RESUME

Teknik Isolasi dan Pemurnian

KELOMPOK 1 :

Wulan Nursyam Suci Ummi R Galen Rahardian Nur Putri R Anis Barokah

(111810401024) (111810401027) (111810401030) (111810401040) (111810401042)

JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER 2013

Berbagai macam mikroorganisme dapat ditemukan di alam dalam populasi yang heterogen. Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. Jika sel-sel tersebut tertangkap oleh media padat pada beberapa tempat yang terpisah, maka setiap sel sel atau kumpulan sel yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang terpisah. Sehingga memudahkan pemisahan selanjutnya. Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan secra individu karena terlalu kecildan tidak tetap tinggal ditempatnya. Akan tetapi, bila sel-sel itu dipisahkan dengan cara pengenceran, kemudian ditumbuhkan dalam media padat dan dibiarkan membentuk koloni maka sel-sel tersebut selanjutnya dapat diisolasi dalam tabung-tabung reaksi atau cawan petri-cawan petri yang terpisah. Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam mengisolasi mikroorganisme adalah: Sifat dan jenis mikroorganisme Habitat mikroorganisme Media pertumbuhan Cara menginokulasi dan inkubasi Cara mengidentifikasi Metode isolasi Teknik isolasi secara keseluruhan tidak hanya cara bagaimana kita meletakkan mikroba dalam sebuah media. Namun, terdapat teknik-teknik lain yang berhubungan dengan teknik isolasi berupa:

Teknik pengenceran Teknik penanaman Teknik pemurnian Teknik perhitungan jumlah

Keterangan lebih lanjut dari rangkaian teknik isolasi adalah; 1. Teknik Pengenceran Pengenceran suspensi bakteri dari sampel atau sumber isolat dari lingkungan dilakukan sebagai upaya untuk mendapatkan kuantitas bakteri dalam jumlah yang dapat terhitung. Selain mendapatkan kuantitas yang dapat terhitung, pengenceran suspensi bakteri dari sampel/ sumber isolat dari alam juga diperlukan dalam rangka memudahkan dalam pengamatan koloni, terutama dalam kegiatan bertahap pemurnian isolat (Waluyo,2005). Langkah-Langkah:

NaCl Fisiologis

dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi dengan ketentuan sebagai berikut : satu tabung pertama diisi dengan 10 mL NaCl Fisiologis dan enam tabung berikutnya masingmasing diisi dengan 9 mL NaCl Fisiologis

Sterilisasi seri tabung pengenceran di atas beserta mortar keramik dan penumbuknya serta pipet volumetrik ke dalam autoclave

Gerus sumber isolat/ sampel lingkungan dengan bantuan NaCl Fisiologis steril di atas Mortar keramik steril

Timbang

(satu)

gram

sampel

(di

atas

alumunium foil), kemudian masukkan ke dalam tabung I, vortex sebentar agar suspense homogen

Ambil sebanyak 1 mL suspensi dari tabung I dengan menggunakan Pipet Volumetrik steril, kemudian masukkan ke dalam tabung II, vortex sebentar agar suspense homogeny

Pengenceran

Lakukan langkah No. 5 untuk tabung III, IV, V,VI, dan VII.

2. Teknik Penanaman Teknik penanaman ini merupakan lanjutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir(Dwidjoseputro,1998). Spread Plate (agar tabur ulas) Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Langkah-Langkah: Suspensi Cair diambil sebanyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan di atas permukaan agar yang telah memadat. Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik. Kemudian menggosokannya disebarkan pada dengan agar

permukaan

supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar. Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas. Spread Plate

Pour Plate (agar tuang) Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen ( Winarni,1997). Langkah-Langkah: Media Padat yang Masih Cair diteteskan 1 ml secara aseptis. suspensi sel ke dalam cawan kosong dituangkan media yang masih cair ke cawan diputar cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media diinkubasi. Pour Plate Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.

3. Teknik Pemurnian Kultur murni adalah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal, artinya mikroba ditumbuhkembangkan dari bakteri yang dihomogenkan dengan kata lain bakteri di isolasikan agar didapatkan bakteri murni yang dibutuhkan nantinya dalam kegiatan praktikum. Objek yang harus diperhatikan adalah bakteri. Teknik pemurnian bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru(Pelczar,1986). Goresan (Streak) Prinsip metode ini yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi. a. Goresan Sinambung Langkah-Langkah: Suspensi dimbil satu mata ose dan digoreskan setengah permukaan lempengan agar. Jangan pijarkan ose, putar lempengan 180o, gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar.
Goresan Sinambung

b. Goresan Kuadran

Media Bagi cawan menjadi 4 bagian menggunakan spidol marker. Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag Panaskan jarum inokulasi dan tunggu dingin Lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna Lakukan hal yang sama pada daerah 3 Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah pisah menjadi koloni tunggal Goresan Kuadran

4. Teknik Perhitungan Prinsip dari metode hitungan cawan ini adalah jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan

menggunakan mata telanjang tanpa harus dengan menggunakan mikroskop (Saputro,1988). Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah mikroba, hal ini disebabkan oleh hal-hal berikut. 1. Hanya sel yang masih hidup saja yang dapat dihitung. 2. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus. 3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari suatu mikroba yang mempunyai penampakan pertumbuhan secara spesifik. Kelemahan penggunaan metode cawan ini adalah sebagai berikut. 1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena sel yang berdekatan kemungkinan membentuk koloni. 2. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda. 3. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas. 4. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi yang relatif lama. Dalam metode hitungan cawan, bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel mikroba per ml atau per gram atau per cm, memerlukan perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar dalam cawan petri. Setelah inkubasi terbentuk koloni pada cawan tersebut, namun masih dalam jumlah yang dapat dihitung. Jumlah yang terbaik adalah diantara 30 sampai 300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu, 1:10, 1:100, 1:1000 dan seterusnya. Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat berupa larutan buffer fosfat, 0,85% NaCl atau larutan ringer (Saputro,1988).

Daftar Pustaka

Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan : Malang. Pelczar, M.1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Erlangga : Jakarta. Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. MM Press: Malang. Winarni, D. 1997. Diktat Teknik Fermentasi. Program Studi D3 Teknik Kimia FTI-ITS :Surabaya. Saputro D. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Cetakan ke 10. Jakarta : Universitas Indonesia ( IU-Press