ISOLASI MIKROORGANISME

Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari
campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi
menjadi kultur murni (biakan murni) yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi,
sifat dan kemampuan biokimiawinya.

Adapun Teknik Pengambilan Sampel yaitu :

1) Persiapan
2) Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri.
3) Jika berasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir
botol melawan arus air.
4) Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan
dengan tali.
5) Jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu
beberapa saat dan mulut kran dibakar.

A. Pengambilan Sampel Padat.

Pengambilan sampel dapat dilakukan dengan pinset, spatula atau alat lain
lalu dimasuikkan ke dalam wadah steril. Beberapa hal yang perlu diperhatikan
dalam pengambilan sampel padat adalah:
 Aliran udara di sekitar sampel.
 Stratifikasi dan distribusi karakteristik mikroorganisme pada sampel.
 Kedalaman atau letak sampel.

B. Pengambilan Sampel Daging.

Lebih baik dipilih daging yang tidak kontak dengan udara langsung (terletak
dipermukaan) dan jarang dipegang oleh tangan, diperhatikan juga aliran udara
yang ada.

ISOLASI DENGAN PENGENCERAN (DILUTION)

1. Teknik Preparasi Suspensi

Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan
dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari
substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya.
Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel :
  Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang
memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu
pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang kayu dll.
 Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel
pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya
daun bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan
sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v).
 Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk
dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di
dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya
antara lain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan
pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v).

2. Teknik Pengenceran Bertingkat

CARA KERJA :
1) Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran
pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi).
2) Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan
ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah
termasuk pengencer 10-1.
3) Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya.
4) Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke
tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke
telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung
pengenceran terakhir dengan cara yang sama.
5) Hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti,
artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang
berbeda/baru.
6) Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber
yang sama.
7) Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah
mikroba yang tersuspensi dalam cairan.
8) Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada
perkiraan jumlah mikroba dalam sampel.
9) Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan
selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel
mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.
 3. Teknik Penanaman
a. Teknik penanaman dari suspensi
 Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat.
 Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi
biasanyauntuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa
tabung pengenceran terakhir.
b. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau
meremajakan kultur ke dalam medium baru.

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MIKROORGANISME

Populasi mikroorganisme sangat kompleks. Bermacam-macam mikroba menghuni bagian

tubuh termasuk mulut, saluran pencernaan, dan kulit. Karena mikroorganisme begitu banyak
maka diperlukan teknik untuk populasi dari campuran.

Teknik Biakan Murni

Biakan murni adalah satu populasi yang semuanya berasal dari satu sel induk. Manfaat
dari teknik biakan murni yaitu untuk mempelajari sifat-sifat dari suatu mikroorganisme.

Pembiakan dan isolasi kultur murni

Mikroorganisme dibiakan di laboratorium pada bahan nutrient yang disebut medium.
Pemilihan medium bergantung dari mikroorganisme yang akan ditumbuhkan. Bahan yang
diinokulasikan pada medium disebut inokulum. Sel-sel akan terpisah sendiri. Setelah inkubasi,
sel-sel mikroba akan memperbanyak diri sehingga dalam waktu 18-24 jam akan terbentuk
massa sel yang disebut koloni. Setiap koloni merupakan biakan murni satu macam
mikroorganisme.

Metode-metode untuk isolasi biakan murni :

1) Metode Langsung
Metode langsung untuk mengisolasi mikroorganisme tunggal adalah menggunakan
alat manupulatomikro, disebut kuamikro. Dengan bantuan manipulator mikro dapat
digunakan kuarmikro untuk mengambil satu mikroorganisme dari suspensi zat berisikan
 sel-sel sambil memeriksa dengan mikroskop. Kemudian sel tunggal ini dipindahkan
dalam medium steril.

2) Penanaman Pada Agar

Tidak seperti sel-sel dalam medium cair, sel-sel dalam medium gel dibuat menetap.
Setiap sel diletakan pada medium gel, akan tumbuh menjadi koloni tepisah. Bahan ideal
untuk media mikrobiologi adalah agar, polisakarida asam yang diekstrak dari alga merah
tertentu.
 Metode cawan gores
Inokulum digoreskan pada permukaan medium agar nutrient dalam cawan
petri dengan jarum inokukasi.
 Metode cawan tebar
Setetes inokulum di tengah-tengah medium agar nutrient, dalam cawan
petri dan dengan menggunakan batang kaca bengkok yang steril inokulum di
sebarkan dipermukaan medium. Ketika agar memadat sel-sel tidak dapat
bergerak dalam agar dan tumbuh menjadi koloni. Jika suspensi bakteri
diencerkan, koloni akan terpisah dengan baik, sehingga masing-masing memiliki
kemungkinan tinggi untuk diturunkan dari sel tunggal. Untuk mendapatkan
biakan murni dilakukan dengan cara mengambil satu koloni kemudian
dimasukkan dalam air dan menanamnya kembali di agar.

3) Pengenceran
Suspensi diencerkan seri dan contoh masing-masing pengenceran ditanam pada
agar. Jika hanya sedikit contoh dari pengenceran tertentu menunjukkan pertumbuhan,
diperkirakan bahwa beberapa biakan tadi dimulai dari sel tunggal. Metode ini digunakan
jika penanaman pada agar tidak mungkin di lakukan. Metode ini hanya digunakan untuk
isolasi tipe organism yang dominan dalam populasi campuran.

Pemeliharaan dan pengawetan biakan murni.

Setelah mikroorganisme berhasil diisolasi dalam biakan, maka perlu memelihara biakan
itu dalam keadaan hidup untuk masa yang cukup lama. Kultur mikroorganisme yang telah
dikenal (biakan acuan) dari pusat pengawasan penyakit digunakan mikrobiologiawan di
laboratorium klinik untuk menilai cara-cara yang dikerjakan.

Cara-cara mengawetkan biakan organisme

 Untuk pemeliharaan dalam jangka pendek disimpan dalam lemari es (0-10 o C).
 Untuk pemeliharaan dalam jangka panjang disimpan dalam nitrogen cair pada suhu
-196o C. Atau dalam tabung yang dibekukan dan ditutup dalam ruang hampa (liofilisasi).
 ISOLASI DAN IDENTIFIKASI KUMAN AEROB, ANAEROB, DAN MIKROAEROFILIK

Perbedaan utama dalam isolasi dan identifikasi kuman aerob, anaeob, dan mikroaerofilik
adalah :
 Cara mendapatkan suasana lingkungan pertumbuhan yang diinginkan oleh masing-
masing jenis kuman tersebut.
 Jenis perbenihan yang dibutuhkan untuk kesuburan pertumbuhannya.
 Kuman aerob dapat tumbuh dengan mudahnya pada suasana alam bebas.
 Kuman anaerob membutuhkan suasana lingkungan bebas O2 dan kadar CO2 tinggi.
 Kuman mikroaerofilik membutuhkan kadar lingkungan O2 rendah serta kadar CO2 yang
tinggi.

Hal-hal yang harus dilakukan sebelum isolasi dan identifikasi bakteri

1) Pengamatan bahan yang akan dikerjakan, apakah bahan tersebut masih baik, apakah
jenis bahan yang dikirimkan sesuai dengan apa yang tercantum pada surat pengantar,
memperhatikan jenis pemeriksaan mikrobiologik.
2) Pengolahan bahan. Pengolahan bertujuan mendapatkan hasil isolasi yang baik dan tepat
dengan cara yang mudah.
 Sentrifugasi, apabila diperkirakan jumlah kuman di dalam bahan tersebut sedikit
dilakukan pemekatan.
 Pengenceran, apabila jumlah kuman dalam bahan tersebut diperkirakan terlalu
banyak.
 Pemanasan, apabila yang diinginkan kuman-kuman yang tahan pemanasan (kuman
yang memiliki spora).
 Pengolahan dengasn zat-zat kimia tertentu, fungsinya meniadakan kuman-kuman
yang tidak diingini (untuk mengasingkan kuman TBC).
 Penghancuran, apabila bahan pemeriksaan berupa barang padat, sehingga
diharapkan kuman-kuman yang diinginkan dapat keluar dari bahan (tinja, jaringan
tubuh, sisa makanan).