DISUSUN OLEH :
NAMA
NIM
: 1408010057
GOLONGAN
: II
KELOMPOK
:V
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO
2015
BAB I
I.I TUJUAN
1. STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat :
a. Mengetahui tujuan dan cara cara sterilisasi.
b. Melakukan sterilisasi dengan menggunakan autoklaf.
c. Mengetahui penggunaan dan macam medium.
d. Membuat medium.
2. PENANAMAN, ISOLASI dan PENGAMATAN PERTUMBUHAN MIKROBA
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat melakukan penanaman
dan isolasi mikroba serta mengamati pertumbuhan bakteri.
3. PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat :
a. Mengetahui cara cara perhitungan jumlah mikroba, baik secara langsung
maupun tidak langsung.
b. Melakukan perhitungan jumlah mikroba yang ada pada suatu bahan.
4. PENGECATAN DAN MORFOLOGI MIKROBA
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat :
a. Mengetahui tujuan dari pengecatan.
b. Melakukan pengecatan terhadap mikroba.
5. MORFOLOGI FUNGI
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat mengenali berbagai
jenis jamur berdasarkan morfologinya.
6. SKRINING PRIMER UNTUK MENDAPATKAN MIKROBA RESISTEN
ANTIBIOTIK
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat :
a. Melakukan berbagai teknik mikrobiologi dalam skrining (menanam, mengisolasi
dan memurnikan biakan, melakukan tes terhadap kemampuan biakan terhadap
antibiotik).
b. Mendapatkan mikroorganisme yang resisten terhadap antibiotik.
7. UJI SENSITIFITAS MIKROBA TERHADAP ANTIBIOTIK (METODE KIRBY
BAUER)
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat :
a. Melakukan uji senditifitas terhadap antibiotik dengan metode Kirby Bauer.
b. Menentukan miroba uji termasuk sensitifitas atau resisten terhadap antibiotik yang
diujikan
pada filter membran, kemudian ditetesi dengan minyak emersi supaya menjadi
transparan.
2. Perhitungan jumlah mikroba secara tidak langsung
Cara ini dapat digunakan untuk menentukan jumlah mikroba secara
keseluruhan baik yang hidup maupun yang sudah mati, atau hanya menentukan
jumlah mikroba yang masih hidup saja. Hal tersebut tergantung pada cara yang
digunakan.
a. Berdasarkan kekeruhan
Untuk keperluan ini digunakan alat-alat seperti photoelectric turbidimeter,
electrophotometer, spectrophotometer atau alat lain yang sejenis. Alat-alat
tersebut menggunakan sinar monokromatik dengan panjang gelombang
tertentu.
Populasi bakteri pada kultur dihitung dengan mengukur kekeruhannya dengan
menggunakan spektrofotometer. Umumnya, kekeruhan ditentukan sebagai
absorbansi dari kultur pada panjang gelombang 600nm, ditulis dengan istilah
OD600 (Optical Destiny pada 600nm). Nilai ini dapat diubah menjadi nilai
konsentrasi menggunakan faktor konversi standar dimana OD600 = 1 setara
dengan 109 sel/ml.
b. Berdasarkan analisa kimia
Umumnya digunakan untuk penentuan kandungan protein, asam asam
nukleat (DNA dan RNA) atau fosfor dari asam asam nukleat.
c. Berdasarkan berat kering
Cara ini untuk menentukan jumlah jamur yang memiliki hifa.
d. Menggunakan cara pengenceran
Cara pengenceran ini dipakai untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup
saja, dasar perhitungannya yaitu mengencerkan sejumlah volume tertentu dari
suspensi mikroba atau bahan secara bertingkat, kemudian diinokulasikan ke
dalam medium dan diinkubasikan, lalu dilihat ada pertumbuhan atau tidak.
Misalkan suatu seri pengenceran dengan kelipatan 10, pada pengenceran
1:1.000 ada pertumbuhan, tapi pada pengenceran 1:10.000 tidak ada
pertumbuhan, berarti secara teoritis jumlah mikroba antara 1.000 sampai
10.000 per ml bahan.
e. Menggunakan Most Probably Number (MPN)
Mengingat bahwa cara ini kurang tepat, untuk mengatasi persoalan tersebut
maka setiap pengenceran dibuat ulangan, hasilnya secara matematik dpat
untuk menentukan kemungkinan besar jumlah mikroba yang terdapat dalam
bahan tersebut. Untuk penentuan jumlah mikroba yang paling mungkin bisa
digunakan daftar MPN berdasarkan daftar Hoskins atau McCrady.
f. Berdasarkan jumlah koloni (plate count)
Cara ini paling umum digunakan untuk menentukan jumlah mikroba.
Dasarnya adalah dengan membuat suatu seri pengenceran bahan dengan
kelipatan 10, dari masing-masing pengenceran diambil 1 ml dan dibuat
taburan dalam cawan petri dengan medium agar yang sesuai dengan
mikrobanya.
Setelah inkubasi dilakukan perhitungan jumlah koloni pada tiap cawan petri
dari tiap tiap pengenceran. Dari jumlah koloni tiap cawan petri dpat
ditentukan jumlah mikroba tiap ml atau gram bahan, yaitu dengan mengalikan
jumlah koloni dengan kebalikan pengencerannya. Misalnya untuk
pengenceran 1:10.000 terdapat 45 koloni bakteri maka tiap ml atau gram
5. MORFOLOGI FUNGI
Fungi merupakan organisme kemoheterotrof yang memerlukan senyawa
organik untuk nutrisinya (sumber karbon dan energi). Jamur merupakan kelompok
mikroorganisme yang memiliki inti, tidak berklorofil, memiliki spora, umumnya
berkembang biak secara seksual dan aseksual, berbentuk filamen, struktur somatiknya
bercabang cabang, dinding selnya terdiri dari selulosa, kitin atau kombinasi dari
keduanya.
Berdasarkan cara memperoleh makanan, jamur dibagi menjadi tiga, yaitu
jamur bersifat parasit artinya memperoleh makanan dari organisme hidup lain. Jamur
bersifat saprofit, yaitu memperoleh makanan dari sisa sisa organisme yang telah
mati. Dan jamur yang bersifat mutual yaitu hidup saling menguntungkan (simbiosis
mutualisme) dengan organisme inangnya.
Ada tiga golongan jamur yaitu kapang (jamur benang), khamir (yeast), dan
cendawan (mushroom).
1. Kapang (mold) yaitu fungi yang berfilamen dan multiseluler.
Mofologi kapang sebagai berikut :
a. Tubuh kapang terbagi menjadi dua yaitu miselium merupakan kumpulan
beberapa filamen (hifa). Ada hifa vegetatif yang berfungsi untuk mendapakan
nutrisi, dan hifa reproduktif/hifa udara untuk alat reproduksi. Dan spora.
b. Tiga macam morfologi hifa yaitu aseptat (coenocytic hypha), septat hifa (hifa
bersekat), dan septat hifa dengan sel sel multinukleat.
2. Khamir (yeast) yaitu fungi yang memiliki sel tunggal dengan pembelahan sel
melalui pertunasan (budding).
Morfologi khamir sebagai berikut :
a. Bersel satu.
b. Tidak berfilamen.
c. Berbentuk oval atau bulat.
d. Tidak berflagella.
e. Berukuran lebih besar dari bakteri.
f. Lebar 1-5 mm, panjang 5-30 mm.
3. Cendawan (mushroom) yaitu fungi yang bersifat mengguntungkan karena dapat
digunakan sebagai bahan makanan.
Morfologi cendawan sebagai berikut :
a. Sel selnya berinti sejati (eukariotik).
b. Biasanya berbentuk benang.
c. Bercabang cabang.
6. SKRINING PRIMER UNTUK MENDAPATKAN MIKROBA RESISTEN
ANTIBIOTIK
Penyakit infeksi merupakan penyakit penyebab kematian terbesar di dunia.
Beberapa penyakit infeksi penyumbang angka kematian terbesar tersebut antara lain
pneunomia, tuberkulosis, penyakit diare, malaria, cacar dan HIV/AIDS (WHO, 1999).
Penemuan senyawa antibiotik dan mekanisme aksinya pad abad ke-20 telah menjadi
salah satu kisah sukses besar dari dunia biokimia organik, mulai dari penisilin,
eritromisin, kloramfenikol, streptomisin, sampai vankomisin.
jika terbentuk zona bening pada saat diuji Kirby-Bauer, resisten adalah jika tidak
terbentuk zona bening pada saat diuji Kirby-Bauer, sedangkan intermediet adalah jika
terbentuk zona bening pada saat diuji Kirby-Bauer dengan diameter kecil.
Sensitifitas suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona
hambat terbentuk. Semakin besar diameternya maka semakin terhambat
pertumbuhannya.
Faktor faktor yang berpengaruh pada metose Kirby-Bauer, yaitu :
a. Ketebalan media agar, dapat mempengaruhi penyebaran dan difusi antibiotik yang
digunakan.
b. Umur bakteri, fase stationer (bakteri yang berumur tua) tidak efektif untuk diuji
karena mendekati kematian dan tidak terjadi pertumbuhan lagi sehingga yang
dipakai fase eksponential (bakteri berumur sedang) karena aktivitas metabolitnya
tinggi, perumbuhan cepat sehingga lebih peka terhadap daya kerja obat dan
hasilnya lebih akurat.
c. Waktu inhibisi, waktu yang cukup supaya bakteri dapat berkembang baik dengan
optimal dan cepat. Waktunya minimal 16 jam.
d. pH dan temperatur, bakteri memiliki pH dan temperatur optimal untuk tumbuh
yang berbeda beda sehingga sebaiknya dilakukan saat pH dan temperatur yang
optimal.
e. Konsentrasi antibiotik, semakin besar konsentrasinya semakin besar diameter
hambatannnya.
f. Jenis antibiotik, setiap bakteri memiliki repon yang berbeda beda terhadap
antibiotiknya, tergantung sifat antibiotik tersebut (berspektrum luas / berspektrum
sempit).
LAF (Laminar Air Flow) yaitu suatu meja kerja steril untuk melakukan
inokulasi atau penanaman. Dinamakan LAF (Laminar Air Flow) karena meniupkan
udara steril secara kontinue melewati tempat kerja sehingga tempat kerja bebas dari
dubu, spora spora yang jatuh ke dalam media, waktu pelaksanaan penanaman.
Aliran udara ini berasal dari udara ruangan yang ditarik ke dalam alat melalui filter
pertama (pre-filter), yang kemudian ditiupkan keluar melalui filter yang sangat halus
yang disebut HEPA (High Efficiency Particulate Air Filter I) dengan menggunakan
blower. LAF digunakan untuk pengerjaan secara aseptis. Penaseptisan merupakan
suatu ruangan berdasarkan aliran udara keluar dengan kontaminasi udara dapat
diminimalkan. LAF ada dua macam yaitu :
a. LAF cabinet tidak dilengkapi dengan lampu UV, blower harus dijalankan terus
menerus walaupun LAF tersebut sedang tidak dipergunakan, karena untuk
menjaga kebersihan ruang kerja.
b. LAF yang dilengkapi dengan lampu UV, menyalakan alat ini minimal 30menit
sebelum LAF digunakan. Ketika LAF sedang digunakan lampu UV harus
dimatikan blower dijalankan, blower ini hanya dijalankan pada saat LAF sedang
dipakai.
Hal hal yang perlu diperhatikan yaitu :
a. Jangan meletakkan bunsen dekat dengan filter.
b. Jangan menumpuk alat alat didepan tempat bekerja sehingga menghalangi udara
c. Jangan mencelupkan alat tanam dengan api ke dalam alkohol
d. Jangan mendekati lampu bunsen dengan tangan yang baru disemprotkan alkohol.
e. Bersihkan LAF setelah selesai.
BAB II
II.I ALAT DAN BAHAN
1. STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM
a. Sterilisasi dengan Autoklaf :
Air suling
Sterilisator
Wadah Aluminium
b. Pembuatan Medium Nutrien Cair :
Ekstrak Daging
Pepton
Pemanas
Penyaring
c. Pembuatan Medium Nutrien Agar :
Ekstrak daging
Pepton
Agar agar
Tabung reaksi
d. Pembuatan Medium Nutrien Taoge Cair :
Taoge
Sukrosa
Aquades
e. Pembuatan Medium Taoge Agar :
Taoge
Sukrosa
Aquades
Agar agar
2. PENANAMAN, ISOLASI DAN PENGAMATAN PERTUMBUHAN MIKROBA
Alat :
Ose runcing
Ose tumpul
Lampu spirtus
Cawan petri
Pipet steril
Spektrofotometer
Kuvet plastik
Incubator
Incubator shaker
Bahan :
a. Menanam Mikroba Aerob
Biakan murni Bacillus Subtilis dalam medium nutrien cair umur 24 jam
Biakan murni E.Coli dalam medium nutrien carir umur 24 jam
Medium nutrien agar tegak, medium agar miring dan medium nutrien cair
b. Isolasi Mikroba
Suspensi mikroba / campuran mikroba
Nutrien agar tegak
c. Pengamatan Pertumbuhan Mikroba
Kultur bakteri E.coli dalam medium nutrien agar
100ml medium pertumbuhan nutrien beef dalam 250ml erlenmeyer
Media tanpa bakteri sebagai blanko
3. PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA
a. Plate Count :
Cawan petri
Gelas ukur
Tabung reaksi
Pipet tetes
Sampel bahan
Aquades
Medium agar
b. Optical Density 600 (OD 600) :
Tabung reaksi
Spektrofotometer UV
Aquades
Suspensi bakteri
4. PENGECATAN DAN IDENTIFIKASI MIKROBA
a. Pengecatan Sederhana :
Objek glass
Lampu spirtus
Ose
Biakan murni B.subtilis
Larutan cat kristal violet
Larutan cat safranin
b. Pengecatan Gram :
Objek glass
Lampu spirtus
Ose tumpul
Biakan murni B.Subtilis
Biakan murni E.Coli
Larutan cat kristal violet (gram A)
Larutan lugol iodine (gram B)
Larutan alkohol (gram C)
Larutan cat safranin (gram D)
5. MORFOLOGI FUNGI
a. Pengamatan Morfologi Kapang :
Jarum preparat
Gelas objek
Gelas penutup
Pipet tetes
Mikroskrop
Biakan murni dari Aspergillus sp.
Biakan murni dari Rhizopus sp.
Biakan murni dari Penicillium sp.
Biakan murni dari Monilia sp.
Larutan mounting laktofenol
b. Pengamatan Morfologi Khamir :
Gelas objek
Jarum preparat
Pipet tetes
Mikroskrop
Gelas penutup
Biakan murni Saccharomyces sp. pada medium taoge agar
6. SKRINING PRIMER UNTUK MENDAPATKAN MIKROBA RESISTEN
ANTIBIOTIK
a. Tahap 1 :
Cawan petri
Tabung reaksi
Mikropipet dan yellow tip
Gelas spreader
Media selektif (Czapec dox dan antibiotik)
Larutan salin (NaCl 0,9%)
Sampel tanah
b. Tahap 2 :
Cawan petri
Ose bulat
Labu erlenmeyer 50 cc untuk wadah mensterilkan media
Media pertumbuhan (Czapec dox)
c. Tahap 3 (Uji sensitifitas isolat bakteri terhadap beberapa antibiotik) :
Cawan petri
Jangka sorong
Erlenmeyer 50 cc untuk wadah sterilisasi media
Media nutrien agar
Kultur E.Coli dan B.Subtilis dalam media nutrien cair berumur 24jam
Antibiotik
Paper disk
Saat mencuci tutupnya jaga agar alat pengukur tidak terkena air
b. Pembuatan Medium Nutrien Cair
Larutkan 3gr ekstrak daging + 5gr pepton dg 1 L aquadest
Panaskan selama 5 menit
Dinginkan
Netralkan dg NaOH 1N ad Ph 7,2, cek dg pH meter
Tambahkan aquadest ad 1 liter lagi
Saring larutan medium dengan kain penyaring yg bersih
Sterilkan dengan autoklaf, P=2 atm, T=121C, t=20 menit
c. Pembuatan Medium Nutrien Agar
Medium nutrien cair + 15-20 gr agar untuk 1 liter aquadest
Masukkan agar - agar ke dlm medium yang dipanaskan selama 20-30 menit
Kembalikan volume medium ad 1 liter kembali
Dlm keadan panas saring dengan kain saring bersih
Masukkan dlm tabung reaksi steril
Medium agar miring 5 ml
Medium agar tegak 10 ml
Sterilkan dg autoklaf, P=2 atm, T=121C, t=20 menit
d. Pembuatan Medium Nutrien Taoge Cair
Rebus taoge dengan aquadest ad 2 jam
Saring rebusan taoge, tambahkan sukrosa
Panaskan kembali ad larut
Tambahkan aquadest ad volumenya 1 liter
Biakan Cair
Mensterilkan jarum ose tumpul diatas nyala api spirtus
Mengambil biakan murni dengan cara membuka kapas penutup tabung dengan
kelingking tangan kanan, posisi tabung agak di miringkan
Mengambil inokulum dengan menggunakan jarum ose tumpul. Panaskan bibir
tabung dengan nyala api spirtus, lalu tutup kembali
Mengambil media agar cair yang akan di inokulasi
Melepas tutup kapasnya dan menggoreskan agar cair dengan jarum ose,
inokulasi sampai ke permukaan tabung
Kemudian menarik jarum ose hati - hati
Memanaskan bibir tabung, lalu tutup kembali
Memberi etiket tabung biakan bertuliskan nama mikroba dan tanggal inokulasi
Menginkubasi pada suhu 37C
b. Isolasi Mikroba
Mencairkan nutrien agar tegak dalam penangas air
Mendinginkan sampai suhu 50C
Menuangkan medium agar kedalam cawan petri steril secara aseptik. Biarkan
sampai dingin dan padat
Mengambil satu ose suspensi bahan yang mengandung mikroba tersebut secara
aseptik dan buatlah goresan pada permukaan agar
Membalik cawan petri yang telah diberi etiket dan membungkus kembali dengan
kertas
Menginkubasi pada suhu 37C
c. Pengamatan Pertumbuhan Mikroba
Mengambil satu ose koloni bakteri dari media NA
Menginokulasikan kedalam media pertumbuhan NB pada Erlenmeyer
Mengambil 1 mL suspensi bakteri dan memindahkan dalam kuvet plastik
Mengukur media tanpa suspensi bakteri sebagai blanko pada spektrofotometer
dengan panjang gelombang 600 nm. Kemudian membaca absorbansi kuvet yang
berisi suspensi bakteri
Mengulangi pembacaan absorbansi tiap 3 jam selama 27 jam
Membuat grafik hubungan antara absorbansi versus waktu pengukuran
3. PERHITUNGAN MIKROBA
a. Plate Count
Ambil 1ml sampel
1ml sampel+ 9ml aquades tab 1 (pengenceran 10-1)
1ml susp. tab 1 + 9ml aquades tab 2 (pengenceran 10-2)
1ml susp. tab 2 + 9ml aquades tab 3 (pengenceran 10-3)
Ad pgnenceran 10-6 & 10-7
Panaskan medium agar (ambil 10 ml)
Campur medium + suspensi pengenceran dalam cawan petri
Dinginkan, kemudian teteskan cat sfranin atau kristal violet secukupnya dan
biarkan selama 1-2 menit
Cuci degan air mengalir hingga sisa cat habis, kemudian keringanginkan
Amati dengan mikroskop dengan perbesaran kuat. Gunakan minyak emersi, bakteri
akan terwarnai dan latar belakangnya transparan
Gambar morfologi selnya
b. Pengecatan Gram
Bersihkan gelas obyek degan alkohol hingga bebas lemak, kemudian panggang di
atas nyala lampu spiritus
Ambil secara aseptik 1 ose suspensi biakan B. subtilis dan E coli ratakan kira - kira
1cm
Kering anginkan preparat tersebut, kemudian fiksasi dengan melewatkannya beberapa
kali di atas nyala lampu spiritus
Setelah dingin tetesi degan cat - cat gram A sebanyak 2-3 tetes dan diamkan selama 1
menit
Cuci degan air mengalir, kemudian keringanginkan
Teteskan cat gram B,biarkan selama 1 mnt cuci degan air mengalir kemudian kering
anginkan
Cuci dengan larutan peluntur (gram C) selama 30 detik, kemudian dicuci dengan air
mengalir dan kering anginkan
Beri larutan cat penutup (gram D) selama 2 menit cuci dengan air mengalir dan kering
anginkan
Amati dengan mikroskop dengan minyak emersi, kemudian gambarkan preparat
5. MORFOLOGI FUNGI
a. Pengamatan Morfologi Kapang
Bersihkan gelas benda dengan alkohol sampai bebas lemak dan debu, kemudian
teteskan 1 tetes laktoferol pada bagian tengah
Ambil biakan jamur dengan jarum prerarat dan kemudian letakan pada gelas objek
yang sudah diberi laktofenol
Jika massa miselium mengumpul, pisahkan dengan menggunakan 2 buah jarum
preparat
Tutup dengan gelas penutup, hindari pembentukan gelombang udara di dalam
preparat
Amati di bawah mikroskop
Gambar dan beri keterangan yang lengkap
b. Pengamatan Morfologi Khamir
Bersihkan gelas benda dengan alkohol sampai bebas debu dan lemak, kemudian
teteskan 2 tetes methilen blue pada bagian tengahnya
Ambil biakan jamur dengan jarum preparat dan kemudian letakan pada gelas
objek yang sudah diberi methilen blue
BAB III
III.I HASIL
1. STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM
Gambar : Medium Nutrien Agar Tegak akan disterilkan dengan alat autoklaf
b. Isolasi
Jam ke II 15:00
Kelompok
E.Coli
1
0,560
2
0,552
3
0,569
4
0,814
5
0,568
6
0,573
B.Subtilis
0,865
0,922
0,816
1,069
0,869
0,946
B.Subtilis
1,502
1,068
0,950
1,410
1,012
1,202
Jam ke IV 13:00
Kelompok
E.Coli
1
2,591
2
3
2,482
4
1,037
5
2,270
6
2,128
B.Subtilis
2,451
2,290
2,303
1,249
2,408
0,542
Jam ke V 16:20
Kelompok
E.Coli
1
2,515
2
3
2,402
4
0,649
5
2,280
6
0,677
B.Subtilis
2,482
2,357
2,408
0,849
2,466
0,537
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
E.Coli
Column1
1x10-6
73
129
1x10-7
59
49
Gambar : B.cereus
b. Pengecatan Gram
Tahap 2
Tahap 3
Sampel Tanah
B = 0,71
V = 1,26 + 1,86 2 = 1,56
tempat/wadah nutrien agar tegak dan aquadest yang sudah mendidih. Rak tabung
untuk meletakkan tabung reaksi agar posisinya tegak. Autoklaf adalah suatu alat
pemanas tertutup yang digunakan untuk mensterilisasi suatu benda menggunakan uap
bersuhu dan bertekanan tinggi(121C) selama kurang lebih 15menit. Suhu yang tinggi
inilah yang akan membunuh mikroorganisme.
Tahap tahap percobaan pembuatan medium nutrien agar, yaitu
mencampurkan Nutrien agar tegak 130ml ditambahkan pelarut berupa aquadest
120ml ke dalam gelas beker. Lalu, memanaskan campuran tersebut diatas pemanas
dengan suhu 100C sambil diaduk menggunakan batang pengaduk sampai mendidih.
Tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini adalah untuk menghomogenkan Nutrien
agar dengan aquadest, dimana dengan pemanasan dapat mempercepat pelarutan dari
Nutrien agar dengan aquadest. Setelah mendidih, pindahkan campuran tersebut ke
dalam tabung reaksi masing masing 10ml, jadi jumlah tabung yang berisi campuran
tersebut ada 12 tabung reaksi. Kemudian mulut tabung ditutup dengan kapas dengan
posisi tegak dan diletakkan di rak tabung. Setelah selesai itu, masukkan 12 tabung
tersebut ke dalam plastik, dalam satu plastik terdapat tiga tabung reaksi. Lalu,
masukkan ke dalam autoklaf selama 20menit dengan suhu 121C untuk disterilkan.
Pembuatan medium nutrien agar tegak ini untuk bahan tahap percobaan selanjutnya.
Fungsi medium (NA) berdasarkan susunan kimianya merupakan medium non
sintetik atau semi ilmiah, berdasarkan konsistennya merupakan medium padat, untuk
menumbuhkan bakteri. Medium yang telah disterilkan tidak ditumbuhi oleh mikroba
karena kontaminan telah hilang setelah sterilisasi. Media tegak dimaksudkan untuk
mrlihat pertumbuhan bakteri dalam merespon oksigen dari luar dalam arah tegak.
2. PENANAMAN, ISOLASI DAN PENGAMATAN PERTUMBUHAN MIKROBA
Percobaan penanaman, isolasi dan pengamatan pertumbuhan mikroba
bertujuan agar mahasiswa dapat melakukan penanaman dan isolasi mikroba serta
mengamati pertumbuhan bakteri. Teknik penanaman (inokulasi) merupakan suatu
pekerjaan memindahkan bakteri dari medium lama ke medium yang baru dengan
tingkat ketelitian yang sangat tinggi, dengan demikian akan diperoleh biakan
mikroorganisme yang dapat digunakan untuk pembelajaran mikrobiologi.
Teknik isolasi mikroba adalah suatu usaha untuk menumbuhkan mikroba diluar dari
lingkungan alamiahnya. Pemisahan mikroorganisme dari lingkungan ini bertujuan
untuk memperoleh biakan bakteri yang sudah tidak bercampur lagi dengan bakteri
lainnya dan disebut biakan murni. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan
satu jenis mikroba dengan mikrobalainnya yang berasal dari campuran bermacam
macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media
padat, sel sel mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya.
Dikenal beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan
campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan yaitu metode cawan gores
dan metode cawan tuang.
Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi miroba yaitu antara
lain sebagai berikut :
1. Sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi.
2. Tempat hidup atau asal mikroba tersebut.
3. Medium pertumbuhan yang sesuai.
permukaan media cair, meskipun media ini berbentuk cair dan berbusa, tapi bakteri
ini bergerak keatas untuk mendapatkan oksigen lebih banyak. Medium nutrien agar
tegak, medium agar miring dan medium nutrien cair sebagai media penanaman
bakterinya.
Melakukan isolasi mikroba bahan bahan yang digunakan, yaitu suspensi
mikroba/campuran mikroba dan nutrien agar tegak. Suspensi mikroba/campuran
mikroba yaitu bakteri yang berkelompok yang terdapat pada media yang telah digores
oleh suatu sampel bila suspensi yang terbentuk kental, maka bakteri yang terkandung
dalm suspensi itu adalah bakteri gram negative namun bila suspensi yang terbentuk
encer maka bakteri yang terbentuk adalah gram positif. Nutrien agar tegak sebagai
medium yang digunakan untuk pertumbuhan mikroorganisme heterotrof.
Dalam penagamatan pertumbuhan mikroba menggunakan bahan bahan
sebagai berikut, kultur bakteri E.coli dalam medium Nutrien agar, 100ml medium
pertumbuhan Nutrien beef dalam 250ml erlenmeyer, dan media tanpa bakteri sebagai
blanko. Kultur bakteri E.coli dalam medium nutrien agar untuk diinokulasikan
(memindahkan bakteri dari medium lama ke medium yang baru) dengan medium
nutrien beef. Media tanpa bakteri sebagai blanko sebagai parameter.
Berikut tahap tahap pekerjaan menanam mikroba aerob, isolasi mikroba dan
pengamatan pertumbuhan mikroba, yaitu :
a. Menanam mikroba aerob
Biakan agar tegak
Sebelum melakukan percobaan, praktikan terlebih dahulu
menyemprotkanmeja kerja dan telapak tangan yang telah memakai sarung tangan
dengan alkohol 70% tujuannya agar steril dari mikroorganisme. Kemudian
mensterilkan jarum ose ranting dicelupkan alkohol lalu dilewatkan diatas nyala
api spirtus. Setelah itu mengambil biakan murni dengan cara membuka kapas
penutup tabung dengan kelingking tangan kanan, posisi tabung agak dimiringkan.
Lalu mengambil inokulum dengan menggunakan tabung dengan nyala api spirtus,
lalu tutup kembali. Kemudian ambil media agar tegak yang akan di inokulasi.
Melepas tutup kapasnya dan memasukkan jarum yang sudah menempel bakteri ke
media agar tegak, lalu mulut tabung dipanaskan ke nyala api spirtus dan tutup
kembali dan beri etiket.
Biakan agar miring
Cara perlakuan biakan agar miring hampir sama dengan biakan agar tegak.
Praktikan terlebih dahulu menyemprotkan meja kerja dan telapak tangan yang
telah memakai sarung tangan dengan alkohol 70% tujuannya agar steril dari
mikroorganisme. Kemudian mensterilkan jarum ose tumpul diatas nyala api
spirtu. Lalu, buka kapas tabung raksi yang berisi biakan murni dan ambil denga
menggunakan ose tumpul. Ambil tabung yang berisi media agar miring dan mulut
tabung dipanaskan diatas nyala api spirtus. Setelah itu masukkan jarum ose
tumpul yang sudah menempel bakteri ke media agar miring. Kemudian mulut
tabung tadi dipanaskan dan tutup kembali. Dan beri etiket tempelkan pada tabung.
Biakan agar cair
Praktikan terlebih dahulu menyemprotkan meja kerja dan telapak tangan yang
telah memakai sarung tangan dengan alkohol 70% tujuannya agar steril dari
mikroorganisme. Mensterilkan jarum ose tumpul yang akan digunakan, cara
mensterilkannya dengan melewati diatas nyala api spirtus. Lalu ambil tabung yang
berisi inokulum, buka kapas yang ada di mulut tabung kemudian mengambil
inokulum tersebut dengan menggunakan jarum ose tumpul yang sudah disterilkan
tadi. Setelah itu mengambil tabung yang berisi media agar cair, dan memanaskan
mulut tabung tersebut diatas nyala api spirtus. Setelah itu masukkan jarum ose
tumpul yang telah menempel bakteri ke dalam tabung yang berisi media cair.
Lalu, mulut tabung tadi dipanaskan kembali dan tutup dengan kapas lagi. Dan beri
etiket tempelkan pada tabung.
Setelah tiga perlakuan diatas tersebut selesai, tabung tabung yang telah
diberi etiket dimasukkan kedalam plastik untuk diikubasi pada susu 37C.
b. Isolasi mikroba
Siapkan air 200ml ditampung didalam gelas beker. Kemudian ambil nutrien
agar tegak dan letakkan ke dalam gelas beker yang berisi air tadi dan panaskan
diatas pemanas pada suhu 250C sampai nutrien agar tersebut cair. Setelah cair,
angkat dan diletakkan ke dalam gelas beker yang berbeda yang telah didalamnya
terdapat kertas tujuannya agar panas tabung yang berisi nutrien agar tersebut tidak
langsung terkena pada media kerja (kontaminasi). Lalu masukkan nutrien agar
tegak ke dalan cawan petri steril dan membuat goresan menggunakan ose tumpul
yang sudah steril. Serta beri etiket dan tutup kembali. Membalik cawan petri yang
telah diberi etiket dan membungkus kembali dengan kertas. Kemudian inkubasi
pada suhu 37C.
Teknik penanaman dengan goresan (streak) brtujuan untuk mengisolasi
mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium
baru. Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan
waktu., tetapi memerlukan keterampilan yang diperoleh dengan latihan.
Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum
digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawan petri steril dengan
jarum ose tumpul, diantara garis garis goresan akan terdapat sel sel yang
cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni.
c. Pengamatan pertumbuhan mikroba
Mengambil satu ose koloni bakteri dari media nutrien agar, lalu menginokulasi
kedalam media pertumbuhan nutrien beef pada erlenmeyer. Setelat itu mengambil
1ml suspensi bakteri dan memindahkan dalam kuvet plastik. Kemudian mengukur
media tanpa suspensi bakteri sesuai blanko pada spektrofotometer dengan panjang
gelombang 600nm. Mengulangi pengukuran absorbansi tiap 3jam selama 27jam
da membuat grafik hubungan antara absorbansi versus watu pengukuran.
Alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi adalah Spektrofotometer. Kerja
spektrofotometer yaitudengan cara melewatkan cahaya dengan panjang
gelombang tertentu sesuai jenis atom pada suatu obyek kaca yang disebut kuvet.
Sebagian cahaya akan diserap dan sisanya akan dilewatkan sebanding degan
konsentrasi larutan dalam kuvet. Berikut gambar kurva yang didapat berdasarkan
absorbansi dengan waktu :
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
E.Coli
Column1
bersifat transparan, berukuran kecil sehingga tidak dapat dilihat secara langsung tanpa
alat yang mempunyai pembesaran dan bisa saja teknik khusus.
Untuk mengetahui struktur, morfologi dan sifat kimia bakteri, kita perlu
melakukan percobaan pengecatan terhadap bakteri atau mikroba tersebut. Prinsip
dasar dari pengecatan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pengecatan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan
ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada
pengecatan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan
pewarna basa.
Zat warna adalah senyawa kimia yang berupa garam garam yang salah satu ionnya
berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif.
Senyawa senyawa kimia ini berfungsi untuk membedakan bakteri bakteri karena
reaksinya dengan sel bakteri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang
digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri.
Tujuan dari pengecatan yaitu :
a. Mempermudah melihat bentuk jasad mikroba baik bakteri, yeast, ataupun kapang.
b. Memperjelas ukuran dan bentuk mikroba.
c. Melihat struktur luar dan kalu memungkinkan juga struktur dalam mikroba dapat
dilihat.
d. Melihat reaksi mikroba terhadap peawarna (cat) yang diberikan sehingga sifat
fisik dan kimia yang ada dapat diketahui.
Faktor faktor yang mempengaruhi pengecatan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna,
substrat intensifikasi, pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup.
Morfologi mikroba dapat dibedakan menjadi dua, yaitu :
a. Morfologi makroskopik, populasi mikroba tumbuh sangat cepat ketika
mikrobanya ditambahkan dan disesuaikan dengan gizi dan kondisi lingkungan
yang memungkinkan untuk berkembang. Melalui pertumbuhan ini, berbagai jenis
bakteri dan kadang memberi penampilan yang khas. Beberapa koloni mungkin
akan berwarna, ada yang tidak teratur. Karakteristik koloni (bentuk, ukuran,
margin, elevasi, warna, permukaan, konsistensi) yang diistilahkan morfologi
koloni.
b. Morfologi mikroskopik adalah karakteristik bakteri yang dilihat melalui
pengamatan dibawah mikroskop. Bentuk bakteri sangat bervariasi, tetapi secara
umum ada tiga tipe, yaitu bentuk bulat (coccus), bentuk batang (basil), bentuk
spiral (spirilium).
- Bentuk bulat (coccus) dibedakan lagi menjadi enam, yaitu micrococcus (bulat,
satu satu), diplococcus (bulat, bergandengan dua dua), staphyllococcus
(bulat, tersusun seperti untaian buah anggur), streptococcus (bulat,
bergandengan seperti rantai), sarcina (bulat, terdiri 8sel yang membelah sel ke
3arah), tetracoccus (bulat, tersusun dari 4sel berbentu bujur sangkar).
- Bentuk batang dapat dibedakan ke dalam bentuk batang panjang dan batang
pendek.bakteri bentuk batang dapat terdiri atas : sel tunggal (monobasil),
bergandengan dua dua (diplobasil), sebagai rantai (streptobasil).
- Bentuk lengkung (spiral) dapat dibagi menjadi tiga, yaitu bentuk koma
(vibrio), bentuk spiral jika lengkungannya lebih dari setengah lingkaran,
bentuk spiroseta (berupa spiral yang halus dan lentur).
oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskrop sel sel bakteri
tampak berwarna merah. Escherichia coli termasuk dalam famili
Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang
fermentatif.
5. MORFOLOGI FUNGI
Percobaan morfologi fungi bertujuan agar setelah melakukan praktikum ini
diharapkan mahasiswa dapat mengenali berbagai jenis jamur berdasarkan
morfologinya.
Struktur dasar jamur adalah hifa. Tubuh jamur tersusun dari komponen dasar yang
disebut hifa. Hifa membentuk jaringan yang disebut miselium. Miselium menyusun
jalinan jalinan semu menjadi tubuh buah. Ketebalan hifa bervariasi antara 0,5mm
100mm. Hifa terdiri atas sel sel sejenis. Sel sel tersebut satu dan lainnya
dipisahkan oleh dinding sel atau sekat yang dinamakan septum (jamak:septa) dan
dinamakan hifa bersepta.
Beberapa ahli mikologi membagi jamur menjadi dua kelompok berdasarkan
bentuk tubuhnya, yaitu kapang (mold) dan khamir (yeast). Kebanyakan jamur masuk
dalam kelompok kapang. Karena, tubuh vegetatif kapng berbentuk filamen panjang
bercabang yang seperti benang disebut hifa. Hifa akan memanjang dan menyerap
makanan dari permukaan substrat (tempat hidup jamur). Sedangkan jamur dalam
kelompok khamir bersifat uniseluler (berinti satu), bentuknya bulat atau oval.
Jamur tidak mempunyai batang, daun, dan akar serta tidak mempunyai sistem
pembuluh seperti pada tumbuhan tingkat tinggi. Jamur umumnya berbentuk seperti
benang, bersel banyak, dan semuadari jamur mempunyai potensi untuk tumbuh,
karena tidak mempunyai klorofil yang berarti tidak dapat membuat makanannya
sendiri.
Untuk melakukan pengamatan morfologi kapang mempersiapkan alat
alatnya, yaitu jarum preparat, gelas objek, gelas penutup, pipet tetes dan mikroskrop.
Jarum preparat membantu pada saat kita mengambil biakan jamur. Gelas objek
sebagai tempat meletakkan biakan jamur yang diamati. Pipet tetes untuk mengambil
larutan yang sukar diambil. Mikroskrop sebagai alat untuk melihat biakan jamur
dengan jelas.
Sedangkan bahan bahan yang digunakan, yaitu biakan murni dari Rhizopus sp.
larutan mounting laktofenol dan larutan methilen blue. Sebagai pewarna, digunakan
laktofenol untuk kapang metilen blue untuk khamir. Larutan laktofenol dapat
digunakan dalam pewarnaan pada khamir dan kapang. Organisme yang
tersuspensikan ke dalam larutan tersebut akan mati akibat fenol yang terdapat
didalamnya dan akan memberi efek transparan, sedangkan metilen blue memberi
warna pada kapang dan khamir.konsentrasi fenol yang tinggi membuat enzim yang
terdapat dalam sel terdeaktifasi tanpa menyebabkan terjadinya lisis. Laktofenol tidak
mudah menguap seperti aquadest sehingga preparat tidak mudah cepat kering dan sel
kapang tidak cepat rusak. Kerugian dari penggunaan laktofenol adalah apabila dipakai
terlalu lama lektofenol dapat mengubah bentuk sel. Laktofenol dapat mencegah
penguapan pengerutan sel, sehingga sel mudah diamati.
Setelah alat alat dan bahan telah ada. Bersihkan gelas objek dengan alkohol
70% agar steril lalu teteskan 1tetes laktofenol pada gelas objek. Setelah itu sterilkan
jarum ose tumpul diatas nyala lampu spirtus lalu, ambil biakan jamur dari Rhizopus
sp. dan letakkan di gelas objek yang telah ditetesi laktofenol. Apabila terdapat masa
miselium mungumpul, pisahkan dengan menggunakan 2 buah jarum preparat.
Kemudian tutup dengan gelas penutup hindari gelembung udara. Dan amati dibawah
mikroskrop dengan pembesaran 10x gambar morfologinya. Dan lakukan hal tersebut
lagi tetapi dengan menggunakan metilen blue.
Dari hasil yang didapat bahwa pada pengamatan Rhizopus sp. termasuk golongan
kapang (jamur benang) sporangiofor tampak transparan karena pengaruh laktofenol
dan sporangium berwarna biru karena menyerap warna metilen blue. Hasil yang
diperoleh sesuai denga referensi yaitu sporangiofora tumbuh drai stolon dan mengarah
ke udara, baik tunggal atau dlam kelompok, rhizoid tumbuh berlawanan dan terletak
pada posisi yang sama dengan sporangiofora, sporangia golobus atau sub globus
dengan dinding berspinulosa (duri-duri pendek), yang berwarna coklat gelap sampai
hitam bila telah masak, kolumela oval hingga bulat, denga dinding halus atau sedikit
kasar, spora bulat, oval atau berbentuk elips atau silinder. Rhizopus sp. merupakan
contoh spesies dari Zygomicotina.
6. SKRINING PRIMER UNTUK MENDAPATKAN MIKROBA RESISTEN
ANTIBIOTIK
Dalam percobaan skrining primer untuk mendapatkan mikroba resisten
tujuannya agar setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat
melakukan berbagai teknik mikrobiologi dalam skrining (menanam, mengisolasi dan
memurnikan biakan, melakukan tes terhadap kemampuan biakan terhadap antibiotik)
serta mendapatkan mikroorganisme yang resisten terhadap antibiotik.
Skrining adalah sejenis tes yang digunakan untuk mendeteksi adanya antibodi
spesifik atau mikroorganisme dalam sejumlah besar spesimen. Tes skrining relatif
mudah dan tidak mahal (peralatan yang dibutuhkan tidak terlalu rumit). Teknik
mikrobiologi dalam skrining (menanam, mengisolasi dan memurnikan biakan,
melakukan tes terhadap kemampuan biakan terhadap antibiotik. Antibiotik adalah
salah satu metabolit sekunder yang paling penting dieksploitasi secara komersial dan
digunakan dalam berbagai macam keperluan. Ada tiga jenis resistensi bakteri, yaitu :
a. Resistensi bawaan (primer), yang secara alamiah sudah terjadi pada kuman,
misalnya terdapat enzim penisilinase pada stafilokok yang merombak penisilin
dari sefalosporidin. Ada pula bakteri yang dinding selnya tidak dapat ditembusi
obat, misalnya basil tuberkolusa dan lepra.
b. Resistensi yang diperoleh (sekunder) adalah akibat kontak dari kuman dengan
kemoterapeutika dan biasanya disebabkan oleh pembentukan secara spontan jenis
baru dengan ciri yang berlainan.
c. Resistensi episomal berkaitan dengan kedua jenis diatas, pada tipe resistensi ini
pembawa faktor genesis berada diluar kromosom (rangkaian pendukung sifat
genetika).
Dalam percobaan skrining primer untuk mendapatkan mikroba resisten
antibiotik ada tiga tahap, sebagai berikut :
a. Tahap 1, alat alat yang digunakan yaitu pemanas, gelas beker, timbangan dan
cawan petri steril. Pemanas untuk mencairkan medium, gelas beker sebagai
tempat/wadah tabung reaksi yang berisi medium pada saat pemanasan. Timbangan
untuk menimbang sampel tanah. Dan cawan petri sebagai wadah suspensi.
Sedangkan, bahan yang digunakan yaitu medium dan sampel tanah.
Cairkan medium didalam gelas beker yang berisi air diatas penangas air, sambil
menunggu medium cair timbang tanah seberat 1g. Setelah media sudah cair,
encerkan 1g tanah di tabung 1 didalam 9ml air, lalu ambil 1ml antibiotik dan
medium kemudian tuang ke cawan petri. Kemudian ambil 0,5ml dan tuang ke
cawan petri, goyang angka 8. Lakukan pengenceran hingga konsentrasi 10-5.
Setelah itu inkubasi pada suhu 37C.
b. Tahap 2, pada tahap ini pengerjaan dilakukan didalam LAF (Laminar Air Flow)
merupakan meja kerja steril, tujuannya agar pada saat pengerjaan tidak
terkontaminasi debu, dan spora spora lainnya. Alat alat yang digunakan, yaitu
lampu spirtus, dan ose tumpul. Lampu spirtus untuk melakukan sterilisasi alat
alat yang akan bersentuhan dengan mikroba dan media cair. Ose tumpul
digunakan pada saat mengambil mikroba. Sedangkan bahan bahannya yaitu
mikroba yang di cawan petri pada saat penanaman tahap 1, dan media cair sebagai
media pertumbuhan.
Sterilkan ose tumpul dengan alkohol lalu dipanaskan diatas nyala lampu spirtus.
Kemudian, ambil mikroba yang terdapat di cawan petri (pengenceran 10-4) dengan
menggunakan ose tumpul. Lalu tanam pada media cair ditabung. Setelah itu tutup
tabung dengan plastik dan inkubasi pada suhu 37C selama 24jam. Dan lakukan
hal yang sama terhadap media pertumbuhan dengan pengenceran 10-5.
c. Tahap 3, dalam tahap ini tempat pengerjaannya sama dengan tahap 2 yaitu
didalam LAF. Alat alat yang digunakan yaitu lampu spirtus, ose tumpul dan
cawan petri. Bahan yang digunakan yaitu biakan mikroba, media nutrien beef dan
paper disk.
Sterilkan ose tumpul diatas nyala lampu spirtus, lalu ambil biakan mikroba
didalam tabung. Kemudian tanam dalam media nutrien beef. Setelah itu tuang
suspensi lalu tuang juga medium agar ke cawan petri tunggu hingga beku.
Kemudian letakkan paper disk diatas permukaan media. Inkubasi pada suhu 37C
selama 24jam. Setelah itu tetesi dengan 10l larutan antibiotik, dan ukur diameter
hambat untuk masing masing antibiotik, interprestasikan hasil dengan antibiotik.
7. UJI SENSITIFITAS MIKROBA TERHADAP ANTIBIOTIK (METODE KIRBY
BAUER)
Setelah melakukan praktikum uji sensitifitas mikroba terhadap antibiotik
(metode kirby bauer diharapkan mahasiswa dapat melakukan uji sensitifitas terhadap
antibiotik dengan metode Kirby Bauer serta menentukan mikroba uji termasuk sensitif
atau resisten terhadap antibiotik yang diujikan.
Antibiotik merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme
(khususnya dihasilkan oleh fungi) atau dihasilkan secara sintetik yang dapat
membunuh atau menghambat perkembangan bakteri dan organisme lain. Tiap tiap
antibiotik memiliki efektivitas yang berbeda beda terhadap mikroorganisme
(bakteri). Beberapa antibiotik dapat bekerja dengan baik pada bakteri gram negatif
dan beberapa antibiotik lainnya ada yang lebih efektif pada bakteri gram positif.
Dalam uji sensitifitas mikroba terhadap antibiotik dengan menggunakan
metode kirby bauer, kami dapat mengetahui beberapa jenis bakteri yang sensitif
terhadap antibiotik yang diujikan. Terlebih dahulu mempersiapkan alat alat yang
dibutuhkan yaitu cawan petri, jangka sorong, dan erlenmeyer 50cc. Sedangkan bahan
bahan yang digunakan yaitu media nutrien agar, kultur E.Coli dan B.Aureus dalam
media nutrien cair berumur 24jam, antibiotik dan paper disk. Media nutrien agar
sebagai medium pertumbuhan, kultur E.Coli dan B.Aureus dalam media nutrien cair
sebagai bahan mikroba yang diuji dengan antibiotik. Paper disk untuk mengukur
sensitifitas antibiotik dengan metode paper disk yang berisi agen antimikroba pada
media yang telah ditanami mikroba dan akan berdifusi pada media agar. Daerah jernih
disekitar paper disk merupakan hambatan mikroba oleh antibiotikpada permukaan
agar. Setelah alat alat dan bahan telah siap, berikut ini tahap tahap yang kami
lakukan pada percobaan uji sensitifitas mikroba terhadap antibiotik dengan
menggunakan metode kirby bauer, yaitu alat alat dan bahan yang digunakan terlebih
dahulu disemprotkan alkohol tujuannya agar steril karena pengerjaan ini dikerjakan di
LAF (Laminar Air Flow) yaitu meja kerja steril untuk melakukan inokulasi /
penanaman. Kemudian masukkan alat alat dan bahan tersebut ke dalam LAF, lalu
sterilkan ose tumpul diatas nyala lampu spirtus. Ambil biakan E.Coli dan tanam di
media nutrien beef, begitu pula biakan B.Aureus ambil menggunakan osen dan tanam
pada media nutrien beef yang berbeda dengan E.Coli. setelah itu tuang suspensi
E.coli dalam cawan petri lalu tuang medium agar dalam cawan yang sudah dicairkan
terlebih dahulu dan tunggu hingga padat. Setelah itu taruh paper disk dan tetesi
antibiotik ampicillin dan gentamisin, tutup cawan dan bungkus dengan kertas.
Tujuannya dibungkus dengan kertas yaitu agar hasilnya tidak mudah terkena cahaya.
Dan di inkubasi.
Perlakuaan diatas sama juga dilakukan pada biakan B.Aureus. Catatan:masing
masing dalam cawan petri diletakkan 2 paper disk.
Dari hasil percobaan uji sensitifitas dengan menggunakan metode Kirby-Bauer
kami dapat mengetahui beberapa jenis bakteri yang sensitif terhadap antibiotika yang
diujikan. Didapatkan zona hambat / zona bening. Hal tersebut menunjukkan bahwa
bakteri sensitif terhadap antibiotik. Antibiotik ampisilin bekerja dengan menghambat
sintesis dinding sel yaitu dengan menyerang peptidoglikan dan mampu melakukan
penetrasi pada bakteri gram positif dan gram negatif. Hal ini disebabkan keberadaan
gugus amino pada ampicillin, sehingga membuatnya mampu menembus membran
terluar (outer mebran) pada bakteri.
Perbedaan luas / lebar diameter zona hambat pada cawan E.Coli dan B.Subtilis
disebabkan faktornya, yaitu konsentrasi antibiotik yang diserap oleh paper disk pada
cawan berbeda karena larutan antibiotik pada tiap konsentrasi kurang homogen.
BAB IV
KESIMPULAN
1. Mahasiswa telah mampu memahami tujuan dan cara cara sterilisasi, melakukan
sterilisasi dengan menggunakan autoklaf, mengetahui penggunaan dan macam
medium serta membuat medium.
a. Sterilisasi adalah suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat
pada suatu benda.
b. Tujuan sterilisasi agar alat alat yang digunakan bersih dari mikroorganisme
selain itu juga untuk mencegah peralatan cepat rusak.
c. Cara cara sterilisasi yaitu sterilisasi secara fisik, kimia dan mekanik. Tetapi yang
sering digunakan keseluruhan praktikut menggunakan sterilisasi secara fisik.
d. Medium pertumbuhan (disingkat dengan medium) adalah tempat untuk
menumbuhkan mikroba. Tujuannya dalam penelitian agar mengurangi populsa
mikroba yang ada di lingkungan.
e. Kelompok kami membuat medium nutrien agar tegak untuk bahan praktikum
selanjutnya yaitu sebagai media penanaman.
Jadi, mahasiswa telah mencapai nilai nilai tujuan praktikum.
2. Mahasiswa dapat melakukan penanaman, dan isolasi mikroba serta mengamati
pertumbuhan bakteri.
a. Penanaman (inokulasi) merupakan suatu pekerjaan memindahkan bakteri dari
medium lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi.
b. Kelompok kami melakukan menanan mikroba aerob tiga macam yaitu biakan agar
tegak, biakan agar miring, dan biakan cair.
c. Bakteri aerob adalah bakteri yang membutuhkan oksigen untuk proses respirasi,
pertumbuhan, kelangsungan hidup dan bereproduksi.
d. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan
mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam macam mikroba.
e. Teknik yang dilakukan pada tahap isolasi yaitu teknik penanaman dengan goresan
(streak).
f. Untuk mengetahui pertumbuhan mikroba, kami melakukan pengamatan
absorbansi tiap 3jam selama 27jam.
g. Absorbansi adalah rasio logaritmik dari radiasi yang dipaparkan ke suatu bahan
terhadap radiasi yang ditransmisikan menembus bahan. Absorbansi digunakan
dalam spektrofotometer.
3. Mahasiswa telah dapat mengetahui cara cara perhitungan mikroba, baik secara
langsung maupun tidak langsung, serta melakukan perhitungan jumlah mikroba yang
ada pada suatu bahan.
a. Perhitungan jumlah mikroba secara langsung, yaitu perhitungan yang menghitung
total sel (hidup dan mati) pada suatu sampel. Macam macamnya yaitu counting
chamber dan filter membran.
b. Perhitungan jumlah mikroba secara tidak langsung, yaitu perhitungan yang
dipakai untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup atau hanya menentukan
jumlah mikroba yang hidup saja. Macam macamnya, yaitu kekeruhan, analisa
kimia, berat kering, cara pengenceran, MPN, dan jumlah koloni (plate count).
c. Yang kami lakukan dalam perhitungan jumlah mikroba secara tidak langsung
yaitu berdasarkan jumlah koloni (plate count).
kirby-bauer serta menentukan mikroba uji termasuk sensitif atau resisten terhadap
antibiotik.
a. Uji sensitifitas mikroba terhadap antibiotik dengan menggunakan metode kirby
bauer, kami dapat mengetahui beberapa jenis bakteri yang sensitif terhadap
antibiotik yang diujikan.
b. Prinsip dasarnya adalah dengan meletakkan paper disk yang telah mengandung
antibiotik dengan konsentrasi dan kadar tertentu pada media agar yang telah
ditanam bakteri uji.
c. Zona hambat / bening yang dihasilkan disekitar paper disk inilah yang digunakan
sebagai dasar penentuan tingkat resistensi.
d. Didapat hasil yaitu :
E.Coli :
B = 0,69
V = (2,1 + 2,21) 2 = 2,155
B.Aureus :
B = 4,69 + 3,89 2 = 4,29
V = 2,31 + 2,32 2 = 2,315
DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro.2003. Dasar Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.
Gandjar, I., R.A. Samson, K.U.D. Tweel-Vermelen, A. Oetari, & I.Santoso.1996.
Pengenalan Kapang Tropik Umum. Jakarta : Yayasan Obor Indonesia.
Hafsan. 2011. Mikrobiologi Umum. Makassar : Alauddin University Press.
Irianto, Koes.2006. Mikrobiologi Jilid 1. Bandung : CV. Bandung : CV.Yrama Widya.
Natrsir.2003. Mikrobiologi Farmasi Dasar. Makasar : Universitas Hasanudin.
Pelczar, M.J dan E.C.S Chan. 2005. Dasar Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.
Syamsuri, Istamar.2004. Biologi. Jakarta : Erlangga.