2.

1 Pengertian Biakan Murni

Dalam Pertumbuhan dan perkembangan mikroba, diperlukan substrat yang disebut media. Sebelum
dipergunakan media harus dalam keadaan steril. Susunan bahan, baik berbentuk bahan alami (seperti
toge, kentang, daging, telur, wortel dan sebagainya) ataupun bahan buatan (berbentuk senyawa kimia
baik organik ataupun anorganik) dipergunakan untuk pertumbuhan dan perkembangan mikroba,
dinamakan media (Monroetiboti, 2010).
Medium adalah bahan yang biasa digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di atas atau di
dalamnya. Langkah awal yang dilakukan sebelum menumbuhkan mikroorganisme adalah dengan
memahami kebutuhan dasar lalu mencoba memformulasikan satu media yang memberikan hasil
terbaik. Persyaratan nutrient mikroorganisme-mikroorganisme sangat beragam, namun sebagai
makhluk hidup mempunyai kebutuhan dasar yang sama, yaitu meliputi air, karbon, energi, mineral
dan faktor tumbuhan ( Hadioetomo, 1993).
Dalam pemurnian mikroba dikenal istilah yaitu isolasi mikroba dan kultur murni. Isolasi mikroba
adalah memindahkan mikroba dengan lingkungannya dengan mengisolasi mikroba bakteri yang
diperlukan atau dengan kata lain mikroba yang tidak kita butuhkan segera di singkirkan, sehingga
diperoleh kultur murni atau biakan murni (Trianda, 2011).
Kultur murni adalah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal,
artinya mikroba ditumbuhkembangkan dari bakteri yang dihomogenkan dengan kata lain bakteri di
isolasikan agar didapatkan bakteri murni yang dibutuhkan nantinya dalam kegiatan praktikum. Objek
yang harus diperhatikan adalah bakteri (Surbakti, 2010).
Di dalam mengisolasi mikroorganisme digunakan berbagai cara, antara lain dengan cara goresan
(streak plate), cara taburan/tuang (pour plate) cara sebar (spread plate), cara pengenceran (dilution
method), serta micromanipulator (teh micromanipulator method). Dua diantaranya yang paling sering
digunakan adalah teknik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip
yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehinga individu spesies individu spesies
dapat dipisahkan dari lainnya (Hadioetomo, 1993).
Beberapa factor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikroba yaitu sebagai berikut :
1. Sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi.
2. Tempat hidup atau asal mikroba tersebut.
3. Medium untuk pertumbuhan yang sesuai.
4. Cara menginokulasi mikroba.
5. Cara inkubasi mikroba.
6. Cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa kultur murni dan sesuai dengan yang
dimaksud.
7. Cara memelihara agar mikroba yang telah diisolasi tetap merupakan kultur murni (Dwidjoseputro,
1994).
Usaha mencegah masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan dan untuk menanam suatu spesies
terdapat beberapa cara yaitu :
1. Penanaman dengan penggoresan : cara ini untuk mengasingkan kuman agar didapatkan biakan
murni.
2. Biakan agar tabung : biasanya diperhunakan untuk menunjukkan adanya pertumbuhan murni mikro
untuk aglutinasi gelas alas.
3. Biakan tusukan : biasanya diperhunakan untuk menunjukkan adanya pencairan gelatin dan
mempertahankan biakan baru.
4. Biakan agar tuang : menunjukkan jumlah koloni mikroba hidup yang terdapat pada suspensi.
5. Biakan cairan : kegunaannya untuk menunjukkan biakan yang banyak dan cepat. Kerugiannya
adalah tidak dapat membuat biakan murni dari bahan yang mengandung berbagai mikroorganisme
(Dwidjoseputro, 1994).

Di alam bebas tidak ada mikroba yang hidup tersendiri terlepas dari spesies yang lain seringkali
mikroba patogen kedapatan secara bersama-sama dengan mikroba saprobe (saprobakteri). Dalam
teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan murni, tetapi juga
bagaimana memelihara serta mencegah pencernaan dari luar. Medium untuk membiakan mikroba
haruslah steril sebelum digunakan pencermaran (kontaminasi) dari luar terutama berasal dari udara
yang mengandung banyak mikroorganisme. Teknik biakan murni untuk spesies dikenal dengan
beberapa cara yaitu :
A. Cara pengenceran
Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun 1865. Lister berhasil menerima murni
Streptococcus lactis yang diisolasi dari susu yang sudah masam. Caranya adalah dengan
mengencerkan suatu suspensi kemudian diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari pengenceran
ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi, kalau perlu dari enceran yang kedua ini diambil 1
ml untuk diencerkan lebih lanjut.
B. Cara penuangan
Isolasi dengan menggunakan medium cair dengan cara pengenceran, seperti dijelaskan diatas prinsip
melakukan pengeceran adalah menurunkan jumlah mikroorganisme sehingga suatu saat hanya
ditemukan suatu sel dalam satu tabung. Demikian juga dengan cara penuangan.
metode ini pertama kali dilakukan oelh Robert Koch (1843-1905). Caranya adalah dengan mengambil
sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel itu kemudian disebarkan dalam
suatu medium dari kaldu dan gelatin encer.
C. Cara penggoresan
Cara ini lebih menggunakan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu tetapi memerlukan
keterampilan yang diperoleh dari latihan penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang
terpisah. Tetapi kelemahan cara ini adalah bakteri-bakteri anaerob tidak dapat tumbuh.
Ada beberapa teknik penggoresan, yakni :
a. Goresan T
1. Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar cawan petri.
2. Inokulasikan daerah 1 sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung.
3. Panaskan ose dan biarkan dingin kembali.
4. Gores ulang daerah 1 sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan didaerah 2
5. Pijarkan kembali ose dan biarkan dingin kembali.
6. Prosedur diatas diulangi untuk daerah 2.
b. Goresan kuadran, teknik ini sama dengan goresan T hanya lempengan agar dibagi menjadi 4.
c. Goresan radian.
1. Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan.
2. Pijarkan ose dan dinginkan kembali.
3. Putar lempengan agar 90C dan buat goresan terputus diatas goresan sebelumnya.
4. Pijarkan ose.
d. Cara sinambung.
1. Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah permukaan lempengan agar.
2. Jangan pijarkan ose, putar lempengan 180C gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa
permukaan lempengan agar.
D. Cara penyebaran.
Pengenceran sampel sama seperti pada cara-cara penuangan, dengan memipet sebanyak 0,1 ml cairan
dari botol pengencer dan biarkan cairan mengalir keatas permukaan agar.
E. Cara pengucilan 1 sel.
Cara ini dengan menggunakan suatu alat yang dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak
bakteri, dengan tanpa ikutnya bakteri yang lain.alat semacam ini tidak mudah untuk
menggunakannya. Alat itu berupa mikropipet yang ditempatkan pada suatu micromanipulator.
F. Cara inokulasi pada hewan
Metode ini didasarkan pada kenyataan bahwa tidak semua bakteri dapat tumbuh didalam tubuh seekor
hewan. Misalnya, kita ambil bahan pemeriksaan berupa dahak (sputum) dari seseorang yang disangka
memderita TBC, bila dahak disuntikkan kedalam tubuh tikus putih, maka sproba akan ikut serta,
tetapi tidak dapat bertahan hidup. Sehingga kemudian hanya kita dapatkan kuman TBC saja. Biakan
murni Pneumococcus dapat diperoleh dengan cara demikian juga (Schlegel, 1994).

Dua masalah akan dibicarakan pemilihan medium yang sesuai dan isolasi organism bakteri secara
murni.
Teknik yang digunakan dan tipe medium yang dipilih tergantung pada sifat penelitian. Pada umumnya
tiga situasi dapat ditemukan.
a) Menumbuhkan sel spesies tertentu, mikroorganisme yang teramati secara mikroskopik dan yang
tumbuh dalam lingkungan alami dapat terbentuk sangat sukar untuk tumbuh secara murni pada
medium buatan, contohnya, bentuk parasit terbentuk tidak pernah dapat dibiakkan diluar inangnya.
b) Pemeriksaan mikrobiologi bahan-bahan alami : bahan alami tertentu mengandung berbagai
lingkungan mikro yang berbeda, masing-masing menyediakan tempat untuk spesies yang berbeda.
Penanaman sebuah contoh bahan kelompok terseleksi memproduksi koloni-koloni tetapi
menyebabkan banyak tipe lainnya terlupakan
c) Isolasi tipe tertentu mikroorganisme. Sedikit contoh tanah, jika ditanam dengan tepat, akan
menghasilkan tipe organism yang berbeda untuk tiap lingkungan mikro yang ada.

Medium cair digunakan untuk membiarkan adanya persaingan dan seleksi optimal meskipun tipe
yang diinginkan hanya beberapa sel saja diantara populasi yang jutaan. Keuntungan dapat diperoleh
dari encrichment alami. Sebagai contoh pada pencarian kerosene oxiditers, tanah berminyak dipilih,
karena sudah menjadi lingkungan enrichment untuk bentuk demikian.
Isolasi mikroorganisme secara biakan murni. Untuk mempelajari sifat-sifat suatu organisme adalah
penting untuk mempelajarinya dari biakan murni yang bebas dari semua tipe organisme lain. Untuk
melakukan ini, sel tunggal harus diisolasi dari seluruh sel lainnya dengan cara sedemikian rupa
sehingga progeny yang terkumpul juga masih terpisah. Beberapa metode yang ada adalah :
a) Penanaman pada agar (platting) : tidak seperti sel-sel dalam medium cair sel-sel dalam atau pada
medium sel dibuat menetap oleh karenanya, jika cukup sedikit sel diletakkan dalam atau pada medium
sel tiap sel akan tumbuh menjadi koloni yang terpisah. Bahan gas ideal untuk kebanyakkan media
mikrobiologi adalah agar, polisakarida asam yang diekstrak dari alga merah tertentu.
b) Pengenceran : metode yang sedikit dapat dipercaya adalah pengenceran suspensi diencerkan seri
dan contoh masing-masing pengenceran ditanam pada agar. Jika hanya sedikit contoh dari
pengenceran tertentu menunjukkan pertumbuhan, diperkirakan bahwa beberapa biakan tadi dimulai
dari sel tunggan.

Pada umumnya bakteri hanya mengenai satu macam pembiakan saja, yaitu pembiakan secara aseksual
atau vegetatif. Pembiakan ini berlangsung cepat. Jika faktor-faktor luar menguntungkan. Pelaksanaan
diri atau division. Pembelahan diri dapat dibagi atas 3 fase yaitu :
a. Fase pertama, diantara sitoplasma terbelah oleh sekat yang tumbuh tegak lurus pada arah
memanjang.
b. Sekat tersebut diikuti oleh suatu dinding melintang ini tidak selalu merupakan penyekat yang
sempurna, ditengah-tengah sering ketinggalan suatu lubang kecil, dimana protoplasma kedua sel baru
masih tetap berhubung. Hubungan-hubungan protoplasma itu disebut plasmadesmida.
c. Fase terakhir ialah berpisah, yaitu yang satu terlepas sama sekali daripada yang lain. Setelah
dinding melintang menyekat secara sempurna. Bakteri yang semacam ini merupakan koloni yang
merata, jika dipiara pada medium padat. Sebaliknya, bakteri-bakteri yang dindingnya lebih kokoh itu
tetap bergandeng-gandengan setelah pembelahan bakteri macam ini merupakan koloni yang kasar
permukaannya.

Isolasi bakteri merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari
lingkungan sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Persyaratan utama bagi isolasi dan
pembuatan biakan murni adalah harus adanya kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme
inangnya. Sumber bakteri yang paling baik dan paling utama adalah dari inang. Sebagai contoh
bakteri E. Coli yang dijumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang.
Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi bahan sumbernya dan penambahan kloroform untuk
membunuh sel-sel bakterinya.

Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari bahan nutrien. Biasanya
pemilihan medium yang dipakai bergantung kepada banyak faktor seperti apa jenis mikroorganisme
yang akan ditumbuhkan. Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus
mengandung semua zat makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut. Faktor lain seperti pH,
suhu, dan pendinginan harus dikendalikan dengan baik. Selain untuk tujuan diatas medium juga
memiliki fungsi lain, seperti tempat untuk mengisolasi, seleksi, evaluasi dan diferensiasi biakan yang
didapatkan. Agar tiap-tiap medium memilki karakteristik yang sesuai dengan tujuan sehingga
seringkali digunakan beberapa jenis zat tertentu yang mempunyai pengaruh terhadap pertumbuhan
dan perkembang biakan mikroba.

Isolasi adalah cara untuk mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya
dalam suatu medium buatan. Proses pemisahan atau pemurnian dari mikroorganisme lain perlu
dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme,
memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Prinsip dari
isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari
campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkan dalam media
padat, karena dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada
tempatnya (Waluyo, 2013).

Jika sel-sel tersebut tertangkap oleh media padat pada beberapa tempat yang terpisah, maka setiap sel
atau kumpulan sel yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang terpisah, sehingga
memudahkan pemisahan selanjutnya. Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan
secara individu karena terlalu kecil dan tidak tinggal tetap di tempatnya. Akan tetapi bila sel-sel
tersebut dipisahkan dengan cara pengenceran, kemudian ditumbuhkan dalam media padat dan
dibiarkan membentuk koloni, maka sel-sel tersebut selanjutnya akan diisolasi dalam tabung-tabung
reaksi atau cawan petri yang terpisah.
Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu:
1. Isolasi pada agar cawan
Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga
diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah
yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa
cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: metode gores kuadran, dan metode agar cawan
tuang. Pada metode gores kuadran, metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan
terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satu sel. Metode agar tuang. Berbeda
dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan
didinginkan (50C), yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada
cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan/di dalam cawan.
2. Isolasi pada medium cair
Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan
(medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan
pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk
mendapatkan satu sel semakin besar.
3. Isolasi sel tunggal
Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar yang
tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan
menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan
pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis (Hasdianah,
2012).
Pembiakan murni

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
1. Tabung reaksi
2. Lampu Bunsen
3. Cawan petri
4. Kawat ose
5. Incubator
6. Alat tulis
7. Medical sterilizer
8. Sprayer
9. Alat tulis
10. Korek api
11. Kamera hp

3.2.2 Bahan
1. Alkohol
2. tisu
3. Aquadest
4. Aluminium foil
5. Bakteri
6. Kertas label
7. Plate Count Agar (PCA)
3.3 Cara Kerja

3.3.1 Metode cawan gores pada cawan petri

1. Dicuci bersih tangan praktikan menggunakan sabun dan dibersihkan hingga kering.
2. Dibakar kawat ose dengan bunsen hingga pijar, lalu diangin-anginkan hingga cukup dingin.
3. Disterilkan dengan dipanaskan pada bunsen cawan petri yang berisi bakteri dibagian pinggirnya
dengan diputar-putar.
4. Diambil sampel bakteri dengan menggunakan ujung kawat ose tadi.
5. Disterilksan dengan dipanaskan pada bunsen bunsen cawan petri yang berisi media PCA dibagian
pinggirnya dengan diputar-putar.
6. Digoreskan kawat ose yang berisi bakteri pada cawan petri yang berisi media PCA secara perlahan
sesuai dengan urutan penggoresan.
7. Digoreskan kawat ose yang berisi bakteri secara rapat pada goresan pertama (first streak) pada
cawan petri yang berisi media PCA.
8. Digoreskan kawat ose yang berisi bakteri secara agak jarang pada goresan kedua (second streak)
pada cawan petri yang berisi media PCA dan digoreskan menyambung dengan goresan pertama (first
streak).
9. Digoreskan kawat ose yang berisi bakteri secara jarang pada goresan ketiga (third streak) pada
cawan petri yang berisi media PCA dan digoreskan menyambung dengan goresan kedua (second
streak).
10. Diinkubasi didalam inkubator selama 24 jam.
11. Diamati hasilnya.

3.3.2 Metode cawan gores pada tabung reaksi (Media PCA miring)
1. Dicuci bersih tangan praktikan menggunakan sabun dan dibersihkan hingga kering.
2. Dibakar kawat ose dengan bunsen hingga pijar, lalu diangin-anginkan hingga cukup dingin.
3. Disterilkan dengan dipanaskan pada bunsen cawan petri yang berisi bakteri dibagian pinggirnya
dengan diputar-putar.
4. Diambil sampel bakteri dengan menggunakan ujung kawat ose tadi.
5. Dibuka penutup tabung reaksi lalu, dipaNAskan mulut tabung reaksi yang berisi media PCA
dengan bunsen.
6. Digoreskan kawat ose yang berisi bakteri secara zig-zag pada media PCA yang ada dalam tabung
reaksi.
7. Disterilkan dengan dipanaskan pada bunsen mulut tabung reaksi tadi, lalu ditutup dengan
aluminium foil.
8. Diinkubasi didalam inkubator selama 24 jam.
9. Diamati hasilnya.