Dr.rer.nat.apt. Sri Mulyaningsih,M.Si

LABORATORIUM BIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS AHMAD DAHLAN

YOGYAKRATA

2021
 PEMBUATAN MEDIA DAN ISOLASI BAKTERI

A. Tujuan

1. Mahasiswa mampu membuat dan menyeterilkan media untuk uji mikrobiologi.

2. Mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari campurannya sehingga didapat kultur

murni.

B. Teori

1. Media

Pembiakan mikrobia di laboratorium memerlukan media yang berisi zat hara serta
lingkungan pertumbuhan yang sesuai bagi mikroba. Media adalah suatu bahan yang
digunakan untuk menumbuhkan mikroba yang terdiri atas campuran nutrisi atau zat-zat
makanan. Selain untuk menumbuhkan mikroba, media dapat juga digunakan untuk isolasi,
memperbanyak, pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba (Lay, 1994;
Jutono dkk,
1980).

Media harus mengandung semua kebutuhan untuk pertumbuhan mikroba, yaitu:

sumber energi (contoh: gula), sumber nitrogen, juga ion inorganik essensial dan kebutuhan
yang khusus, seperti vitamin (Jawetz dkk, 1996).

Berdasarkan komposisi kimianya, media dapat dibedakan menjadi media sintetik

yaitu media yang susunan kimianya diketahui dengan pasti, medium ini biasanya digunakan
untuk mempelajari kebutuhan makanan mikroba. Media non sintetik (kompleks) yaitu media
yang susunan kimianya tidak dapat diketahui dengan pasti, media ini digunakan untuk
menumbuhkan dan mempelajari taksonomi mikroba. Berdasarkan konsistensinya media
dapat
dibedakan menjadi : media cair, media padat, dan media padat yang dapat dicairkan (Lay,
1994; Jutono dkk, 1980; Jawetz dkk, 1996).

Untuk mendapatkan lingkungan kehidupan yang cocok bagi pertumbuhan bakteri,

maka pembuatan media harus memenuhi syarat-syarat media dalam hal :

1. Susunan makanan

2. Tekanan osmose
3. Derajat keasaman

4. Temperatur

5. Sterilisasi

Suatu media pertumbuhan harus mengandung air, sumber karbon seperti CO 2, CH 4,

citrat, tartrat, alkohol, dan gula (misal glukosa, laktosa, maltosa, dan sebagainya). Komponen
lain adalah sumber nitrogen (NO 2, NO3, NH 3, asam amino, polopeptida atau pepton),
mineral (Na, K, Mg, Zn, P, S, Cl), vitamin dan gas (O 2 atau CO 2).

Media yang digunakan harus isotonis, sebab apabila hipertonis maka bakteri akan
mengalami plasmoptysis, sedang bila hipotonis, maka akan terjadi plasmolisis.

Tipe Media :

1. Berdasarkan konsistensinya :

a. Media padat, baik datar, miring maupun tegak

b. Setengah padat, misal : SSS (Semi Solid Sucrose medium) MIO (Motility Indol
Ornithine)

c. Media cair, seperti media gula, media kaldu, kaldu pepton, kaldu darah. dan lain-
lain

2. Media basal

Digunakan sebagai bahan dasar untuk membuat media lain yang lebih komplek.
misalnya : kaldu agar, kaldu pepton, air pepton.

3. Enriched Media (Media diperkaya)

Adalah media basal yang ditambah dengan zat-zat pendukung sehingga kuman yang
sukar tumbuh, dapat tumbuh lebih baik, misal : agar darah, agar serum, agar chocolat, kaldu
serum

4. Enrichment Media (Media pembiakan / penyubur)

Adalah media cair yang digunakan untuk memisahkan organisme dari organisme yang

lain, yang tumbuh lebih subur dalam kultur. Media tersebut berisi zat untuk menghambat
organisme yang tidak diinginkan, atau zat untuk mempersubur spesies organisme yang
diperlukan. Misal : Medium selenit F, Kaldu tetrationat, Kaldu briliant green, Media alkali
pepton cair.

5. Media Selektif

Media padat ini mempunyai susunan sedemikian rupa sehingga kuman yang dicari
akan tumbuh dengan koloni yang khas, sedang kuman yang lain kurang khas. Misal : Agar
McConkey, Media Endo, DCLS Agar untuk isolasi kuman perut. Kuman perut
(enterobakteri) yang tidak memecah laktosa (Non lactose Fermented) misalnya : Samonella,
Shigella, Proteus dan lain-lain akan terlihat jernih/transparan, sedang yang memecah laktosa
akan berwarna merah.

2. Isolasi Bakteri

Mikroorganisme adalah adalah mahluk hidup yang terbagi 3 yaitu yang bersifat
eukariotik, prokariotik, dan virus. Baik ketiga jenis mikroorganime ini dalam kehidupannya
memerlukan makanan untuk pertumbuhannya. Dalam percobaan mikrobiologi, tidak dapat
diamati suatu mikroorganisme yang diinginkan tanpa adanya medium, yang merupakan
tempat tumbuh mikroorganisme tersebut. Dalam medium harus terpenuhi segala kebutuhan
mikroorganisme untuk melangsungkan kehidupannya, seperti senyawa organik (protein,
lemak, mineral dan vitamin). Untuk mendukung suatu penelitian terhadap mikroorganisme,
diperlukan suatu tempat atau lingkungan bagi pertumbuhan dan perkembangan
mikroorganisme. Mikroorgaisme tentunya memerlukan sumber atau medium pertumbuhan
yang khas sesuai dengan kebutuhan akan zat-zat atau mineral bagi perkembangan serta
reproduksinya. mikroorganisme pada dasarnya dapat hidup dan tumbuh dimana saja di muka
bumi ini. (Hamriani dkk, 2010)

Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari
campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi
menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan
kemampuan biokimiawinya.

Teknik Pengambilan Sampel Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan

pengambilan sampel.

a. Sampel tanah
 Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka cara
pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang diinginkan
mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan
hingga ujung perakaran.

b. Sampel air

Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika berasal dari
air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air.
Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali,
jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa
saat dan mulut kran dibakar.

Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)

a. Teknik Preparasi Suspensi Sampel

Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari
teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke
dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparsi bergantung kepada
bentuk sampel :

1). Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki
permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut.
Contohnya adalah meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud
memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan
sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan
atraktan semisal pepton water.

2). Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan
substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan
prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9
(w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades
45 ml yang terdapat dalam beaker glass.

3). Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar
dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian
dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antara lain bakso, biji, buah dll. Perbandingan
antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Untuk sampel dari tanah
tak perlu dimaserasi.

b. Teknik Pengenceran Bertingkat

Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah

mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat
pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan
perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga
pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.

c. Teknik Penanaman

1). Teknik penanaman dari suspensi sampel

Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan

suspense dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi
(mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.

a). Goresan Sinambung

Cara kerja :

· Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah
permukaan agar.

· Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis. Goresan
sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk
peremajaan ke cawan atau medium baru.

b). Goresan T

Cara kerja :

· Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker

· Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag

· Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah
2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna

· Lakukan hal yang sama pada daerah 3

c). Goresan Kuadran (Streak quadrant)

Caranya hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu
dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel
mikroorganisma. Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama
sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.

Cara Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah :

 Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis dan
selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8

 Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate pada medium
NA, setelah selesai, diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam

 Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni yang relative
terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali

 Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru dengan teknik
streak kuadran

 Inkubasi 1x24 jam.

Cara Isolasi Jamur dari Tanah :

 Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80oC selama 30 menit
dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan

 Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung pengenceran
bertingkat

 Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate ke media PDA
yang ditambah streptomycin atau penicillin. Kemudian diinkubnasi pada suhu ruang 5- 7 hari

 Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru,

 Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari.

C. Alat dan Bahan

1. Alat :

a. Pembuatan media:
  Cawan petri
 Erlenmeyer
 Pengaduk
 Timbangan
 Gelas Beker
 Spatula
 Hot plate dan magnetik stirrer
 Aluminiumfoil
 Otoklaf, LAF atau Enkas.
b. Isolasi Bakteri:
 Laminar air flow (LAF)/ Biosafety Cabinet (BSC)
 Cawan petri
 Ose,
 Spreader
 Lampu spiritus
 Tabung reaksi

2. Bahan:

a. Pembuatan media:

 Akuades
 Media MHA (38g/L)
c. Isolasi Bakteri:
 Air sumur
 Media agar Mueller Hinton (MHA)
 Larutan NaCl 0,9%

D. Cara Kerja

1. Pembuatan Media MHA ( Mueller Hinton Agar)

Langkah-Langkah Pembuatan Media MHA 100ml

 Hitung terlebih dahulu pembuatan 100 ml media MHA (38gr/1liter)

 100𝑚𝑙 x 38 gr = 3,8 gr

1000𝑚𝑙

Jadi, MHA yang akan digunakan sebanyak 3,8 gr dalam 100ml

 Timbang serbuk MHA 3,8 gr untuk pembuatan 100ml media.

 Masukkan serbuk kedalam labu Erlenmeyer dan ditambahkan Aquades (sesuaikan

volume yang akandibuat) 100 ml.

 Kocok media dalam Erlenmeyer, setelah tercampur semua (larut) tutup Erlenmeyer
menggunakan alumunium foil, setelah di tutup kocok lagi.

 Selanjutnya, sterilsasikan media dalam autoklaf. Sterilsakikan media dengan autoklaf

umumnya dilakukan pada suhu 1210C selama 15-20 menit (PERHATIAN :jangan
membuka autoklaf saat tekanan masih tinggi). Setelah autoklaf turun (menunjukkan
angka nol), buka tutup autoklaf dan keluarkan labu Erlenmeyer.

 Tuang media dalam petri diss (saat media agak hangat). Masing-masing petri berisi
20-25 ml. setelah itu tutup petri.

 Dinginkan media pada suhu kamar sampai memadat dan siap digunakan untuk
membuka mikroba.

Cara bekerja di laboratoriumse cara aseptic

1. Sebelum bekerja, semprot terlebih dahulu meja dengan etanol 70%

2. Nyalakan lampu busen

3. Semprot tenggan lagi dengan etanol 70%

Preparasi Sampel

Siapkan sampel yang akan diisolasi (bakar gelas ukur sebentar) dan masukkan sampel
kedalam gelas uku dan bakar lagi (sebentar saja). Setelah itu, suspensikan sampel NaCl

Teknik Isolasi Bakteri Dengan Metode Cawan Gores Dan Cawan Sebar

1. Penanaman Bakteri Dengan Cawan Gores

a. Sebelum menanam bakteri, sterilkan ose bulat dilampu busen (dibakar hingga memijar)

b. Tes ose dengan cara ; ditempelkan di pinggir media agar

c. Selanjutnya, celupkan ose pada media suspense sampel (NaCl dan sampel yang diisolasi)

d. Goreskan ose pada media agar dengan gotesan T

e. Setelah ose di gunakan, Sterilkan ose lagi di atas lampu sipiritus

2. Penanaman Bakteri Dengan Metode Cawan Sebar

a. Sterilkan terlebih dahulu spreader glass dengan busen/lampu sipiritus (dibakar)

b. Selanjutnya, Tes sprider glass dengan ditempelkan diujung/pinggir media agar

c. Setelah itu, ambil 0,100ml suspense sampel dan teteskan pada media agar

d. Ratakan suspensi (dioles) sampel pada permukaan agar menggunakan spreader glass

e. Setelah di gunakan sterilkan kembali spreader glass (dibakar diatas busen)

f. Setelah media ditanam sampel, selanjutnya diikubasi dalam incubator

INKUBASI BAKTERI :

a. Diinkubasi pada suhu 370C selama 18-24 jam

b. Setelah 24 jam keluarkan biakan dalam inkubator

c. Amati pertumbuhan bakteri pada media

d. Amati peetumbuhan bakteri pada media

Parameter Kultur Murni

Isolasi mikroba dari koloni tunggal tujuan akhri menumbuhkan bekteri pada media padat
untuk menumbuhkan single colony.

1. Sterilkan ose (dibakar) sampai memijar pada lampu sipiritus/busen

2. Ambil 1koloni dengan ose yang sudah disterilkan (ambil satu koloni pada cawan gores dan
goreskan pada media)

3. Sterilkan ose lagi hingga memijar

4. Ambil satu koloni tunggal pada cawan sebar dan goreskan pada media.

5. Gores dengan goresan siambung

6. Inkubasi media dalam incubator harus pada suhu 370C selama 18-24 jam

7. Setelah 24 jam, keluarkan biakan media dalam incubator

8. Amati adanya pertumbuhan single koloni pada setiap media dan amati keseragaman koloni
yang tumbuh menunjukkan kultur murni