ISOLASI MIKROBIOLOGI

Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya,tetapi terdiri dari
campuran berbagai macam sel.di dalm laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi
menjadi kultur murni(biakan murni) yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari
morfologi, sifat dan kemampuan biokimianya.

a) Tenik pengambilan sampel

1. Sampel air
 Persiapan
 Pengambilan sampel airbergantung kepada keadaan air itu sendrir. Jika berasal
dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol
melawan arus air.
 Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat
dicelupkan dengan tali.
 Jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumnya keran dialirkan
dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar.

2. Sampel padat
 Pengambilan sampel padat dapat dilakukan dengan pinset,spatula atau alat lain
lalu dimasukkan ke dalam wadah steril.
Bebrapa hal yang perlu diperhatikan dalam pengambilan sampel padat adalah:
- Aliran udara disekitar sampel
- Stratifikasi dan distribusi karakteristik mikroorganisme pada sampel.
- Kedalaman atau letak sampel.
3. Sampel daging
 Lebih baik dipilih daging yang tidak kontak dengan udara langsung (terletak
dipermukaan) dan jarang dipegang oleh tangan, diperhatikan juga aliran udara
yang ada.

b) Teknik biakan murni

 biakan murni adlah suatu populasi yang semuanya berasal dari satu sel induk.
 manfaat dari teknik biakan murni adalah untuk mempelajari sifat-sifat dari suatu
mikroorganisme.

c) Pembiakan dan isolasi kultur murni

 Mikroorganisme dibiakan di laboratorium pada bahan nutrien yang disebut
medium.
 Pemilihan medium bergantung dari mikroorganisme yang akan ditumbuhkan.
 Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum.
 Sel-sel akan terpisah sendiri.setelah inkubasi, sel-sel mikroba akan memperbanyak
diri sehingga dalam wakty 18-24 jam akan terbentuk massa sel yang disebut
koloni.
 Setiap koloni merupakan biakan murni satu macam mikroorganisme.
Ada beberapa bentuk koloni yaitu :
1. Form (bentuk koloni)
•    Sirkuler : bulat, bertepi
•    Ireguler : tidak beraturan, bertepi
•    Rhizoid : bentuk seperti akar, pertumbuhan menyebar
 2. Margin
•    Entire : tepian rata
•    Lobate : tepian berlekuk
•    Undulate : tepian bergelombang
•    Serrate : tepian bergerigi
•    Filamentous : tepian seperti benang-benan
3. Elevasi
•    Flat : ketinggian tidak terukur, nyaris rata dengan medium
•    Raised : ketinggian nyata terlihat, namun rata pada seluruh permukaan.
•    Convex : bentuk cembung seperti tetesan air
•    Umbonate : bentuk cembung dibagian tengah lebih menonjol

d) Adapun metode-metode untuk isolasi biakan murni yaitu :

1. Metode langsung
- Alat yang digunakan dalam metode langsung dalam isolasi mikroorganisme
tunggal yaitu alat manupulatomikro,disebut kuamikro.
- Dengan bantuan manipulator mikro dapat digunakan kuamikro untuk
mengambil satu mikroorganisme adri suspensi zat berisikan sel-sel sambil
memeriksa dengan mikroskop,kemudian sel tunggal ini dipindahkan dalam
medium steril.
- Tidak seperti se-sel dalam medium cair, sel-sel dalam medium gel dibuat
menetap. Sedikit sel diletakan pada medium gel,akan tumbuh menjadi koloni
terpisah.
- Bahan ideal untuk media mikrobiologi adalah agar polisakarida asam yang
diekstrak dari alga merah tertentu.
Inokulum digoreskan pada permukaan medium agar nutrien, dalam cawan
petri.dengan jarum inokulasi.

2. Penanaman pada agar(plating)

- Cawan gores
a. Inokulum digoreskan pada permukaan medium agar nutrien, dalam cawan
petri.dengan jarum inokulasi.Prinsip metode ini yaitu mendapatkan koloni
yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah
proses isolasi. Cara ini dilakukan dengan membagi 3-4 cawan petri. Ose
steril yang telah disiapkan diletakkan pada sumber isolat , kemudian
menggoreskan ose tersebut pada cawan petri berisi media steril. Goresan
dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horisontal disatu cawan. Ose
disterilkan lagi dengan api bunsen. Setelah kering, ose tersebut digunakan
untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan ke dua. Langkah ini
dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores.

- Cawan tebar
 Setetes inokulum diletakkan di tengah-tengah medium agar nutrien, dalam
cawan petri dan dengan menggunakan batang kaca bengkok yang steril,
inokulum disebarkan dipermukaan medium.
 Ketika agar memadat sel-sel tidak dapat bergerak dalam agar dan tumbuh
menjadi koloni.
 Jika suspensi bakteri diencerkan, koloni akan terpisah dengan baik,
sehingga masing-masing memiliki kemungkinan tinggi untuk diturunkan
dari sel tunggal.
  Untuk mendapatkan biakan murni dilakukan cara mengambil satu koloni
kemudian dimasukkan dalam air dan mananamnya kembali di agar.

- Pengenceran
 Suspensi diencarkan seri dan contoh masing-masing pengenceran ditanam
pada agar.
 Jika hanya sedikit contoh dari pengenceran tertentu menunjukkan
pertumbuhan, diperkirakan bahwa beberapa biakan tadi dimulai dari sel
tunggal.
 Metode ini digunakan jika penanaman pada agar ridak mungkin di
lakukan.
 Metode ini hanya dilakukan untuk isolasi tipe organisme yang dominan
dalam populasi campuran.
 cara pengerjananya yaitu sebagai berikut:
1. dengan lup inokulasi, pindahkan satu lup penuh suspensi asal ke dalam
tabung (medium agar cair steril yang agak dingin)
2. tabung I digelindingkan diantara kedua tangan agar inokulumnya
bercampur secara merata.
3. Kemudian ambil 1 ml dari tabung I dan masukkan ke tabung II
4. Ambil 1 ml dari tabung II dan masukkan dalam tabung III
5. Isi setiap tabung ke dalam cawan petri yang terpisah.
6. Setelah inkubasi cawa-cawan diperiksa kalau ada koloni yang
terisolasi.
7. Dari cawan yang berisi koloni-koloni terisolasi, dapat diisolasi iakan
murni mikroorganisme dengan memindahkan sebagian adri satu koloni
ke dalam tabung berisi medium steril.

 Teknik Preparasi Suspensi

o Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam aquades
steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melrutkan atau
melepaskan mikroba dari substartnya ke dalam air sehingga lebih
mudah penanganannya.
Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel:
a. Swab(ulas) dilakukan menggunakan bud steril pada sampel yang
memilki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau
sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang
kayu, dll.Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar
sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan
permukaan sampel.
b. Rinse (bilas) ditunjukkan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang
menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran
kecil,misalnya daun bunga dll.prosedur kerjanya dengan
mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandungan 1:9
(w/v).contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian
dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass.
c. Meseration(pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat
ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada
dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke
dalam air.contohnya sampelnya antara lain bakso,biji, buah
 dll.perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama
adalah 1:9 (w/v).

 Teknik pengenceran bertingkat

o Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau
mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan.
o Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung
kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel.
o Digunakan perbandingan 1:9 untuk sampel dan pengenceran pertama
dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10
sel mikroorganisme dari pengenceran sebelumnya.

 Teknik penanaman
o Teknik penanaman ini merupakan lanjutan dari pengenceran
bertingkat.
o Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi
biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil
beberapa tabung pengenceran terakhir.
1. Spread plate (agar tabur ulas)
Adalah teknik mananam dengan menyebarkan suspensi bakteri
kultur murni. Prosedur :
 Ambil suspensi cairan sebanyak 0,1 ml dengan pipet ukur
kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat.
 Batang L atau batangdrugal diambil kemudian disemprot/celup
alkohol dan dibakar daiatas bunsen beberapa saat, kemudian
didinginkan dan ditunggu beberapa detik.
 Kemudian disebarkan dengan menggosokkannya pada
permukaan agar supaya tetesan suspensi merata, penyebaran
akan lebih efektif bila cawan ikut diputar.
 Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat
menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.
2. Pour plate (agar tuang)
Teknik ini memerlukan agar yang belum padat( kuang dari 45ºC)
untuk dituang bersama suspensi bakteri kedalam cawan petri lalu
kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat.prosedurnya
yaitu:
 Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam
dan media yang padat yang masih cair (>45ºC)
 Teteskan 1 ml secara aseptis suspensi sel kedalam cawan
kosong
 Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar
cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media,
kemudian diinkubasi.
e) Pemeliharaan dan pengawetan biakan murni
 Setelah mikroorganisme berhasil diisolasi dalam biakan, maka perlu memelihara
biakan itu dalam kedaan hidup untuk masa yang cukup alam.
 Kultur mikroorganisme yang etlah dikenal (biakan acuan) dari pusat pengawasan
panyakit digunakan mikrobiologiawan di laboratorium klinik untuk menilai car-
cara yang dikerjakan.

f) Cara- cara mengawetkan biakan organisme :

 Utnuk pemeliharaan dalam jangka pendek disimpan dalam lemari es (0-10ºC)
 Untuk pemeliharaan jangka panjang disismpan dalam nitrogen cair pada suhu
-196º C. Atau dalam tabbung yang dibekukan dan ditutup rapat dalam ruang
hampa(liofilisasi)

g) Isolasi dan identifikasi kuman aerob,anaerob dan mikrofilik

Perbedaan utama dalam isolasi dan identifikasi kuman aerob, anaerob adalah :
- Cara mendapatkan suasana lingkungan pertumbuhan yang diinginkan oleh
masing-masing jenis kuman tersebut.
- Jenis perbenihan yang dibutuhkan untuk kesuburan pertumbuhannnya.
- Kuman aerob dapat tumbuh dengan mudahnya pada suasana alam bebas
- Kuman anaerob membutuhkan suasana lingkungan bebas O2, dan kadar CO2
yang tinggi.

h) Hal- hal yang harus dilakukan sebelum isolasi dan identifikasi bakteri
- Pengamatan bahan yang akan dikerjakan, apakah bahan tersebut masih baik,
apakah jenis bahan yang dikirimkan sesuai dengan apa yang tercantum pada
surat pengantar, memperhatikan jenis pemeriksaan mikrobiologik.
- Pengolahan bahan. Pengolahan bertujuan mendapatkan hasil isolasi yang baik
dan tepat dengan cara mudah.

i) Pengolahan bahan :
1. Sentrifugasi
Apabila diperkirakan jumlah kuman di dalam bahan etrsebut sedikti dilakukan
pemekatan
2. Pengenceran
Apabila jumlah kuma dalam bahan tersebut diperkirakan terlalu banyak
3. Pemanasan
Apabila yang diinginkan kuma-kuman yang tahan pemanasan(kuman yang
memiliki spora).
4. Pengolahan dengan zat-zat kimia tertentu
Fungsinya meniadakan kuman-kuman yang tidak diingini (untuk mengasingkan
kuman TBC).
5. Pengenceran
6. Apabila bahan pemeriksaan berupa barang padat,sehingga diharapkann kuman-
kuman yang diinginkan dapat keluar dari bahan (tinja,jaringan tubuh,sisa
makanan).