Anda di halaman 1dari 48

LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI & VIROLOGI

DISUSUN OLEH :
NAMA

: INARNINGTYAS ISMI KIRANA

NIM

: 1408010057

GOLONGAN

: II

KELOMPOK

:V

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO
2015

BAB I
I.I TUJUAN
1. STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat :
a. Mengetahui tujuan dan cara cara sterilisasi.
b. Melakukan sterilisasi dengan menggunakan autoklaf.
c. Mengetahui penggunaan dan macam medium.
d. Membuat medium.
2. PENANAMAN, ISOLASI dan PENGAMATAN PERTUMBUHAN MIKROBA
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat melakukan penanaman
dan isolasi mikroba serta mengamati pertumbuhan bakteri.
3. PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat :
a. Mengetahui cara cara perhitungan jumlah mikroba, baik secara langsung
maupun tidak langsung.
b. Melakukan perhitungan jumlah mikroba yang ada pada suatu bahan.
4. PENGECATAN DAN MORFOLOGI MIKROBA
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat :
a. Mengetahui tujuan dari pengecatan.
b. Melakukan pengecatan terhadap mikroba.
5. MORFOLOGI FUNGI
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat mengenali berbagai
jenis jamur berdasarkan morfologinya.
6. SKRINING PRIMER UNTUK MENDAPATKAN MIKROBA RESISTEN
ANTIBIOTIK
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat :
a. Melakukan berbagai teknik mikrobiologi dalam skrining (menanam, mengisolasi
dan memurnikan biakan, melakukan tes terhadap kemampuan biakan terhadap
antibiotik).
b. Mendapatkan mikroorganisme yang resisten terhadap antibiotik.
7. UJI SENSITIFITAS MIKROBA TERHADAP ANTIBIOTIK (METODE KIRBY
BAUER)
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat :
a. Melakukan uji senditifitas terhadap antibiotik dengan metode Kirby Bauer.
b. Menentukan miroba uji termasuk sensitifitas atau resisten terhadap antibiotik yang
diujikan

I.II TINJAUAN PUSTAKA


1. STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM
Sterilisasi yaitu suatu proses untuk mematikan/membunuh semua organisme
yang ada, sehingga jika ditumbuhkan didalam suatu medium tidak ada lagi organisme
yang dapat berkembang biak di lingkungan.
Sterilisasi secara umum dpat dilakukan dengan berbagai cara, yaitu :
a. Sterilisasi secara fisik yang meliputi dengan pemanasan, sinar X, sinar ultraviolet
dan sebagainya.
b. Sterilisasi secara kimia yang meliputi dengan desinfektan, larutan alkohol,
formalin dan sebagainya.
c. Sterilisasi secara mekanik yang meliputi dengan filtrasi dan penyaringan
Media atau medium yaitu mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan
dikembangkan pada suatu substrat. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan
dan mengembangbiakan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunannya dengan
kebutuhan jenis jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa
mikroorganisme dapat hidup dengan baik pada medium yang sangat sederhana yang
hanya mengandung garam anorganik ditambah sumber karbon organik seperti gula.
Sedangkan mikroorganisme lainnya memerlukan suatu medium yang sangat komplek
yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan bahan kompleks lainnya
(Volk,1993). Fungsi fungsi medium adalah sebagai berikut :
a. Media basal dapat mendukung pertumbuhan berbagai jenis spesies tanpa syarat
nutrisi.
b. Media penghambat merupakan medium yang memuat unsur pokok tertentu yang
menghambat pertumbuhan dari jenis mikroorganisme tertentu.
c. Medium pemeliharaan digunakan untuk pertumbuhan awal dan penyimpanan
selanjutnya, mempersiapkan kultur organisme yang disimpan baik pada suhu
ruang atau suhu dingin (Singleton,dkk.2001).
Agar mikroba dapat tumbuh dan berkembang dengan baik di dalam medium,
maka harus memenuhi syarat sebagai berikut :
a. Medium harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroba.
b. Medium harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan muka da pH yang sesuai.
c. Medium tidak mengandung zat zat yang menghambat pertumbuhan mikroba.
d. Medium harus steril.
Medium dapat diklasifikasikan berdasarkan atas susunan kimia, konsistensi
dan fungsinya.
1. Klasifikasi medium berdasarkan atas susunan kimianya.
a. Medium anorganik : medium yang tersusun dari bahan bahan anorganik.
b. Medium organik : medium yang tersusun dari bahan bahan organik.
c. Medium sintetik : medium yang susunan kimia penyusunannya dapat
diketahui dengan pasti.
d. Medium kompleks : medium yang susunan kimianya tidak diketahui dengan
pasti.
2. Klasifikasi medium berdasarkan konsistensinya.
a. Medium cair (liquid medium) : medium yang berbentuk cair.
b. Medium padat (solid medium) : medium yang berbentuk padat, misalnya :

medium wortel, medium kentang, dsb.


c. Medium padat yang dicairkan (semi solid medium) : medium yang dalam
keadaan - keadaan panas berbentuk cair, sedang dalam keadaan dingin
berbentuk padat karena mengandung agar agar atau gelatin.
3. Klasifikasi medium berdasarkan atas fungsinya.
a. Medium diperkaya (enriched medium) : medium yang ditambah zat zat
tertentu (misalnya serum, darah) sehingga dapat digunakan untuk
menumbuhkan mikroba heterotrof tertentu.
b. Medium selektif : medium yang hanya dapat ditumbuhi oleh satu atau lebih
jenis mikroba, tapi akan menghambat atau mematikan jenis jenis yang lain,
misalnya medium SS (Salmonella-Shigella) agar untuk mikroba Salmonella
dan Shigella.
c. Medium diferensial : medium yang digunakan untuk pertumbuhan mikroba
tertentu, dengan tujuan untuk membedakan mikroba berdasarkan sifat
sifatnya.
Misalnya, medium agar darah yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba
hemolitik, dimana mikroba non-hemolitik dihambat pertumbuhannya.
d. Medium penguji : medium yang digunakan untuk pengujian senyawa atau
benda tertentu dengan bantuan mikroba.
e. Medium perhitungan : medium yang digunakan untuk menghitung jumlah
mikroba dalam suatu bahan. Medium ini bisa berupa medium umum, selektif,
diferensial atau penguji.
f. Medium khusus : medium untuk menentukan tipe pertumbuhan mikroba dan
kemampuannya untuk mengadakan perubahan perubahan kimia tertentu.
2. PENANAMAN, ISOLASI dan PENGAMATAN PERTUMBUHAN MIKROBA
Isolasi mikroba adalah pemisahan mikroba yang dikehendaki dari
lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium
buatan.
Tujuan pemisahan ini adalah untuk mempelajari sifat-sifat, pertumbuhan dan aktivitas
mikroba.
Sebagaimana diketahui sel mikroba sangat kecil, sehingga untuk melakukan isolasi
sangat sulit. Cara untuk melakukan isolasi adalah dengan menggoreskan (streak plate
metho) suspensi campuran sel pada permukaan media padat dalam cawan petri,
kemudian menginkubasinya. Dengan cara ini setiap sel akan tumbuh membentuk
koloni. Dan cara taburan (pour plate methode).
Untuk menanam suatu mikroba perlu diperhatikan faktor nutrisi serta
kebutuhan akar oksigen. Cara menumbuhkan mikroba anaerob sangat berbeda dengan
yang aerob, untuk semuanya itu ada cara-cara tertentu yang harus diperhatikan.
Menanam mikroba yang aerob relatif lebih mudah daripada yang anaerob. Ada
beberapa cara penanaman mikroba aerob, tergantung pada tujuan penanaman itu.
Berdasarkan atas bentuk medium dan cara menanamnya dapat dibedakan menjadi
sebagai berikut :
a. Biakan agar tegak (agar deep culture)
b. Biakan agar miring (agar slant culture)
c. Biakan cair (broth culture)

Ada bermacam-macam cara untuk mengisolasi mikroba. Ada beberapa hal


penting yang harus diperhatikan dalam isolasi yaitu :
a. Sifat sifat spesies mikroba yang akan ditanam.
b. Tempat hidup atau asal mikroba tersebut.
c. Cara menanam dan cara mengisolasikannnya.
d. Cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa biakan murni dan sesuai
dengan yang dimaksud.
e. Cara memelihara biakan murni.
Bakteri menunjukkan karakteristik pola empat-fase pertumbuhan pada kultur
cair. Fase awal, Lag adalah periode pertumbuhan lambatdimana bakteri beradaptasi
pada kondisi medium. Fase ini diikuti oleh fase Logaritmik atau fase Log, dimana
pertumbuhan bersifat eksponensial dengan sel membelah menjadi dua pada setiap
siklus replikasi. Fase stasioner terjadi ketika nutrient menjadi sedikit atau konsentrasi
sampah metabolit menjadi tinggi di dalam medium, dan laju replikasi sama dengan
laju kematian sel. Fase Kematian terjadi ketika sel mati lebih cepat dibandingkan
dengan sel baru.
3. PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA
Bakteri dapat ditemukan dimana-mana, seperti di rongga mulut, sela sela
gigi, tanah, sisa sisa makanan yang sudah basi dan untuk memperolehnya, biasanya
dibiakan dalam cawan petri yang berisi nutrisi atau medium. Koloni yang tumbuh
pada media agar dapat dilihat secara visual dan dihitung. Secara kuantitatif koloni
bakteri dapat dihitung dengan cara menghitung populasinya secara umum atau dengan
kata lain menghitung seluruh sel bakteri yang ada dalam media termasuk sel mati, dan
menghitung sel bakteri hidup dengan menggunakan teori pendekatan
(dizzideepinsohard,2008).
Ada dua cara perhitungan jumlah mikroba, yaitu perhitungan secara langsung
(direct method) dan perhitungan secara tidak langsung (indirect method).
1. Perhitungan jumlah mikroba secara langsung
Cara ini digunakan untuk menentukan jumlah mikroba / mikroba keseluruhan,
baik yang hidup maupun yang mati. Cara cara perhitungan secara langsung
antara lain :
a. Menggunakan counting chamber
Alat yang digunakan adalah haemocytometer, Petroff-Hausser Bacteria
Counter atau alat alat sejenis. Dasar perhitungannya adalah dengan cara
memipetkan 1tetes suspensibahan atau biakan mikroba pada alat tersebut,
ditutup dengan gelas penutup kemudian diamati dibawah mikroskrop, dihitung
dengan cara menentukan jumlah rata-rata jumlah sel dalam tiap petak yang
telah diketahui volumenya. Dengan demikian bisa diketahui jumlah sel tiap ml
bahan.
b. Menggunakan filter membran
Sejumlah tertentu yang akan diukur jumlah mikrobanya disaring dengan filter
membran steril. Jumlah sel rata-rata yang ada pada tiap satuan luas pada filter
membran menunjukkan banyaknya mikroba yang ada pada volume suspensi
yang disaring. Untuk mempermudah perhitungan, perlu dilakukan pengecatan

pada filter membran, kemudian ditetesi dengan minyak emersi supaya menjadi
transparan.
2. Perhitungan jumlah mikroba secara tidak langsung
Cara ini dapat digunakan untuk menentukan jumlah mikroba secara
keseluruhan baik yang hidup maupun yang sudah mati, atau hanya menentukan
jumlah mikroba yang masih hidup saja. Hal tersebut tergantung pada cara yang
digunakan.
a. Berdasarkan kekeruhan
Untuk keperluan ini digunakan alat-alat seperti photoelectric turbidimeter,
electrophotometer, spectrophotometer atau alat lain yang sejenis. Alat-alat
tersebut menggunakan sinar monokromatik dengan panjang gelombang
tertentu.
Populasi bakteri pada kultur dihitung dengan mengukur kekeruhannya dengan
menggunakan spektrofotometer. Umumnya, kekeruhan ditentukan sebagai
absorbansi dari kultur pada panjang gelombang 600nm, ditulis dengan istilah
OD600 (Optical Destiny pada 600nm). Nilai ini dapat diubah menjadi nilai
konsentrasi menggunakan faktor konversi standar dimana OD600 = 1 setara
dengan 109 sel/ml.
b. Berdasarkan analisa kimia
Umumnya digunakan untuk penentuan kandungan protein, asam asam
nukleat (DNA dan RNA) atau fosfor dari asam asam nukleat.
c. Berdasarkan berat kering
Cara ini untuk menentukan jumlah jamur yang memiliki hifa.
d. Menggunakan cara pengenceran
Cara pengenceran ini dipakai untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup
saja, dasar perhitungannya yaitu mengencerkan sejumlah volume tertentu dari
suspensi mikroba atau bahan secara bertingkat, kemudian diinokulasikan ke
dalam medium dan diinkubasikan, lalu dilihat ada pertumbuhan atau tidak.
Misalkan suatu seri pengenceran dengan kelipatan 10, pada pengenceran
1:1.000 ada pertumbuhan, tapi pada pengenceran 1:10.000 tidak ada
pertumbuhan, berarti secara teoritis jumlah mikroba antara 1.000 sampai
10.000 per ml bahan.
e. Menggunakan Most Probably Number (MPN)
Mengingat bahwa cara ini kurang tepat, untuk mengatasi persoalan tersebut
maka setiap pengenceran dibuat ulangan, hasilnya secara matematik dpat
untuk menentukan kemungkinan besar jumlah mikroba yang terdapat dalam
bahan tersebut. Untuk penentuan jumlah mikroba yang paling mungkin bisa
digunakan daftar MPN berdasarkan daftar Hoskins atau McCrady.
f. Berdasarkan jumlah koloni (plate count)
Cara ini paling umum digunakan untuk menentukan jumlah mikroba.
Dasarnya adalah dengan membuat suatu seri pengenceran bahan dengan
kelipatan 10, dari masing-masing pengenceran diambil 1 ml dan dibuat
taburan dalam cawan petri dengan medium agar yang sesuai dengan
mikrobanya.
Setelah inkubasi dilakukan perhitungan jumlah koloni pada tiap cawan petri
dari tiap tiap pengenceran. Dari jumlah koloni tiap cawan petri dpat
ditentukan jumlah mikroba tiap ml atau gram bahan, yaitu dengan mengalikan
jumlah koloni dengan kebalikan pengencerannya. Misalnya untuk
pengenceran 1:10.000 terdapat 45 koloni bakteri maka tiap ml atau gram

bahan mengandung 450.000 mikroba. Untuk membantu menghitung jumlah


koloni dalam cawan petri bisa digunakan colony counter yang dilengkapi
dengan electronic register. Pada perhitungan dengan cara ini diperlukan
beberapa syarat yang harus dipenuhi, antara lain :
1. Jumlah koloni dalam tiap cawan petri antara 30-300 koloni, jika memang
tidak ada yang memenuhi syarat dipilih yang jumlahnya mendekati 300.
2. Tidak ada spreader (koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas
cawan petri).
3. Perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengenceran sebelumnya, jika
sama atau lebih kecil dari 2 hasilnya di rata rata, tetapi bila lebih besar
dari 2 yang dipakai adalah jumlah mikroba dari hasil pengenceran
sebelumnya.
4. Jika dengan ulangan (misal di 10-4 direplikasi), setelah memenuhi syarat
hasilnya dirata-rata.
4.

PENGECETAN DAN MORFOLOGI MIKROBA


Bakteri atau mikroba yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan
air, dimana sel sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati
bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode
pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat
fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian
pengecatan.
Tujuan dari pengecatan yaitu :
a. Mempermudah melihat mikroba, baik bakteri, yeast ataupun kapang.
b. Memperjelas ukuran dan bentuk mikroba.
c. Melihat struktur luar, apabila memungkinkan struktur dalam, dari mikroba.
d. Melihat reaksi mikroba terhadap cat yang diberikan, sehingga sifat sifat fisik
dan kimia yang ada bisa di deteksi.
Pewarnaan merupakan gram-gram yang tersusun atas ion positif dan negatif
yang salah satunya berwarna dan disebut kromofor. Bila kromofor berada pada
ion positif (pewarna basa) dan ion negatif (pewarna asam).
Prosedur pewarnaan dibagi menjadi 3 yaitu :
a. Pewarnaan sederhana (simple staining)
Pewarnaan ini digunakan satu macam pewarna untuk mewarnai seluruh
mikroorganisme sehingga bentuk seluler dan struktur dasarnya dapat dilihat.
Contoh pewarnaan ini adalah larutan cat safranin atau crystal violet dan carbol
fucshin.
b. Pewarnaan diferensial (differential staining)
Dalam pewarnaan ini menggunakan lebih dari satu pewarna dan memiliki
reaksi yang berbeda untuk setiap bakteri untuk membedakan bakteri. Contoh
pewarnaan gram yang membedakan gram positif dan gram negatif.
Perbedaan struktur pada dinding selnya, gram positif lebih banyak mengandung
peptidoglikan sedangkan gram negatif lebih banyak mengandung lipopolisakarida.
c. Pewarna khusus (dpecial staining)
Mewarnai dengan mengisolasi bagian spesifik dari mikroorganisme misalnya
endospora, kapsul dan flagella.

5. MORFOLOGI FUNGI
Fungi merupakan organisme kemoheterotrof yang memerlukan senyawa
organik untuk nutrisinya (sumber karbon dan energi). Jamur merupakan kelompok
mikroorganisme yang memiliki inti, tidak berklorofil, memiliki spora, umumnya
berkembang biak secara seksual dan aseksual, berbentuk filamen, struktur somatiknya
bercabang cabang, dinding selnya terdiri dari selulosa, kitin atau kombinasi dari
keduanya.
Berdasarkan cara memperoleh makanan, jamur dibagi menjadi tiga, yaitu
jamur bersifat parasit artinya memperoleh makanan dari organisme hidup lain. Jamur
bersifat saprofit, yaitu memperoleh makanan dari sisa sisa organisme yang telah
mati. Dan jamur yang bersifat mutual yaitu hidup saling menguntungkan (simbiosis
mutualisme) dengan organisme inangnya.
Ada tiga golongan jamur yaitu kapang (jamur benang), khamir (yeast), dan
cendawan (mushroom).
1. Kapang (mold) yaitu fungi yang berfilamen dan multiseluler.
Mofologi kapang sebagai berikut :
a. Tubuh kapang terbagi menjadi dua yaitu miselium merupakan kumpulan
beberapa filamen (hifa). Ada hifa vegetatif yang berfungsi untuk mendapakan
nutrisi, dan hifa reproduktif/hifa udara untuk alat reproduksi. Dan spora.
b. Tiga macam morfologi hifa yaitu aseptat (coenocytic hypha), septat hifa (hifa
bersekat), dan septat hifa dengan sel sel multinukleat.
2. Khamir (yeast) yaitu fungi yang memiliki sel tunggal dengan pembelahan sel
melalui pertunasan (budding).
Morfologi khamir sebagai berikut :
a. Bersel satu.
b. Tidak berfilamen.
c. Berbentuk oval atau bulat.
d. Tidak berflagella.
e. Berukuran lebih besar dari bakteri.
f. Lebar 1-5 mm, panjang 5-30 mm.
3. Cendawan (mushroom) yaitu fungi yang bersifat mengguntungkan karena dapat
digunakan sebagai bahan makanan.
Morfologi cendawan sebagai berikut :
a. Sel selnya berinti sejati (eukariotik).
b. Biasanya berbentuk benang.
c. Bercabang cabang.
6. SKRINING PRIMER UNTUK MENDAPATKAN MIKROBA RESISTEN
ANTIBIOTIK
Penyakit infeksi merupakan penyakit penyebab kematian terbesar di dunia.
Beberapa penyakit infeksi penyumbang angka kematian terbesar tersebut antara lain
pneunomia, tuberkulosis, penyakit diare, malaria, cacar dan HIV/AIDS (WHO, 1999).
Penemuan senyawa antibiotik dan mekanisme aksinya pad abad ke-20 telah menjadi
salah satu kisah sukses besar dari dunia biokimia organik, mulai dari penisilin,
eritromisin, kloramfenikol, streptomisin, sampai vankomisin.

Seiring dengan penemuan dan perkembangan antibiotik dan agen antimikroba


lainnya, resisten adalah konsekuensi alami dari penggunaan antimikroba itu sendiri.
Alexander Fleming (1881 1955) pada tahun 1928, dia adalah seorang mahasiswa
yang tidak sengaja menemukan antibiotik dari staphylococcus. Jadi, pada saat dia
melakukan penelitian di lab dengan beberapa kultur staphylococcus terjadi adanya
kontaminasi jamur dan menimbulkan seperti tetesan embun disekitar jamur.
Ditemukan suatu bakteri sidial atau bakteriostatik yang kemudian dinamakan
penicilin.
Antibiotik sendiri didefinisikan sebagai senyawa yang diproduksi oleh mikroorganisme yang dalam jumlah kecil mampu menghambat organisme lain (Tortora
dkk,2010). Agen antimikroba yang ideal memiliki toksisitas selektif, yaitu obat
bersifat membahayakan hidup patogen tanpa membahayakan inang.
Berdasarkan spektrum aktivitas antimikroba, antibiotik terbagi menjadi dua yaitu antibiotik spektrum luas dan spektrum sempit. Dikatan antibiotik spektrum luas apabila
dapat mempengaruhi pertumbuhan bakteri Gram positif maupun Gram negatif.
Sedangkan antibiotik spektrum sempit hanya dapat mempengaruhi salah satunya.
Kerugian dari antibiotik spektrum luas adalah obat obatan tersebut membunuh
banyak mikroba normal dari inang. Mikroba normal tersebut biasanya berkompetisi
dengan mikroba patogen.
Proses skrining memiliki dua tahap proses, yaitu skrining primer yang
meliputi proses pencaraian mikroorganisme yang ditemukan, mengisolasi
mikroorganisme dan pengujian kemampuan isolat. Tahapan kedua adalah skrining
sekunder yang terdiri dari pemilihan koloni mikroorganisme, dan identifikasi senyawa
(Pratiwi,2008).
7. UJI SENSITIFITAS MIKROBA TERHADAP ANTIBIOTIK (METODE KIRBY
BAUER)
Mikroorganisme yang berada di sekitar kita bermacam macam ada yang
menguntungkan dan ada yang merugikan bagi makhluk hidup, khususnya pada
manusia. Mikroorganisme misalnya bakteri ada yang bersifat patogen dan non
patogen. Bakteri patogen adalah bakteri yang dapat menyebabkan penyakit tertentu,
sedangkan bakteri non patogen adalah bakteri yang tidak menyebabkan penyakit.
Antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme
(khususnya dihasilkan oleh fungi) atau dihasilkan secara sintetik yang dapat
membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan organisme lain (Chaidir,
1994). Antibiotik yang digunakan dalam medis bertujuan untuk menghilangkan infeks
atau mencegah penyebaran infeksi oleh mikroba.
Cara mengetahui efektivitaas suatu antibiotik dengan mengetahui tingkat
resistensi bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan dengan uji Kirby-Bauer. Prinsip
dasarnya adalah dengan meletakkan paper disk yang telah mengandung antibiotik
dengan konsentrasi dan kadar tertentu pada media agar yang telah ditanam bakteri uji.
Zona hambat / bening yang dihasilkan disekitar paper disk inilah yang digunakan
sebagai dasar penentuan tingkat resistensi. Tingkat resistensi bakteri dibedakan
menjadi tiga, yaitu sensitif, intermediet, dan resisten. Bakteri bersifat sensitif adalah

jika terbentuk zona bening pada saat diuji Kirby-Bauer, resisten adalah jika tidak
terbentuk zona bening pada saat diuji Kirby-Bauer, sedangkan intermediet adalah jika
terbentuk zona bening pada saat diuji Kirby-Bauer dengan diameter kecil.
Sensitifitas suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona
hambat terbentuk. Semakin besar diameternya maka semakin terhambat
pertumbuhannya.
Faktor faktor yang berpengaruh pada metose Kirby-Bauer, yaitu :
a. Ketebalan media agar, dapat mempengaruhi penyebaran dan difusi antibiotik yang
digunakan.
b. Umur bakteri, fase stationer (bakteri yang berumur tua) tidak efektif untuk diuji
karena mendekati kematian dan tidak terjadi pertumbuhan lagi sehingga yang
dipakai fase eksponential (bakteri berumur sedang) karena aktivitas metabolitnya
tinggi, perumbuhan cepat sehingga lebih peka terhadap daya kerja obat dan
hasilnya lebih akurat.
c. Waktu inhibisi, waktu yang cukup supaya bakteri dapat berkembang baik dengan
optimal dan cepat. Waktunya minimal 16 jam.
d. pH dan temperatur, bakteri memiliki pH dan temperatur optimal untuk tumbuh
yang berbeda beda sehingga sebaiknya dilakukan saat pH dan temperatur yang
optimal.
e. Konsentrasi antibiotik, semakin besar konsentrasinya semakin besar diameter
hambatannnya.
f. Jenis antibiotik, setiap bakteri memiliki repon yang berbeda beda terhadap
antibiotiknya, tergantung sifat antibiotik tersebut (berspektrum luas / berspektrum
sempit).
LAF (Laminar Air Flow) yaitu suatu meja kerja steril untuk melakukan
inokulasi atau penanaman. Dinamakan LAF (Laminar Air Flow) karena meniupkan
udara steril secara kontinue melewati tempat kerja sehingga tempat kerja bebas dari
dubu, spora spora yang jatuh ke dalam media, waktu pelaksanaan penanaman.
Aliran udara ini berasal dari udara ruangan yang ditarik ke dalam alat melalui filter
pertama (pre-filter), yang kemudian ditiupkan keluar melalui filter yang sangat halus
yang disebut HEPA (High Efficiency Particulate Air Filter I) dengan menggunakan
blower. LAF digunakan untuk pengerjaan secara aseptis. Penaseptisan merupakan
suatu ruangan berdasarkan aliran udara keluar dengan kontaminasi udara dapat
diminimalkan. LAF ada dua macam yaitu :
a. LAF cabinet tidak dilengkapi dengan lampu UV, blower harus dijalankan terus
menerus walaupun LAF tersebut sedang tidak dipergunakan, karena untuk
menjaga kebersihan ruang kerja.
b. LAF yang dilengkapi dengan lampu UV, menyalakan alat ini minimal 30menit
sebelum LAF digunakan. Ketika LAF sedang digunakan lampu UV harus
dimatikan blower dijalankan, blower ini hanya dijalankan pada saat LAF sedang
dipakai.
Hal hal yang perlu diperhatikan yaitu :
a. Jangan meletakkan bunsen dekat dengan filter.
b. Jangan menumpuk alat alat didepan tempat bekerja sehingga menghalangi udara
c. Jangan mencelupkan alat tanam dengan api ke dalam alkohol
d. Jangan mendekati lampu bunsen dengan tangan yang baru disemprotkan alkohol.
e. Bersihkan LAF setelah selesai.

BAB II
II.I ALAT DAN BAHAN
1. STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM
a. Sterilisasi dengan Autoklaf :
Air suling
Sterilisator
Wadah Aluminium
b. Pembuatan Medium Nutrien Cair :
Ekstrak Daging
Pepton
Pemanas
Penyaring
c. Pembuatan Medium Nutrien Agar :
Ekstrak daging
Pepton
Agar agar
Tabung reaksi
d. Pembuatan Medium Nutrien Taoge Cair :
Taoge
Sukrosa
Aquades
e. Pembuatan Medium Taoge Agar :
Taoge
Sukrosa
Aquades
Agar agar
2. PENANAMAN, ISOLASI DAN PENGAMATAN PERTUMBUHAN MIKROBA
Alat :
Ose runcing
Ose tumpul
Lampu spirtus
Cawan petri
Pipet steril
Spektrofotometer
Kuvet plastik
Incubator
Incubator shaker
Bahan :
a. Menanam Mikroba Aerob
Biakan murni Bacillus Subtilis dalam medium nutrien cair umur 24 jam
Biakan murni E.Coli dalam medium nutrien carir umur 24 jam

Medium nutrien agar tegak, medium agar miring dan medium nutrien cair
b. Isolasi Mikroba
Suspensi mikroba / campuran mikroba
Nutrien agar tegak
c. Pengamatan Pertumbuhan Mikroba
Kultur bakteri E.coli dalam medium nutrien agar
100ml medium pertumbuhan nutrien beef dalam 250ml erlenmeyer
Media tanpa bakteri sebagai blanko
3. PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA
a. Plate Count :
Cawan petri
Gelas ukur
Tabung reaksi
Pipet tetes
Sampel bahan
Aquades
Medium agar
b. Optical Density 600 (OD 600) :
Tabung reaksi
Spektrofotometer UV
Aquades
Suspensi bakteri
4. PENGECATAN DAN IDENTIFIKASI MIKROBA
a. Pengecatan Sederhana :
Objek glass
Lampu spirtus
Ose
Biakan murni B.subtilis
Larutan cat kristal violet
Larutan cat safranin
b. Pengecatan Gram :
Objek glass
Lampu spirtus
Ose tumpul
Biakan murni B.Subtilis
Biakan murni E.Coli
Larutan cat kristal violet (gram A)
Larutan lugol iodine (gram B)
Larutan alkohol (gram C)
Larutan cat safranin (gram D)

5. MORFOLOGI FUNGI
a. Pengamatan Morfologi Kapang :
Jarum preparat
Gelas objek
Gelas penutup
Pipet tetes
Mikroskrop
Biakan murni dari Aspergillus sp.
Biakan murni dari Rhizopus sp.
Biakan murni dari Penicillium sp.
Biakan murni dari Monilia sp.
Larutan mounting laktofenol
b. Pengamatan Morfologi Khamir :
Gelas objek
Jarum preparat
Pipet tetes
Mikroskrop
Gelas penutup
Biakan murni Saccharomyces sp. pada medium taoge agar
6. SKRINING PRIMER UNTUK MENDAPATKAN MIKROBA RESISTEN
ANTIBIOTIK
a. Tahap 1 :
Cawan petri
Tabung reaksi
Mikropipet dan yellow tip
Gelas spreader
Media selektif (Czapec dox dan antibiotik)
Larutan salin (NaCl 0,9%)
Sampel tanah
b. Tahap 2 :
Cawan petri
Ose bulat
Labu erlenmeyer 50 cc untuk wadah mensterilkan media
Media pertumbuhan (Czapec dox)
c. Tahap 3 (Uji sensitifitas isolat bakteri terhadap beberapa antibiotik) :
Cawan petri
Jangka sorong
Erlenmeyer 50 cc untuk wadah sterilisasi media
Media nutrien agar
Kultur E.Coli dan B.Subtilis dalam media nutrien cair berumur 24jam
Antibiotik
Paper disk

7. UJI SENSITIFITAS MIKROBA TERHADAP ANTIBIOTIK (METODE KIRBYBAUER)


a. Tahap 1 :
Cawan petri
Tabung reaksi
Mikropipet dan yellow tip
Glass spreader
Media selektif (Czapec dox dan antibiotik)
Larutan salin NaCl 0,9 %
Sampel tanah
b. Tahap 2 :
Cawan petri
Ose bulat
Labu erlenmeyer 50 cc untuk wadah mensterilkan media
Media pertumbuhan (Czapec dox)
c. Tahap 3 (Uji sensitifitas isolat bakteri terhadap beberapa antibiotik) :
Cawan petri
Jangka sorong
Erlenmeyer 50 cc untuk wadah sterilisasi media
Media nutrien agar
Kultur E.Coli dan B.Subtilis dalam media nutrien cair berumur 24 jam
Antibiotik
Paper disk
II.II CARA KERJA
1. STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM
a. Sterilisasi dengan Autoklaf
Tuangkan air secukupnya ke sterilisator
Tata alat-alat yang akan disterilkan
Letakkan tutup sterilisator pada tubuh sterilisator
Buka klep pengaman
Tutup klep apabila uap air mulai keluar dg deras
Pertahankan tekanan 2 atm selama 15-20menit
Matikan pemanasan dan tunggu sampai tekanan nol
Buka pengatur klep
Buang air yg tersisa dan keringkan semua bagiannya

Saat mencuci tutupnya jaga agar alat pengukur tidak terkena air
b. Pembuatan Medium Nutrien Cair
Larutkan 3gr ekstrak daging + 5gr pepton dg 1 L aquadest
Panaskan selama 5 menit
Dinginkan
Netralkan dg NaOH 1N ad Ph 7,2, cek dg pH meter
Tambahkan aquadest ad 1 liter lagi
Saring larutan medium dengan kain penyaring yg bersih
Sterilkan dengan autoklaf, P=2 atm, T=121C, t=20 menit
c. Pembuatan Medium Nutrien Agar
Medium nutrien cair + 15-20 gr agar untuk 1 liter aquadest
Masukkan agar - agar ke dlm medium yang dipanaskan selama 20-30 menit
Kembalikan volume medium ad 1 liter kembali
Dlm keadan panas saring dengan kain saring bersih
Masukkan dlm tabung reaksi steril
Medium agar miring 5 ml
Medium agar tegak 10 ml
Sterilkan dg autoklaf, P=2 atm, T=121C, t=20 menit
d. Pembuatan Medium Nutrien Taoge Cair
Rebus taoge dengan aquadest ad 2 jam
Saring rebusan taoge, tambahkan sukrosa
Panaskan kembali ad larut
Tambahkan aquadest ad volumenya 1 liter

Sterilkan dengan autoklaf, P=2 atm, T=121C, t=15 menit


e. Pembuatan Medium Taoge Agar
Medium nutrien cair + 15-20 gr agar untuk 1 liter aquadest
Masukkan agar - agar ke dalam medium yang dipanaskan selama 20-30 menit
Kembalikan volume medium ad 1 liter kembali
Dalam keadaan panas saring dengan kain saring bersih
Masukkan dalam tabung reaksi steril
Medium agar miring 5 ml
Medium agar tegak 10 ml
Sterilkan dg autoklaf, P=2 atm, T=121C, t=20 menit
2. PENANAMAN, ISOLASI DAN PENGAMATAN PERTUMBUHAN MIKROBA
a. Menanam Mikroba aerob
- Biakan Agar tegak
Mensterilkan jarum ose ranting diatas nyala api spirtus
Mengambil biakan murni dengan cara membuka kapas penutup tabung dengan
kelingking tangan kanan, posisi tabung agak di miringkan
Mengambil inokulum dengan menggunakan jarum ose ranting. Panaskan bibir
tabung dengan nyala api spirtus, lalu tutup kembali
Mengambil media agar tegak yang akan di inokulasi
Melepas tutup kapasnya dan menusuk agar tegak dengan jarum ose, inokulasi
sampai ke dasar tabung
Kemudian menarik jarum ose hati - hati
Memanaskan bibir tabung, lalu tutup kembali
Memberi etiket tabung biakan bertuliskan nama mikroba dan tanggal inokulasi
Menginkubasi pada suhu 37C

Biakan Agar Miring


Mensterilkan jarum ose tumpul diatas nyala api spirtus
Mengambil biakan murni dengan cara membuka kapas penutup tabung dengan
kelingking tangan kanan, posisi tabung agak di miringkan
Mengambil inokulum dengan menggunakan jarum ose tumpul. Panaskan bibir
tabung dengan nyala api spirtus, lalu tutup kembali
Mengambil media agar miring yang akan di inokulasi
Melepas tutup kapasnya dan menggoreskan agar miring dengan jarum ose,
inokulasi sampai ke permukaan tabung
Kemudian menarik jarum ose hati - hati
Memanaskan bibir tabung, lalu tutup kembali
Memberi etiket tabung biakan bertuliskan nama mikroba dan tanggal inokulasi
Menginkubasi pada suhu 37C

Biakan Cair
Mensterilkan jarum ose tumpul diatas nyala api spirtus
Mengambil biakan murni dengan cara membuka kapas penutup tabung dengan
kelingking tangan kanan, posisi tabung agak di miringkan
Mengambil inokulum dengan menggunakan jarum ose tumpul. Panaskan bibir
tabung dengan nyala api spirtus, lalu tutup kembali
Mengambil media agar cair yang akan di inokulasi
Melepas tutup kapasnya dan menggoreskan agar cair dengan jarum ose,
inokulasi sampai ke permukaan tabung
Kemudian menarik jarum ose hati - hati
Memanaskan bibir tabung, lalu tutup kembali
Memberi etiket tabung biakan bertuliskan nama mikroba dan tanggal inokulasi
Menginkubasi pada suhu 37C

b. Isolasi Mikroba
Mencairkan nutrien agar tegak dalam penangas air
Mendinginkan sampai suhu 50C
Menuangkan medium agar kedalam cawan petri steril secara aseptik. Biarkan
sampai dingin dan padat
Mengambil satu ose suspensi bahan yang mengandung mikroba tersebut secara
aseptik dan buatlah goresan pada permukaan agar
Membalik cawan petri yang telah diberi etiket dan membungkus kembali dengan
kertas
Menginkubasi pada suhu 37C
c. Pengamatan Pertumbuhan Mikroba
Mengambil satu ose koloni bakteri dari media NA
Menginokulasikan kedalam media pertumbuhan NB pada Erlenmeyer
Mengambil 1 mL suspensi bakteri dan memindahkan dalam kuvet plastik
Mengukur media tanpa suspensi bakteri sebagai blanko pada spektrofotometer
dengan panjang gelombang 600 nm. Kemudian membaca absorbansi kuvet yang
berisi suspensi bakteri
Mengulangi pembacaan absorbansi tiap 3 jam selama 27 jam
Membuat grafik hubungan antara absorbansi versus waktu pengukuran
3. PERHITUNGAN MIKROBA
a. Plate Count
Ambil 1ml sampel
1ml sampel+ 9ml aquades tab 1 (pengenceran 10-1)
1ml susp. tab 1 + 9ml aquades tab 2 (pengenceran 10-2)
1ml susp. tab 2 + 9ml aquades tab 3 (pengenceran 10-3)
Ad pgnenceran 10-6 & 10-7
Panaskan medium agar (ambil 10 ml)
Campur medium + suspensi pengenceran dalam cawan petri

Goyangkan degan arah angka 8 secara hati - hati


Bungkus degan kertas lalu inkubasi selama 24 jam
Dinginkan & hitung koloni yang tumbuh pada masing - masing cawan petri
b. Optical Density 600 (OD 600)
Ambil 1 ml suspensi bakteri dari medium cair dan tempatkan pada tabung
Encerkan bila perlu untuk mendapatkan OD 600 kurang dari 1
Masukkan sampel ke kuvet
Ukur OD 600 dari sampel
Hitung densitas dari sel dengan menggunakan tabel
4. PENGECATAN DAN IDENTIFIKASI MIKROBA
a. Pengecatan Sederhana
Bersihkan gelas obyek degan alkohol hingga bebas lemak, kemudian panggang di
atas nyala lampu spiritus
Ambil secara aseptik 1 ose suspensi biakan B. subtilis dan E coli ratakan kira kira 1cm
Kering anginkan preparat tersebut, kemudian fiksasi dengan melewatkannya
beberapa kali di atas nyala lampu spiritus

Dinginkan, kemudian teteskan cat sfranin atau kristal violet secukupnya dan
biarkan selama 1-2 menit
Cuci degan air mengalir hingga sisa cat habis, kemudian keringanginkan
Amati dengan mikroskop dengan perbesaran kuat. Gunakan minyak emersi, bakteri
akan terwarnai dan latar belakangnya transparan
Gambar morfologi selnya
b. Pengecatan Gram
Bersihkan gelas obyek degan alkohol hingga bebas lemak, kemudian panggang di
atas nyala lampu spiritus

Ambil secara aseptik 1 ose suspensi biakan B. subtilis dan E coli ratakan kira - kira
1cm
Kering anginkan preparat tersebut, kemudian fiksasi dengan melewatkannya beberapa
kali di atas nyala lampu spiritus
Setelah dingin tetesi degan cat - cat gram A sebanyak 2-3 tetes dan diamkan selama 1
menit
Cuci degan air mengalir, kemudian keringanginkan
Teteskan cat gram B,biarkan selama 1 mnt cuci degan air mengalir kemudian kering
anginkan
Cuci dengan larutan peluntur (gram C) selama 30 detik, kemudian dicuci dengan air
mengalir dan kering anginkan
Beri larutan cat penutup (gram D) selama 2 menit cuci dengan air mengalir dan kering
anginkan
Amati dengan mikroskop dengan minyak emersi, kemudian gambarkan preparat
5. MORFOLOGI FUNGI
a. Pengamatan Morfologi Kapang
Bersihkan gelas benda dengan alkohol sampai bebas lemak dan debu, kemudian
teteskan 1 tetes laktoferol pada bagian tengah
Ambil biakan jamur dengan jarum prerarat dan kemudian letakan pada gelas objek
yang sudah diberi laktofenol
Jika massa miselium mengumpul, pisahkan dengan menggunakan 2 buah jarum
preparat
Tutup dengan gelas penutup, hindari pembentukan gelombang udara di dalam
preparat
Amati di bawah mikroskop
Gambar dan beri keterangan yang lengkap
b. Pengamatan Morfologi Khamir
Bersihkan gelas benda dengan alkohol sampai bebas debu dan lemak, kemudian
teteskan 2 tetes methilen blue pada bagian tengahnya
Ambil biakan jamur dengan jarum preparat dan kemudian letakan pada gelas
objek yang sudah diberi methilen blue

Tutup dengan gelas penutup, hindari pembentukan gelombang udara didalam


preparat
Amati di bawah mikroskop
Gambar dan beri keterangan yang lengkap
6. SKRINING PRIMER UNTUK MENDAPATKAN MIKROBA RESISTEN
ANTIBIOTIK
a. Tahap I :
Suspensikan 1g sempel tanah dengan larutan salin dalam tabung steril
Encerkan hingga konsentrasi 10-5
Tuang 0,5 ml suspensi tersebut dalam petri steril yang telah dituangkan media
padat dengan antibiotik
Ratakan dengan speaderglass
Inkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam
b. Tahap II :
Pilih salah satu koloni yang dominan, ambil dengan menggunakan ose, tanam
pada media pertumbuhan tanpa antibiotik
Inkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam
c. Tahap III :
Siapkan dan sterilkan 10ml media dalam erlenmeyer, setelah dingin campurkan
dengan suspensi isolat bakteri, homogenkan
Tuang dalam cawan petri, tunggu hingga beku
Taruh peper disk diatas permukaan media
Inkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam
Tetesi dengan 10l larutan antibiotik
Ukur diameter hambat untuk masing-masing antibiotik , interpretasikan hasil
dengan antibiotik

7. UJI SENSITIFITAS MIKROBA TERHADAP ANTIBIOTIK (METODE KIRBYBAUER)


a. Tahap I :
Siapkan dan sterilisasi 10ml media kaldu/agar dalam erlenmeyer
Setelah agak dingin, campur dengan suspensi bakteri uji tuangkan dalam cawan petri,
homogenkan. Tunggu sampai membeku
Masuk ke LAF
b. Tahap II :
Buka cawan, letakkan paper disk di atas medium menggunakan pinset, masing masing cawan 2 paper disk
Teteskan antibiotik Ampicillin dan Gentamisin
Tutup cawan
c. Tahap III :
Bungkus cawan dan inkubasi pada suhu 37C
Ukur zona hambat menggunakan jangka sorong
Intepretasikan hasil dengan antibiogram

BAB III
III.I HASIL
1. STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM

Gambar : Medium Nutrien Agar Tegak

Gambar : Medium Nutrien Agar Tegak akan disterilkan dengan alat autoklaf

2. PENANAMAN, ISOLASI DAN PENGAMATAN MIKROBA


a. Penanaman

b. Isolasi

Gambar : Penggoresan pada permukaan agar


Catatan : Salah pemberian nama etiket, seharusnya kelompok V (lima)
c. Pengamatan pertumbuhan mikroba
Jam ke I 12:00
Kelompok
E.Coli
B.Subtilis
1
0,544
0,615
2
0,540
0,801
3
0,540
0,569
4
0,777
0,615
5
0,540
0,797
6
0,548
0,769

Jam ke II 15:00
Kelompok
E.Coli
1
0,560
2
0,552
3
0,569
4
0,814
5
0,568
6
0,573

B.Subtilis
0,865
0,922
0,816
1,069
0,869
0,946

Jam ke III 18:00


Kelompok
E.Coli
1
0,692
2
0,605
3
0,770
4
1,726
5
0,780
6
0,056

B.Subtilis
1,502
1,068
0,950
1,410
1,012
1,202

Jam ke IV 13:00
Kelompok
E.Coli
1
2,591
2
3
2,482
4
1,037
5
2,270
6
2,128

B.Subtilis
2,451
2,290
2,303
1,249
2,408
0,542

Jam ke V 16:20
Kelompok
E.Coli
1
2,515
2
3
2,402
4
0,649
5
2,280
6
0,677

B.Subtilis
2,482
2,357
2,408
0,849
2,466
0,537

3000
2500
2000
1500
1000
500
0

E.Coli
Column1

Gambar : Grafik hubungan antara absorbansi versus waktu pengukuran.

3. PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA


a. Plate count

Gambar : Pengenceran 101 - 105


Perhitungan:
Replikasi 1
Replikasi 2

1x10-6
73
129

1x10-7
59
49

Pengenceran 10-6 (A) = (73+129 : 1x10-6) : 2 = 101x106


Pengenceran 10-7 (B) = (59+49 : 1x10-6) : 2 = 54x107 = 540x106
Jadi, B : A = 540x106 : 101x106 = 5,34 CFU/ml
B/A > 2 yang dipakai adalah jumlah mikroba dari hasil pengenceran sebelumnya
4. PENGECATAN DAN MORFOLOGI MIKROBA
a. Pengecatan Sederhana

Gambar : B.cereus

b. Pengecatan Gram

Gambar : B.Cereus gram positif

Gambar :E.Coli gram negatif


5. MORFOLOGI JAMUR
a. Pengamatan morfologi kapang dengan menggunakan cat laktofenol

b. Pengamatan morfologi kapang dengan menggunakan cat methilen blue

6. SKRINING PRIMER UNTUK MENDAPATKAN MIKROBA RESISTEN


ANTIBIOTIK
Tahap 1 : Pengenceran

Sebelum dituang ke cawan petri pengenceran 10-110-5

Tahap 2

Tahap 3
Sampel Tanah
B = 0,71
V = 1,26 + 1,86 2 = 1,56

7. UJI SENSITIFITAS MIKROBA TERHADAP ANTIBIOTIK (METODE KIRBY


BAUER)

Gambar : etiket sampel tanah pada tahap 3, percobaan 6.


Etiket E.Coli dan B.Cereus percobaan 7.
E.Coli :
B = 0,69
V = (2,1 + 2,21) 2 = 2,155
B.Aureus :
B = 4,69 + 3,89 2 = 4,29
V = 2,31 + 2,32 2 = 2,315
III.II PEMBAHASAN
1. STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM
Dalam percobaan sterilisasi dan pembuatan medium,mahasiswa diharapkan
dapat mengetahui tujuan dan cara cara sterilisasi, melakukan sterilisasi dengan
menggunakan autoklaf, mengetahui penggunaan dan macam medium serta membuat
medium.Sterilisasi yaitu proses penghilangan semua jenis organisme hidup, dalam hal
ini adalah mikroorganisme (protozoa, fungi, bakteri, mycoplasma, virus) yang
terdapat dalam suatu benda. Proses ini melibatkan aplikasi biocidal agent atau proses
fisik dengan tujuan untuk membunuh atau menghilangkan mikroorganisme. Target
suatu metode inaktivasi tergantung dari metode dan tipe mikroorganisme yaitu
tergantung dari asam nukleat,protein atau membran mikroorganisme tersebut.
Tujuan dari sterilisasi yaitu menyiapkan peralatan perawatan dan kedokteran
dalam keadaan siap pakai, mencegah peralatan cepat rusak, mencegah terjadinya
infeksi silang, menjamin kebersihan alat, menetapkan produk akhir dinyatakan sudah
steril dan aman, dan mencegah kontaminasi terhadap bahan bahan yang dipakai
dalam melakukan biakan murni. Cara cara sterilisasi dibagi menjadi tiga, sebagai
berikut:

1. Sterilisasi secara fisik


a. Pemanasan
Air dan uap adalah media panas yang baik. Dalam waktu relatif singkat, alat
yang
akan disterilakan akan mencapai suhu yang diinginkan. Udara adalah penyalur
panas yang kurang baik. Oleh karena itu, untuk mencapai suhu yang
diinginkan akan membutuhkan waktu yang cukup lama.
Pemijaran (dengan api langsung) yaitu membakar alat pada api secara
langsung, contoh alat jarum inokulum, pinset, batang L,dll. Panas kering yaitu
sterilisasi dengan oven kira kira 60-180C, sterilisasi panas kering ini cocok
untuk alat yang terbuang dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll.
Uap air panas, konsep ini yaitu mirip dengan mengukus, bahan yang
mengandung air lebih tepat menggunakan metode ini supaya tidak terjadi
dehidrasi. Dan uap panas yang bertekanan menggunakan autoklaf.
b. Sinar X
Sinar X dapat membunuh mikroba karena merusak DNA dan menyebabkan
ionisasi komponen sel lainnya. Radiasi dengan sinar x digunakan untuk
sterilisasi benda benda yang tidak tahan suhu tinggi, misalnya pompa suntik
dari plastik.
c. Sinar ultraviolet
Sinar ultraviolet umumnya digunakan untuk membantu mengurangi
kontaminasi di udara dan pemusnahan selama proses di lingkungan. Sinar
yang bersifat membunuh mikroorganisme (germisida) diproduksi oleh lampu
kabut merkuri yang dipancarkan secara eksklusif pada 253,7nm. Sinar UV
menembus udara bersih dan air murni dengan baik, tetapi suatu penambahan
garam atau bahan tersuspensi dalam air atau udara menyebabkan penurunan
derajat penetrasi dihindarkan dan setiap tindakan membunuh mikroorganisme
dibatasi pada permukaaan yang dipaparkan.
2. Sterilisasi secara kimia
Sterilisasi secara kimia menggunakan senya desinfektan antara lain alkohol.
Umumnya isopropil alkohol 70-90% merupakan antiseptik yang sangat efisien
dan efektif. Penambahan yodium pada alkohol akan meningkatkan daya
disinfeksinya. Dengan alat iodium, isopropil todak efektif terhadap spora. Solusi
terbaik untuk membunuh spora adalah campuran formaldehid dengan alkohol,
tetapi solusi ini terlalu toksik untuk dipakai sebagai antiseptik. Zat zat kimia
yang dapat dipakai untuk sterilisasi antara lain yaitu halogen (senyawa klorin,
iodium), alkohol, fenol, hidrogen feroksida, zat warna ungu kristal, derivat
akridin, rosanalin, detergen, logam berat, aldehid dll.
a. Desinfektan
Bahan kimia yang digunakan untuk mencegah terjadinya infeksi / pencemaran
oleh jasad renik / obat untuk membasmi kuman penyakit. Daya kerja
antimikroba disenfektan ditentukan oleh konsentrasi, waktu dan suhu.
Prosedur umum kerja teknik desinfeksi meja kerja, yaitu singkirkan semua
barang yang tidak diperlukan dari meja, lalu semprotkan meja kerja dengan
alkohol 70% beberapa kali hingga merata, kemudian semprotkan alkohol pada
telapak tang yang telah memakai sarung tangan, letakkan alat dan bahan
bahan yang diperlukan pada meja kerja dan semprotkan kembali alkohol pada
semua peralatan. Setelah itu diamkan beberapa saat dan kembali semprotkan

alkohol ke seluruh permukaan tangan ketika hendak mulai bekerja. Letakkan


lampu spirtus dalam keadaan nyala api lalu biarkan.
3. Sterilisasi secara mekanik
Filtrasi atau penyaringan digunakan untuk sterilisasi larutan yang termolabil.
Penyaringan ini menggunakan filter bakteri. Metode ini tidak dapat membunuh
mikroba , mikroba hanya akan tertahan oleh pori pori filter dan terpisah dari
filtratnya. Dibutuhkan penguasaan teknik aseptik yang baik dalam melakukan
metode ini. Filter biasanya terbuat dari asbes, porselen. Filtrat bebas dari bakteri
tetapi tidak bebas dari virus.
Metode filtrasi ini hanya dipakai untuk menyeterilkan larutan gula, cairan lain
seperti serum atau sterilisasi hasil produksi mikroorganisme seperti enzym dan
exotoxin dan untuk memisahkan filtrable virus dari bakteria dan organisme.
Sterilisasi dengan menggunakan autoklaf. Autoklaf yaitu alat pemanas tertutup
yang digunakan untuk mensterilkan suatu benda menggunakan uap bersuhu dan
bertekanan tinggi (121C,15lbs). Selama kurang lebih 15menit, penurunan tekanan
pada autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh mikroorganisme melainkan
meningkatkan suhu dalam autoklaf. Suhu yang tinggi inilah yang akan membunuh
mikroorganisme.
Cara cara menggunakan autoklaf sebagai berikut :
1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf.
2. Masukkan peralatan dan bahan.
3. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan pengaman agar tidak ada uap yang
keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu.
4. Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15menit pada susuh
121C.
5. Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf
dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup
(dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Perhitungan 15menit dimulai sejak
tekanan mencapai 2atm.
6. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen
turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure
gauge menunjukkan ke angka 0). Kemudian klep klep pengaman dibuka dan
keluarkan isi autoklaf dengan hati hati.
Medium pertumbuhan (disingkat medium) adalah tempat untuk menumbuhkan
mikroba. Kami kelompok lima melakukan percobaan medium nutrien agar tegak.
Pembuatan medium nutrien agar tegak bahan bahan yang harus disiapkan yaitu
Nutrien Agar Tegak dan aquadest. Nutrien agar tegak, yaitu nutrien agar setengah
berupa bubuk bubuk yang telah dikemas plastik, agar (dari rumput laut) yang
berfungsi sebagai pemadat media. Digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari
mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof
(mikroorganisme yang tidak dapat membuat makanan sendiri). Aquadest
dipergunakan sebagai pelarut.
Alat alat yang dipergunakan berupa gelas beker, pemanas/penangas, batang
pengaduk, tabung reaksi, rak tabung, dan autoklaf. Gelas beker untuk tempat/wadah
pada saat mencampurkan nutrien agar tegak dan aquadest. Pemanas/penangas untuk
mendidihkan campuran nutrien agar tegak dan aquadest. Batang pengaduk membatu
megaduk suatu campuran agar tidak terjadinya endapan. Tabung reaksi sebagai

tempat/wadah nutrien agar tegak dan aquadest yang sudah mendidih. Rak tabung
untuk meletakkan tabung reaksi agar posisinya tegak. Autoklaf adalah suatu alat
pemanas tertutup yang digunakan untuk mensterilisasi suatu benda menggunakan uap
bersuhu dan bertekanan tinggi(121C) selama kurang lebih 15menit. Suhu yang tinggi
inilah yang akan membunuh mikroorganisme.
Tahap tahap percobaan pembuatan medium nutrien agar, yaitu
mencampurkan Nutrien agar tegak 130ml ditambahkan pelarut berupa aquadest
120ml ke dalam gelas beker. Lalu, memanaskan campuran tersebut diatas pemanas
dengan suhu 100C sambil diaduk menggunakan batang pengaduk sampai mendidih.
Tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini adalah untuk menghomogenkan Nutrien
agar dengan aquadest, dimana dengan pemanasan dapat mempercepat pelarutan dari
Nutrien agar dengan aquadest. Setelah mendidih, pindahkan campuran tersebut ke
dalam tabung reaksi masing masing 10ml, jadi jumlah tabung yang berisi campuran
tersebut ada 12 tabung reaksi. Kemudian mulut tabung ditutup dengan kapas dengan
posisi tegak dan diletakkan di rak tabung. Setelah selesai itu, masukkan 12 tabung
tersebut ke dalam plastik, dalam satu plastik terdapat tiga tabung reaksi. Lalu,
masukkan ke dalam autoklaf selama 20menit dengan suhu 121C untuk disterilkan.
Pembuatan medium nutrien agar tegak ini untuk bahan tahap percobaan selanjutnya.
Fungsi medium (NA) berdasarkan susunan kimianya merupakan medium non
sintetik atau semi ilmiah, berdasarkan konsistennya merupakan medium padat, untuk
menumbuhkan bakteri. Medium yang telah disterilkan tidak ditumbuhi oleh mikroba
karena kontaminan telah hilang setelah sterilisasi. Media tegak dimaksudkan untuk
mrlihat pertumbuhan bakteri dalam merespon oksigen dari luar dalam arah tegak.
2. PENANAMAN, ISOLASI DAN PENGAMATAN PERTUMBUHAN MIKROBA
Percobaan penanaman, isolasi dan pengamatan pertumbuhan mikroba
bertujuan agar mahasiswa dapat melakukan penanaman dan isolasi mikroba serta
mengamati pertumbuhan bakteri. Teknik penanaman (inokulasi) merupakan suatu
pekerjaan memindahkan bakteri dari medium lama ke medium yang baru dengan
tingkat ketelitian yang sangat tinggi, dengan demikian akan diperoleh biakan
mikroorganisme yang dapat digunakan untuk pembelajaran mikrobiologi.
Teknik isolasi mikroba adalah suatu usaha untuk menumbuhkan mikroba diluar dari
lingkungan alamiahnya. Pemisahan mikroorganisme dari lingkungan ini bertujuan
untuk memperoleh biakan bakteri yang sudah tidak bercampur lagi dengan bakteri
lainnya dan disebut biakan murni. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan
satu jenis mikroba dengan mikrobalainnya yang berasal dari campuran bermacam
macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media
padat, sel sel mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya.
Dikenal beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan
campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan yaitu metode cawan gores
dan metode cawan tuang.
Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi miroba yaitu antara
lain sebagai berikut :
1. Sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi.
2. Tempat hidup atau asal mikroba tersebut.
3. Medium pertumbuhan yang sesuai.

4. Cara menginkubasi mikroba.


5. Cara menginokulasi mikroba
6. Cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa kultur murni dan sesuai
dengan yang dimaksud.
7. Cara memelihara agar mikroba yang telah diisolasi tetap merupakan kultur murni.
Alat alat yang perlu dipersiapkan, yaitu ose ranting, ose tumpul, lampu
spirtus, cawan petri steril, pipet steril, spektrofotometer, kuvet plastik, incubator, dan
incubator shaker. Ose ranting untuk mengambil biakan murni pada biakan agar tegak.
Ose tumpul dipergunakan untuk mengambil biakan murni agar miring. Lampu spirtus
sebagai nyala api untuk mensterilkan alat yang akan menyentuh/mengambil biakan
dengan cara melewati diatas nyala api.
Cawan petri steril sebagai tempat nutrien agar tegak pada proses isolasi mikroba.
Pipet steril untuk membantu mengambil larutan yang sukar diambil. Spektrofotometer
merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan
cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatuobyek kaca atau kuarsa yang
disebut kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan
dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi
larutan di dalam kuvet. Kuvet plastik sebagai tempat menaruh larutan sampel dan
blanko ke dalam berkas cahaya spektrofotometer. Incubator adalah alat yang
digunakan untuk tumbuh dan memelihara budaya mikrobiologi atau kultur sel.
Inkubator mempertahankan suhu optimal, kelembaban dan kondisi lain seperti karbon
dioksida (CO2) dan kandungan okseigen dari atmosfer di dalam. Inkubator sangat
penting untuk banyak pekerjaan eksperimental dalam biologi sel, mikrobiologi dan
biologi molekuler dan digunakan untuk kultur bakteri baik serta sel eukariotik.
Untuk menanam mikroba aerob mempersiapkan bahan bahan, yaitu biakan
murni Bacillus Subtilis dalam medium nutrien cair berumur 24 jam, biakan murni
E.coli dalam medium nutrien cair umur 24 jam, medium nutrien agar tegak, medium
agar miring dan medium nutrien cair. Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif
yang berbentuk batang, dan secara alami sering ditemukan tanah dan vegetasi.
Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35C. Bacillus
subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun dibawah kondisi keras
dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stress situasi kondisi pH rendah
(asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol. Bakteri
ini hanya memiliki satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom.
Bacillus subtilis pada medium nutrien cair : pada media cair penampakan bakteri
ditunjukkan dengan keruhnya warna yang terjadi pada media cair , seperti halnya
pada media yang lain, pada media cair ini kebanyakan penampakan pertumbuhan
bakteri terjadi diatas permukaan media cair, meskipun media ini berbentuk cair, tapi
bakteri ini tetap saja bergerak ke atas untuk mendapatkan oksigen lebih banyak. Ini
semua ditandai dengan adanya cairan seperti busa putih.
Escherichia coli, atau biasa disingkat E.coli adalah salah satu jenis spesies utama
bakteri gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich
ini dapat ditemukan dalam usus besar manusia. Kebanyakan E.coli tidak berbahaya
dapat mengguntungkan manusia dengan memproduksi vitamin K2, atau dengan
mencegah bakteri lain dalam usus. E.coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat
dan mudah dalam penanganannya. Pada media nutrien cair ini penampakkan bakteri
ditunjukkan adanya keruh warna yang terjadi pada media cair, seperti halnya pada
media cair ini pun kebanyakkan penampakan pertumbuhan bakteri terjadi diatas

permukaan media cair, meskipun media ini berbentuk cair dan berbusa, tapi bakteri
ini bergerak keatas untuk mendapatkan oksigen lebih banyak. Medium nutrien agar
tegak, medium agar miring dan medium nutrien cair sebagai media penanaman
bakterinya.
Melakukan isolasi mikroba bahan bahan yang digunakan, yaitu suspensi
mikroba/campuran mikroba dan nutrien agar tegak. Suspensi mikroba/campuran
mikroba yaitu bakteri yang berkelompok yang terdapat pada media yang telah digores
oleh suatu sampel bila suspensi yang terbentuk kental, maka bakteri yang terkandung
dalm suspensi itu adalah bakteri gram negative namun bila suspensi yang terbentuk
encer maka bakteri yang terbentuk adalah gram positif. Nutrien agar tegak sebagai
medium yang digunakan untuk pertumbuhan mikroorganisme heterotrof.
Dalam penagamatan pertumbuhan mikroba menggunakan bahan bahan
sebagai berikut, kultur bakteri E.coli dalam medium Nutrien agar, 100ml medium
pertumbuhan Nutrien beef dalam 250ml erlenmeyer, dan media tanpa bakteri sebagai
blanko. Kultur bakteri E.coli dalam medium nutrien agar untuk diinokulasikan
(memindahkan bakteri dari medium lama ke medium yang baru) dengan medium
nutrien beef. Media tanpa bakteri sebagai blanko sebagai parameter.
Berikut tahap tahap pekerjaan menanam mikroba aerob, isolasi mikroba dan
pengamatan pertumbuhan mikroba, yaitu :
a. Menanam mikroba aerob
Biakan agar tegak
Sebelum melakukan percobaan, praktikan terlebih dahulu
menyemprotkanmeja kerja dan telapak tangan yang telah memakai sarung tangan
dengan alkohol 70% tujuannya agar steril dari mikroorganisme. Kemudian
mensterilkan jarum ose ranting dicelupkan alkohol lalu dilewatkan diatas nyala
api spirtus. Setelah itu mengambil biakan murni dengan cara membuka kapas
penutup tabung dengan kelingking tangan kanan, posisi tabung agak dimiringkan.
Lalu mengambil inokulum dengan menggunakan tabung dengan nyala api spirtus,
lalu tutup kembali. Kemudian ambil media agar tegak yang akan di inokulasi.
Melepas tutup kapasnya dan memasukkan jarum yang sudah menempel bakteri ke
media agar tegak, lalu mulut tabung dipanaskan ke nyala api spirtus dan tutup
kembali dan beri etiket.
Biakan agar miring
Cara perlakuan biakan agar miring hampir sama dengan biakan agar tegak.
Praktikan terlebih dahulu menyemprotkan meja kerja dan telapak tangan yang
telah memakai sarung tangan dengan alkohol 70% tujuannya agar steril dari
mikroorganisme. Kemudian mensterilkan jarum ose tumpul diatas nyala api
spirtu. Lalu, buka kapas tabung raksi yang berisi biakan murni dan ambil denga
menggunakan ose tumpul. Ambil tabung yang berisi media agar miring dan mulut
tabung dipanaskan diatas nyala api spirtus. Setelah itu masukkan jarum ose
tumpul yang sudah menempel bakteri ke media agar miring. Kemudian mulut
tabung tadi dipanaskan dan tutup kembali. Dan beri etiket tempelkan pada tabung.
Biakan agar cair
Praktikan terlebih dahulu menyemprotkan meja kerja dan telapak tangan yang
telah memakai sarung tangan dengan alkohol 70% tujuannya agar steril dari
mikroorganisme. Mensterilkan jarum ose tumpul yang akan digunakan, cara
mensterilkannya dengan melewati diatas nyala api spirtus. Lalu ambil tabung yang

berisi inokulum, buka kapas yang ada di mulut tabung kemudian mengambil
inokulum tersebut dengan menggunakan jarum ose tumpul yang sudah disterilkan
tadi. Setelah itu mengambil tabung yang berisi media agar cair, dan memanaskan
mulut tabung tersebut diatas nyala api spirtus. Setelah itu masukkan jarum ose
tumpul yang telah menempel bakteri ke dalam tabung yang berisi media cair.
Lalu, mulut tabung tadi dipanaskan kembali dan tutup dengan kapas lagi. Dan beri
etiket tempelkan pada tabung.
Setelah tiga perlakuan diatas tersebut selesai, tabung tabung yang telah
diberi etiket dimasukkan kedalam plastik untuk diikubasi pada susu 37C.
b. Isolasi mikroba
Siapkan air 200ml ditampung didalam gelas beker. Kemudian ambil nutrien
agar tegak dan letakkan ke dalam gelas beker yang berisi air tadi dan panaskan
diatas pemanas pada suhu 250C sampai nutrien agar tersebut cair. Setelah cair,
angkat dan diletakkan ke dalam gelas beker yang berbeda yang telah didalamnya
terdapat kertas tujuannya agar panas tabung yang berisi nutrien agar tersebut tidak
langsung terkena pada media kerja (kontaminasi). Lalu masukkan nutrien agar
tegak ke dalan cawan petri steril dan membuat goresan menggunakan ose tumpul
yang sudah steril. Serta beri etiket dan tutup kembali. Membalik cawan petri yang
telah diberi etiket dan membungkus kembali dengan kertas. Kemudian inkubasi
pada suhu 37C.
Teknik penanaman dengan goresan (streak) brtujuan untuk mengisolasi
mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium
baru. Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan
waktu., tetapi memerlukan keterampilan yang diperoleh dengan latihan.
Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum
digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawan petri steril dengan
jarum ose tumpul, diantara garis garis goresan akan terdapat sel sel yang
cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni.
c. Pengamatan pertumbuhan mikroba
Mengambil satu ose koloni bakteri dari media nutrien agar, lalu menginokulasi
kedalam media pertumbuhan nutrien beef pada erlenmeyer. Setelat itu mengambil
1ml suspensi bakteri dan memindahkan dalam kuvet plastik. Kemudian mengukur
media tanpa suspensi bakteri sesuai blanko pada spektrofotometer dengan panjang
gelombang 600nm. Mengulangi pengukuran absorbansi tiap 3jam selama 27jam
da membuat grafik hubungan antara absorbansi versus watu pengukuran.
Alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi adalah Spektrofotometer. Kerja
spektrofotometer yaitudengan cara melewatkan cahaya dengan panjang
gelombang tertentu sesuai jenis atom pada suatu obyek kaca yang disebut kuvet.
Sebagian cahaya akan diserap dan sisanya akan dilewatkan sebanding degan
konsentrasi larutan dalam kuvet. Berikut gambar kurva yang didapat berdasarkan
absorbansi dengan waktu :

3000
2500
2000
1500
1000
500
0

E.Coli
Column1

3. PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA


Perhitungan jumlah mikroba berujuan agar mahasiswa mengetahui cara cara
perhitungan jumlah mikroba, baik secara langsung maupun tidak langsung serta
melakukan perhitungan jumlah mikroba yang ada pada suatu bahan. Penentuan
jumlah angka mikroba sangat penting dilakukan untuk menetapkan keamanan suatu
sediaan farmasi dan makanan. Berbagai metod telah dikembangkan untuk menghitung
jumlah mikroorganisme. Metode tersebut menghitung sel, massa sel, atau isi sel yang
sesuai dengan jumlah sel. Perhitungan mikroba dapat dilakukan dengan dua cara
yaitu, sebagai berikut :
a. Perhitungan secara langsung merupakan perhitungan yang menghitung jumlah
total sel (sel mati dan hidup) yang ada pada sampel. Keuntungan metode ini yaitu
pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan. Namun
mempunyai kelemahan sebagai yakni sel sel mikroba yang telah mati tidak
dapat dibedakan dari sel yang hidup. Karena itu keduanya terhitung. Dengan kata
lain hasil yang diperoleh ialah jumlah total sel yang ada di dalam populasi.
b. Perhitungan secara tidak langsung merupakan perhitungan yang dipakai untuk
menentukan jumlah mikroba yang hidup atau hanya menentukan jumlah mikroba
yang hidup saja. Untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup dapat dilakukan
setelah suspensi bahan atau biakan mkroba diencerkan beberapa kali dan
ditumbuhkan dalam medium dengan cara tertentu tergantung dari macamnya
bahan dan sifat mikrobanya.
Dalam percobaan perhitungan mikroba ini yaitu plate count.
a. Plate Count Method, termasuk perhitungan secara tidak langsung. Umumnya,
dilakukan dengan cara melarutkan sampel asli dalam berbagai serial pelarutan.
Kemudian masing masing hasil pelarutan di biakan pada agar, entah dengan
teknik pour plate ataupun streak plate. Setelah itu, inkubasi dilakukan dan koloni
di amati pada cawan agar dan dihitung sebagai jumlah total koloni yang
membentuk unit. Ada dua metode yang umum digunakan dalam plate coun, yaitu
spread-plate methode dan pour-plate methode.
Namun dalam percobaan kali ini yang digunakan dalam perhitungan mikroba
secara plate count menggunakan pour-plate methode. Pour-plate methode, volume
yang biasa digunakan yaitu 0,1 1 ml dari kultur untuk diletakkan pada cawan petri.
Kemudian, cawannya diinkubasikan hingga koloni muncul.

Berikut tahap tahap percobaan plate count :


Pertama, mempersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Alat alat tersebut,
yaitu cawan petri sebagai tempat pencampuran medium dengan suspensi
pengenceran, gelas ukur untuk mengukur dalam pengambilan 1ml sampel dll, tabung
reaksi digunakan untuk tempat campuran sampel dengan aqua steril, dan pipet tetes
membantu kita pada saat mengambil larutan yang sukar larut. Dan bahan bahan
yang digunakan yaitu antara lain sampel bahan yang akan dicampurkan dengan
aquadest dan medium agar sebagai bahan utama.
Kedua, setelah alat alat dan bahan telah tersedia diatas meja kerja lakukan sterilisasi
terlebih dahulu pada meja kerja dan telapak tangan praktikan sebelum melakukan percobaan. Setelah itu, cairkan medium agar yang terdapat didalam tabung reaksi dengan
cara meletakkan tabung reaksi ke dalam gelas beker yang berisi air sampai medium
agar tersebut cair. Kemudian ambil 1ml samoel (medium agar) dan masukkan ke
dalam erlenmeyer yang berisi 99ml aqua steril, gojog hingga homogen (tercampur
keseluruhan).
Ketiga, masukkan pengenceran 101 dengan cara memasukkan campuran sampel tadi,
Dan masukkan ke dalam tabung 1. Lalu, dari tabung 1 ambil 1ml dan masukkan ke
cawan petri steril dan goyangkan angka 8 diatas meja kerja. Setelah itu, ambil 1ml
suspensi tabung 1 dimasukkan ke tabung 2. Kemudian 1ml dari tabung 2 masukkan ke
cawan petri (penghantar 1) dan goyangkan angka 8 diatas meja kerja. Lakukan
pengenceran hingga pengenceran 105. Setelah itu, bungkus cawan dan inkubasi
selama 24jam. Dan lakukan pengerjaan diatas lagi (replikasi).
Didapatkan hasil perhitungan jumlah mikroba, yaitu :
1x10-6 1x10-7
Replikasi 1
73
59
Replikasi 2
129
49
Pengenceran 10-6 (A) = (73+129 : 1x10-6) : 2 = 101x106
Pengenceran 10-7 (B) = (59+49 : 1x10-6) : 2 = 54x107 = 540x106
Jadi, B : A = 540x106 : 101x106 = 5,34 CFU/ml
B/A > 2 yang dipakai adalah jumlah mikroba dari hasil pengenceran sebelumnya.
Kelebihan dari pour-plate method adalah volume sampel dapat mencapai 1ml.
Kekurangan dari pour-plate method adalah organisme yang akan dihitung jumlahnya
harus kuat menghadapi suhu dari agar. Selain itu, pengamatan perhitungan juga harus
diamati dengan baik baik, sebab koloninya dapat tumbuh didalam medium juga
(aerob dan anaerob).
Secara keseluruhan, kelebihan dari metode plate count adalah menghasilkan
estimasi jumlah total sel bakteri yang masih hidup. Selain itu, teknik ini juga memiliki
tingkat sensitifitas pada kontaminasi oleh mikrobiologi di makanan dan material
lainnya. Kekurangannya adalah dapat terjadi banyak kesalahan yang diakibatkan oleh
Inkonsistensi plating, pipetting yang tidak akurat, dan banyak faktor lainnya.
4. PENGECATAN DAN MORFOLOGI MIKROBA
Percobaan ke 4 yaitu pengecatan dan morfologi mikroba, yang bertujuan agar
setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat mengetahui tujuan dari
pengecatan serta melakukan pengecatan terhadap mikroba. Bakteri atau mikroba

bersifat transparan, berukuran kecil sehingga tidak dapat dilihat secara langsung tanpa
alat yang mempunyai pembesaran dan bisa saja teknik khusus.
Untuk mengetahui struktur, morfologi dan sifat kimia bakteri, kita perlu
melakukan percobaan pengecatan terhadap bakteri atau mikroba tersebut. Prinsip
dasar dari pengecatan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pengecatan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan
ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada
pengecatan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan
pewarna basa.
Zat warna adalah senyawa kimia yang berupa garam garam yang salah satu ionnya
berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif.
Senyawa senyawa kimia ini berfungsi untuk membedakan bakteri bakteri karena
reaksinya dengan sel bakteri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang
digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri.
Tujuan dari pengecatan yaitu :
a. Mempermudah melihat bentuk jasad mikroba baik bakteri, yeast, ataupun kapang.
b. Memperjelas ukuran dan bentuk mikroba.
c. Melihat struktur luar dan kalu memungkinkan juga struktur dalam mikroba dapat
dilihat.
d. Melihat reaksi mikroba terhadap peawarna (cat) yang diberikan sehingga sifat
fisik dan kimia yang ada dapat diketahui.
Faktor faktor yang mempengaruhi pengecatan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna,
substrat intensifikasi, pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup.
Morfologi mikroba dapat dibedakan menjadi dua, yaitu :
a. Morfologi makroskopik, populasi mikroba tumbuh sangat cepat ketika
mikrobanya ditambahkan dan disesuaikan dengan gizi dan kondisi lingkungan
yang memungkinkan untuk berkembang. Melalui pertumbuhan ini, berbagai jenis
bakteri dan kadang memberi penampilan yang khas. Beberapa koloni mungkin
akan berwarna, ada yang tidak teratur. Karakteristik koloni (bentuk, ukuran,
margin, elevasi, warna, permukaan, konsistensi) yang diistilahkan morfologi
koloni.
b. Morfologi mikroskopik adalah karakteristik bakteri yang dilihat melalui
pengamatan dibawah mikroskop. Bentuk bakteri sangat bervariasi, tetapi secara
umum ada tiga tipe, yaitu bentuk bulat (coccus), bentuk batang (basil), bentuk
spiral (spirilium).
- Bentuk bulat (coccus) dibedakan lagi menjadi enam, yaitu micrococcus (bulat,
satu satu), diplococcus (bulat, bergandengan dua dua), staphyllococcus
(bulat, tersusun seperti untaian buah anggur), streptococcus (bulat,
bergandengan seperti rantai), sarcina (bulat, terdiri 8sel yang membelah sel ke
3arah), tetracoccus (bulat, tersusun dari 4sel berbentu bujur sangkar).
- Bentuk batang dapat dibedakan ke dalam bentuk batang panjang dan batang
pendek.bakteri bentuk batang dapat terdiri atas : sel tunggal (monobasil),
bergandengan dua dua (diplobasil), sebagai rantai (streptobasil).
- Bentuk lengkung (spiral) dapat dibagi menjadi tiga, yaitu bentuk koma
(vibrio), bentuk spiral jika lengkungannya lebih dari setengah lingkaran,
bentuk spiroseta (berupa spiral yang halus dan lentur).

Berikut tahap tahap percobaan pengecatan dan morfologi mikroba yang


kami lakukan, yaitu :
a. Pengecatan sederhana
Pengecatan sederhana digunakan untuk memperlihatakan atau untuk
memperjelas kontras antara sel dan latar belakang sehingga dapat mempertajam
bentuk dari sel sel mikroba itu sendiri. Dengan cara mewarnai sel sel mikroba
dengan zat warna.
Terlebih dahulu kami mempersiapkan alat alat dan bahan yang akan digunakan.
Alat alat yang digunakan, yaitu objek glass, lampu spirtus, dan ose tumpul.
Objek glass sebagai tempat biakan yang akan diamati bentuk dan morfologinya.
Lampu spirtus untuk mensterilkan alat alat yang akan bersentuhan dengan
biakan. Dan ose tumpul digunakan pada saat mengambil biakan dari tabung
reaksi. Sedangkan bahan bahan yang digunakan yaitu biakan murni Cereus dan
cat kristal violet. Biakan murni Cereus digunakan sebagai bahan utama biakan
murni. Cat kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini
merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada
mikroorganisme.kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel
mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel
mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna ungu.
Mensterilkan gelas objek dengan cara membersihkannya dengan
menyemprotkan alkohol 70% hingga bebas lemak lalu, panggang / panaskan diatas
nyala api spirtus. Serta mensterilkan jarum ose tumpul dengan cara yang sama seperti
gelas objek. Kemudian ambil secara aseptik 1 ose suspensi biakan Cereus dan ratakan
kira kira 1cm di gelas objek. Setelah itu kering anginkan preparat tersebut kemudian
fiksasi dengan melewatkannya beberapa kali diatas nyala api spirtus. Dan dinginkan,
lalu teteskan 1 tetes cat kristal violet dan biarkan selama 1 2 menit. Kemudian cuci
dengan aquadest hingga sisa cat habis dan kering anginkan. Lalu, amati dengan
mikroskrop dengan 40xpembesaran.
Deskripsi Bacillus cereus :
a. Tekstur : berlekuk
b. Ukuran : large (lebar)
c. Pigmentasi : krem
d. Bentuk koloni : Irregular (tepian yang berlekuk)
e. Tepi : Lobate (lekukan yang jelas)
f. Elevasi : Raised (sedikit menonjol)
Bacillus cereus dengan sel batang berukuran 0,3-22x1.27-7m, aerob fakultatif
(dapat menggunakan oksigen tetapi dapat juga menghasilkan energi secara
anaerobik), dan dapat membentuk spora (endospora). Spora Bacillus cereus lebih
tahan pada panas kering daripada panas lembab dan dapat bertahan lama pada produk
yang kering dan tidak membengkakan sporangiumnya. Bakteri ini dapat ditemukan di
tanah, pada sayuran maupun produk pangan.
b. Pengecatan Gram
Pengecatan gram atau metode gram adalah suatu metode untuk membedakan
spesies bakteri untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar
yaitu gram positif dan gram negatif berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel
mereka. Dengan metode pewarnaan gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi
dua yaitu bakteri gram positif dan gram negatif.

Untuk melakukan percobaan pengecatan gram terlebih dahulu mempersiapkan alat


alat dan bahan yang akan digunakan. Alat yang digunakan, yaitu objek glass,
lampu spirtus, dan ose. Objek glass sebagat tempat biakan yang akan diamati
bentuk dan morfologi dari biakan tersebut. Lampu spirtus sebagai alat pada saat
sterilisasi alat alat lain yang akan bersentuhan dengan biakan. Serta ose tumpul
untuk membantu kita pada saat mengambil biakan. Sedangkan, bahan bahan
yang digunakan yaitu biakan murni B.Subtilis, biakan murni E.coli, larutan cat
kristal violet (gram A), larutan lugol iodine (gram B), larutan alkohol (gram C)
larutan cat safranin (gram D).
Larutan cat kristal violet berwarna ungu. Merupakan pewarna primer (utama)
yang akan memberi warna mikroorganisme target. Crystal vilet bersifat basa
sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam,
dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu).
Larutan lugol iodine, zat ini bewarna coklat yang menyebabkan terbentuknya
kompleks ungu kristal-iodium dan cara memfiksasi zat warna yang sudah diserap
sehingga lebih kuat pengikatannya. Larutan alkohol merupakan solven organik
yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel
bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat
mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan
tetap berwarna ungu dan bakteri menjadi tidak berwarna. Larutan cat safranin
merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk
mewarnai kembali sel sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah
perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, memberikan warna pada
mikroorganisme non target.
Setelah alat alat dan bahan telah siap, kami melakukan percobaan
pengecatan gram. Membersihkan gelas objek dengan cara menyemprotkan
alkohol tujuannya untuk sterilisasi lalu panggang atau panaskan diatas lampu
spirtus dan hal yang sama seperti itu dilakukan pada mensterilkan ose tumpul.
Kemudian ambil secara aseptik 1 ose suspensi biakan B.Subtilis dan E.Coli
diletakkan pada gelas objek yang berbeda lalu ratakan kira kira 1cm. Setelah itu
kering anginkan lalu, fiksasi denga cara memanaskan diatas lampu spirtus. Setelah
dingin ditetesi cat gram A (kristal violet) memberi warna mikroorganisme target
2-3 tetes dan diamkan 1menit, lalu cuci dengan aquadest dan kering anginkan.
Kemudian, teteskan cat gram B (ludol iodine) untuk memfiksasi zat warna yang
sudah diserap sehingga lebih kuat pengikatnya. Cuci dengan aquadest hingga sisa
cat habis dan kering anginkan. Lalu cuci dengan larutan peluntur gram C (alkohol)
selama 30 detik untuk melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri. Lalu,
kering anginkan dan teteskan cat penutup gram D (safranin) untuk mewarnai
kembali sel sel yang telah hilang pewarna utama setelah perlakuan dengan
alkohol. Cuci dengan aquadest kering anginkan dan amati dengan mikroskrop
10xpembesaran.
Pada B.Cereus merupakan gram positif. Bakteri gram positif yaitu bakteri
yang mengikat warna utama (crystal violet) dengan kuat sehingga tidak dapat
dilunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh zat warna lawan (safranin)
pada mikroskrop sel sel bakteri tampak berwarna ungu. Tetapi pada hasil yang
kami dapat bakteri berwarna perpaduan ungu dan kehitaman.
Pada E.Coli merupakan gram negatif. Karena pada bakteri gram negatif yang
mempunyai daya mengikat zat warna utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan

oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskrop sel sel bakteri
tampak berwarna merah. Escherichia coli termasuk dalam famili
Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang
fermentatif.
5. MORFOLOGI FUNGI
Percobaan morfologi fungi bertujuan agar setelah melakukan praktikum ini
diharapkan mahasiswa dapat mengenali berbagai jenis jamur berdasarkan
morfologinya.
Struktur dasar jamur adalah hifa. Tubuh jamur tersusun dari komponen dasar yang
disebut hifa. Hifa membentuk jaringan yang disebut miselium. Miselium menyusun
jalinan jalinan semu menjadi tubuh buah. Ketebalan hifa bervariasi antara 0,5mm
100mm. Hifa terdiri atas sel sel sejenis. Sel sel tersebut satu dan lainnya
dipisahkan oleh dinding sel atau sekat yang dinamakan septum (jamak:septa) dan
dinamakan hifa bersepta.
Beberapa ahli mikologi membagi jamur menjadi dua kelompok berdasarkan
bentuk tubuhnya, yaitu kapang (mold) dan khamir (yeast). Kebanyakan jamur masuk
dalam kelompok kapang. Karena, tubuh vegetatif kapng berbentuk filamen panjang
bercabang yang seperti benang disebut hifa. Hifa akan memanjang dan menyerap
makanan dari permukaan substrat (tempat hidup jamur). Sedangkan jamur dalam
kelompok khamir bersifat uniseluler (berinti satu), bentuknya bulat atau oval.
Jamur tidak mempunyai batang, daun, dan akar serta tidak mempunyai sistem
pembuluh seperti pada tumbuhan tingkat tinggi. Jamur umumnya berbentuk seperti
benang, bersel banyak, dan semuadari jamur mempunyai potensi untuk tumbuh,
karena tidak mempunyai klorofil yang berarti tidak dapat membuat makanannya
sendiri.
Untuk melakukan pengamatan morfologi kapang mempersiapkan alat
alatnya, yaitu jarum preparat, gelas objek, gelas penutup, pipet tetes dan mikroskrop.
Jarum preparat membantu pada saat kita mengambil biakan jamur. Gelas objek
sebagai tempat meletakkan biakan jamur yang diamati. Pipet tetes untuk mengambil
larutan yang sukar diambil. Mikroskrop sebagai alat untuk melihat biakan jamur
dengan jelas.
Sedangkan bahan bahan yang digunakan, yaitu biakan murni dari Rhizopus sp.
larutan mounting laktofenol dan larutan methilen blue. Sebagai pewarna, digunakan
laktofenol untuk kapang metilen blue untuk khamir. Larutan laktofenol dapat
digunakan dalam pewarnaan pada khamir dan kapang. Organisme yang
tersuspensikan ke dalam larutan tersebut akan mati akibat fenol yang terdapat
didalamnya dan akan memberi efek transparan, sedangkan metilen blue memberi
warna pada kapang dan khamir.konsentrasi fenol yang tinggi membuat enzim yang
terdapat dalam sel terdeaktifasi tanpa menyebabkan terjadinya lisis. Laktofenol tidak
mudah menguap seperti aquadest sehingga preparat tidak mudah cepat kering dan sel
kapang tidak cepat rusak. Kerugian dari penggunaan laktofenol adalah apabila dipakai
terlalu lama lektofenol dapat mengubah bentuk sel. Laktofenol dapat mencegah
penguapan pengerutan sel, sehingga sel mudah diamati.

Setelah alat alat dan bahan telah ada. Bersihkan gelas objek dengan alkohol
70% agar steril lalu teteskan 1tetes laktofenol pada gelas objek. Setelah itu sterilkan
jarum ose tumpul diatas nyala lampu spirtus lalu, ambil biakan jamur dari Rhizopus
sp. dan letakkan di gelas objek yang telah ditetesi laktofenol. Apabila terdapat masa
miselium mungumpul, pisahkan dengan menggunakan 2 buah jarum preparat.
Kemudian tutup dengan gelas penutup hindari gelembung udara. Dan amati dibawah
mikroskrop dengan pembesaran 10x gambar morfologinya. Dan lakukan hal tersebut
lagi tetapi dengan menggunakan metilen blue.
Dari hasil yang didapat bahwa pada pengamatan Rhizopus sp. termasuk golongan
kapang (jamur benang) sporangiofor tampak transparan karena pengaruh laktofenol
dan sporangium berwarna biru karena menyerap warna metilen blue. Hasil yang
diperoleh sesuai denga referensi yaitu sporangiofora tumbuh drai stolon dan mengarah
ke udara, baik tunggal atau dlam kelompok, rhizoid tumbuh berlawanan dan terletak
pada posisi yang sama dengan sporangiofora, sporangia golobus atau sub globus
dengan dinding berspinulosa (duri-duri pendek), yang berwarna coklat gelap sampai
hitam bila telah masak, kolumela oval hingga bulat, denga dinding halus atau sedikit
kasar, spora bulat, oval atau berbentuk elips atau silinder. Rhizopus sp. merupakan
contoh spesies dari Zygomicotina.
6. SKRINING PRIMER UNTUK MENDAPATKAN MIKROBA RESISTEN
ANTIBIOTIK
Dalam percobaan skrining primer untuk mendapatkan mikroba resisten
tujuannya agar setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat
melakukan berbagai teknik mikrobiologi dalam skrining (menanam, mengisolasi dan
memurnikan biakan, melakukan tes terhadap kemampuan biakan terhadap antibiotik)
serta mendapatkan mikroorganisme yang resisten terhadap antibiotik.
Skrining adalah sejenis tes yang digunakan untuk mendeteksi adanya antibodi
spesifik atau mikroorganisme dalam sejumlah besar spesimen. Tes skrining relatif
mudah dan tidak mahal (peralatan yang dibutuhkan tidak terlalu rumit). Teknik
mikrobiologi dalam skrining (menanam, mengisolasi dan memurnikan biakan,
melakukan tes terhadap kemampuan biakan terhadap antibiotik. Antibiotik adalah
salah satu metabolit sekunder yang paling penting dieksploitasi secara komersial dan
digunakan dalam berbagai macam keperluan. Ada tiga jenis resistensi bakteri, yaitu :
a. Resistensi bawaan (primer), yang secara alamiah sudah terjadi pada kuman,
misalnya terdapat enzim penisilinase pada stafilokok yang merombak penisilin
dari sefalosporidin. Ada pula bakteri yang dinding selnya tidak dapat ditembusi
obat, misalnya basil tuberkolusa dan lepra.
b. Resistensi yang diperoleh (sekunder) adalah akibat kontak dari kuman dengan
kemoterapeutika dan biasanya disebabkan oleh pembentukan secara spontan jenis
baru dengan ciri yang berlainan.
c. Resistensi episomal berkaitan dengan kedua jenis diatas, pada tipe resistensi ini
pembawa faktor genesis berada diluar kromosom (rangkaian pendukung sifat
genetika).
Dalam percobaan skrining primer untuk mendapatkan mikroba resisten
antibiotik ada tiga tahap, sebagai berikut :

a. Tahap 1, alat alat yang digunakan yaitu pemanas, gelas beker, timbangan dan
cawan petri steril. Pemanas untuk mencairkan medium, gelas beker sebagai
tempat/wadah tabung reaksi yang berisi medium pada saat pemanasan. Timbangan
untuk menimbang sampel tanah. Dan cawan petri sebagai wadah suspensi.
Sedangkan, bahan yang digunakan yaitu medium dan sampel tanah.
Cairkan medium didalam gelas beker yang berisi air diatas penangas air, sambil
menunggu medium cair timbang tanah seberat 1g. Setelah media sudah cair,
encerkan 1g tanah di tabung 1 didalam 9ml air, lalu ambil 1ml antibiotik dan
medium kemudian tuang ke cawan petri. Kemudian ambil 0,5ml dan tuang ke
cawan petri, goyang angka 8. Lakukan pengenceran hingga konsentrasi 10-5.
Setelah itu inkubasi pada suhu 37C.
b. Tahap 2, pada tahap ini pengerjaan dilakukan didalam LAF (Laminar Air Flow)
merupakan meja kerja steril, tujuannya agar pada saat pengerjaan tidak
terkontaminasi debu, dan spora spora lainnya. Alat alat yang digunakan, yaitu
lampu spirtus, dan ose tumpul. Lampu spirtus untuk melakukan sterilisasi alat
alat yang akan bersentuhan dengan mikroba dan media cair. Ose tumpul
digunakan pada saat mengambil mikroba. Sedangkan bahan bahannya yaitu
mikroba yang di cawan petri pada saat penanaman tahap 1, dan media cair sebagai
media pertumbuhan.
Sterilkan ose tumpul dengan alkohol lalu dipanaskan diatas nyala lampu spirtus.
Kemudian, ambil mikroba yang terdapat di cawan petri (pengenceran 10-4) dengan
menggunakan ose tumpul. Lalu tanam pada media cair ditabung. Setelah itu tutup
tabung dengan plastik dan inkubasi pada suhu 37C selama 24jam. Dan lakukan
hal yang sama terhadap media pertumbuhan dengan pengenceran 10-5.
c. Tahap 3, dalam tahap ini tempat pengerjaannya sama dengan tahap 2 yaitu
didalam LAF. Alat alat yang digunakan yaitu lampu spirtus, ose tumpul dan
cawan petri. Bahan yang digunakan yaitu biakan mikroba, media nutrien beef dan
paper disk.
Sterilkan ose tumpul diatas nyala lampu spirtus, lalu ambil biakan mikroba
didalam tabung. Kemudian tanam dalam media nutrien beef. Setelah itu tuang
suspensi lalu tuang juga medium agar ke cawan petri tunggu hingga beku.
Kemudian letakkan paper disk diatas permukaan media. Inkubasi pada suhu 37C
selama 24jam. Setelah itu tetesi dengan 10l larutan antibiotik, dan ukur diameter
hambat untuk masing masing antibiotik, interprestasikan hasil dengan antibiotik.
7. UJI SENSITIFITAS MIKROBA TERHADAP ANTIBIOTIK (METODE KIRBY
BAUER)
Setelah melakukan praktikum uji sensitifitas mikroba terhadap antibiotik
(metode kirby bauer diharapkan mahasiswa dapat melakukan uji sensitifitas terhadap
antibiotik dengan metode Kirby Bauer serta menentukan mikroba uji termasuk sensitif
atau resisten terhadap antibiotik yang diujikan.
Antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme
(khususnya dihasilkan oleh fungi) atau dihasilkan secara sintetik yang dapat
membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan organisme lain. Tiap tiap
antibiotik memiliki efektivitas yang berbeda beda terhadap mikroorganisme

(bakteri). Beberapa antibiotik dapat bekerja dengan baik pada bakteri gram negatif
dan beberapa antibiotik lainnya ada yang lebih efektif pada bakteri gram positif.
Dalam uji sensitifitas mikroba terhadap antibiotik dengan menggunakan
metode kirby bauer, kami dapat mengetahui beberapa jenis bakteri yang sensitif
terhadap antibiotik yang diujikan. Terlebih dahulu mempersiapkan alat alat yang
dibutuhkan yaitu cawan petri, jangka sorong, dan erlenmeyer 50cc. Sedangkan bahan
bahan yang digunakan yaitu media nutrien agar, kultur E.Coli dan B.Aureus dalam
media nutrien cair berumur 24jam, antibiotik dan paper disk. Media nutrien agar
sebagai medium pertumbuhan, kultur E.Coli dan B.Aureus dalam media nutrien cair
sebagai bahan mikroba yang diuji dengan antibiotik. Paper disk untuk mengukur
sensitifitas antibiotik dengan metode paper disk yang berisi agen antimikroba pada
media yang telah ditanami mikroba dan akan berdifusi pada media agar. Daerah jernih
disekitar paper disk merupakan hambatan mikroba oleh antibiotikpada permukaan
agar. Setelah alat alat dan bahan telah siap, berikut ini tahap tahap yang kami
lakukan pada percobaan uji sensitifitas mikroba terhadap antibiotik dengan
menggunakan metode kirby bauer, yaitu alat alat dan bahan yang digunakan terlebih
dahulu disemprotkan alkohol tujuannya agar steril karena pengerjaan ini dikerjakan di
LAF (Laminar Air Flow) yaitu meja kerja steril untuk melakukan inokulasi /
penanaman. Kemudian masukkan alat alat dan bahan tersebut ke dalam LAF, lalu
sterilkan ose tumpul diatas nyala lampu spirtus. Ambil biakan E.Coli dan tanam di
media nutrien beef, begitu pula biakan B.Aureus ambil menggunakan osen dan tanam
pada media nutrien beef yang berbeda dengan E.Coli. setelah itu tuang suspensi
E.coli dalam cawan petri lalu tuang medium agar dalam cawan yang sudah dicairkan
terlebih dahulu dan tunggu hingga padat. Setelah itu taruh paper disk dan tetesi
antibiotik ampicillin dan gentamisin, tutup cawan dan bungkus dengan kertas.
Tujuannya dibungkus dengan kertas yaitu agar hasilnya tidak mudah terkena cahaya.
Dan di inkubasi.
Perlakuaan diatas sama juga dilakukan pada biakan B.Aureus. Catatan:masing
masing dalam cawan petri diletakkan 2 paper disk.
Dari hasil percobaan uji sensitifitas dengan menggunakan metode Kirby-Bauer
kami dapat mengetahui beberapa jenis bakteri yang sensitif terhadap antibiotika yang
diujikan. Didapatkan zona hambat / zona bening. Hal tersebut menunjukkan bahwa
bakteri sensitif terhadap antibiotik. Antibiotik ampisilin bekerja dengan menghambat
sintesis dinding sel yaitu dengan menyerang peptidoglikan dan mampu melakukan
penetrasi pada bakteri gram positif dan gram negatif. Hal ini disebabkan keberadaan
gugus amino pada ampicillin, sehingga membuatnya mampu menembus membran
terluar (outer mebran) pada bakteri.
Perbedaan luas / lebar diameter zona hambat pada cawan E.Coli dan B.Subtilis
disebabkan faktornya, yaitu konsentrasi antibiotik yang diserap oleh paper disk pada
cawan berbeda karena larutan antibiotik pada tiap konsentrasi kurang homogen.

BAB IV
KESIMPULAN
1. Mahasiswa telah mampu memahami tujuan dan cara cara sterilisasi, melakukan
sterilisasi dengan menggunakan autoklaf, mengetahui penggunaan dan macam
medium serta membuat medium.
a. Sterilisasi adalah suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat
pada suatu benda.
b. Tujuan sterilisasi agar alat alat yang digunakan bersih dari mikroorganisme
selain itu juga untuk mencegah peralatan cepat rusak.
c. Cara cara sterilisasi yaitu sterilisasi secara fisik, kimia dan mekanik. Tetapi yang
sering digunakan keseluruhan praktikut menggunakan sterilisasi secara fisik.
d. Medium pertumbuhan (disingkat dengan medium) adalah tempat untuk
menumbuhkan mikroba. Tujuannya dalam penelitian agar mengurangi populsa
mikroba yang ada di lingkungan.
e. Kelompok kami membuat medium nutrien agar tegak untuk bahan praktikum
selanjutnya yaitu sebagai media penanaman.
Jadi, mahasiswa telah mencapai nilai nilai tujuan praktikum.
2. Mahasiswa dapat melakukan penanaman, dan isolasi mikroba serta mengamati
pertumbuhan bakteri.
a. Penanaman (inokulasi) merupakan suatu pekerjaan memindahkan bakteri dari
medium lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi.
b. Kelompok kami melakukan menanan mikroba aerob tiga macam yaitu biakan agar
tegak, biakan agar miring, dan biakan cair.
c. Bakteri aerob adalah bakteri yang membutuhkan oksigen untuk proses respirasi,
pertumbuhan, kelangsungan hidup dan bereproduksi.
d. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan
mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam macam mikroba.
e. Teknik yang dilakukan pada tahap isolasi yaitu teknik penanaman dengan goresan
(streak).
f. Untuk mengetahui pertumbuhan mikroba, kami melakukan pengamatan
absorbansi tiap 3jam selama 27jam.
g. Absorbansi adalah rasio logaritmik dari radiasi yang dipaparkan ke suatu bahan
terhadap radiasi yang ditransmisikan menembus bahan. Absorbansi digunakan
dalam spektrofotometer.
3. Mahasiswa telah dapat mengetahui cara cara perhitungan mikroba, baik secara
langsung maupun tidak langsung, serta melakukan perhitungan jumlah mikroba yang
ada pada suatu bahan.
a. Perhitungan jumlah mikroba secara langsung, yaitu perhitungan yang menghitung
total sel (hidup dan mati) pada suatu sampel. Macam macamnya yaitu counting
chamber dan filter membran.
b. Perhitungan jumlah mikroba secara tidak langsung, yaitu perhitungan yang
dipakai untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup atau hanya menentukan
jumlah mikroba yang hidup saja. Macam macamnya, yaitu kekeruhan, analisa
kimia, berat kering, cara pengenceran, MPN, dan jumlah koloni (plate count).
c. Yang kami lakukan dalam perhitungan jumlah mikroba secara tidak langsung
yaitu berdasarkan jumlah koloni (plate count).

d. Hasil yang didapat yaitu


Pengenceran 10-6 (A) = (73+129 : 1x10-6) : 2 = 101x106
Pengenceran 10-7 (B) = (59+49 : 1x10-6) : 2 = 54x107 = 540x106
Jadi, B : A = 540x106 : 101x106 = 5,34 CFU/ml
B/A > 2 maka yang dipakai adalah jumlah mikroba dari hasil pengenceran
sebelumnya.
4. Pengecatan dan morfologi mikroba dalam praktikum ini, mahasiswa telah mampu
mengetahui tujuan dari pengecatan dan melakukan pengecatan terhadap mikroba
a. Tujuan dari pengecatan yaitu mempermudah melihat mikroba, memperjelas
ukuran dan bentuk mikroba, melihat struktur luar dan bila memumngkinakan
struktur dalam dapat terlihat, serta melihat reaksi mikroba terhadap cat yang
diberikan, sehingga sifat sifat fisik dan kimia yang ada bisa di deteksi.
b. Kami melakukan pengecatan sederhana dengan hanya menggunakan cat krista
violet. Dari hasil yang didapat bahwa B.Cereus memiliki tekstur yang berlekuk,
ukuran large (lebar), warna krem, bentuk koloni sepertitepian yang berlekuk.
c. Pengecatan gram yang kami lakukan tujuannya untuk membedakan gram positif
dan gram negatif.
d. B.Cereus merupakan gram positif karena dapat mengikat warna utama (crystal
violet) dengan kuat sehingga tidak dapat dilunturkan oleh peluntur. Pada
mikroskop sel sel bakteri berwarna ungu perpaduan hitam.
e. E.Coli merupakn gram negatif karena pada gram negatif mempunyai daya
mengikat zat warna utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh zat warna
lain (safranin) . pada mikroskrop sel sel bakteri tampak berwarna merah.
5. Setelah melakukan praktikum morfologi fungi, mahasiwa telah dapat mengenali
berbagai jenis jamur berdasarkan morfologinya.
a. Ada tiga golongan jamur yaitu kapang (jamur benang), khamir (yeast) dan
cendawan (mushroom).
b. Melakukan pengamatan morfologi kapang dari biakan murni Rhizopus sp.
sporangiofor tampak transparan karena pengaruh laktofenol dan sporangium
berwarna biru karena karena menyerap warna metilen blue.
6. Dalam percobaan skrining primer untuk mendapatkan mikroba resisten antibiotik,
kami dapat melakukan berbagai teknik mikrobiologi dalam skrining (menanam,
mengisolasi dan memurnikan biakan, melakukan tes terhadap kemampuan biakan
terhadap antibiotik) serta mendapatkan mikroorganisme yang resisten terhadap
antibiotik.
a. Skrining adalah sejenis tes yang digunakan untuk mendeteksi adanya antibodi
spesifik atau mikroorganisme dalam sejumlah besar spesimen.
b. Ada tiga jenis resistensi bakteri yaitu resistensi bawaan (primer), resistensi yang
diperoleh (sekunder), dan resistensi episomal.
c. Didapat hasil diameter hambatan pada sampel tanah, yaitu
B = 0,71
V = 1,26 + 1,86 2 = 1,56.
7. Percobaan sensitifitas mikroba terhadap antibiotik (metode kirby-bauer) kita telah
mampu melakukan uji sensitifitas terhadap antibiotik dengan menggunakan metode

kirby-bauer serta menentukan mikroba uji termasuk sensitif atau resisten terhadap
antibiotik.
a. Uji sensitifitas mikroba terhadap antibiotik dengan menggunakan metode kirby
bauer, kami dapat mengetahui beberapa jenis bakteri yang sensitif terhadap
antibiotik yang diujikan.
b. Prinsip dasarnya adalah dengan meletakkan paper disk yang telah mengandung
antibiotik dengan konsentrasi dan kadar tertentu pada media agar yang telah
ditanam bakteri uji.
c. Zona hambat / bening yang dihasilkan disekitar paper disk inilah yang digunakan
sebagai dasar penentuan tingkat resistensi.
d. Didapat hasil yaitu :
E.Coli :
B = 0,69
V = (2,1 + 2,21) 2 = 2,155
B.Aureus :
B = 4,69 + 3,89 2 = 4,29
V = 2,31 + 2,32 2 = 2,315

DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro.2003. Dasar Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.
Gandjar, I., R.A. Samson, K.U.D. Tweel-Vermelen, A. Oetari, & I.Santoso.1996.
Pengenalan Kapang Tropik Umum. Jakarta : Yayasan Obor Indonesia.
Hafsan. 2011. Mikrobiologi Umum. Makassar : Alauddin University Press.
Irianto, Koes.2006. Mikrobiologi Jilid 1. Bandung : CV. Bandung : CV.Yrama Widya.
Natrsir.2003. Mikrobiologi Farmasi Dasar. Makasar : Universitas Hasanudin.
Pelczar, M.J dan E.C.S Chan. 2005. Dasar Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.
Syamsuri, Istamar.2004. Biologi. Jakarta : Erlangga.