1. Mengapa harus ada tahap isolasi?

Jawab:
Mikroorganisme terdapat dimana-mana, baik didalam tanah, air, udara maupun pada
makhluk hidup termasuk pada jaringan tubuh kita sendiri (kulit dan selaput
lendir).Mikroba sangat beragam jumlahnya, yang umumnya berada dalam suatu populasi
campuran.Dalam keadaan sebenarnya (di alam bebas) tidak ada bakteri yang hidup
tersendiri terlepas dari spesies lainnya.Mikroba jarang terdapat di alam dalam keadaan
murni.Kebanyakan merupakan campuran bermacam-macam spesies mikroba.Kerapkali
bakteri patogen terdapat bersama-sama bakteri yang tidak berbahaya sehingga beberapa
teknik isolasi dan pemurnian mikroba sangat diperlukan untuk memisahkan tiap jenis
mikroba tersebut sehingga dapat dilakukan penelitian lebih lanjut (Waluyo,
2004).Identifikasi mikroba bertujuan untuk mengetahui sifat-sifat morfologi, biokimia,
dan molekuler dari bakteri.

https://biologi.uin-malang.ac.id/wp-content/uploads/2020/11/PANDUAN-
PRAKTIKUM-FIX.pdf

2. Apakah isolasi mikroba hanya dengan teknik pengenceran saja?

Jawab:

Melalui teknik pengenceran dan beberapa metode yaitu:

a. Spread Plate Method (Tebar/Sebar)
Teknik spread plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi
kultur mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah memadat.
Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba. Karena
konsentrasi sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui, maka pengenceran perlu
dilakukan beberapa tahap, sehingga sekurang-kurangnya ada satu dari pengenceran
itu yang mengandung koloni terpisah (30-300 koloni).Koloni mikrobia yang terpisah
memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung.
 b. Pour Plate Method (Tuang)
Dasar dari metode ini yaitu menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada
temperatur 45-50oC dengan suspensi bahan  yang mengandung mikroba, dan
menuangkannya ke dalam cawan petri steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-
koloni yang tersebar di permukaan agar yang mungkin berasal dari 1 sel bakteri,
sehingga dapat diisolasi lebih lanjut.

c. Streak Plate Method (Gores)

Metode gores umumnya digunakan mengisolasi koloni mikroba pada cawan agar
sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni. Dasar metode ini
yaitu dengan menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada
permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada
bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel
mikroba, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut. Penggoresan yang sempurna akan
menghasilkan koloni yang terpisah. Bakteri yang memiliki flagella seringkali
membentuk koloni yang menyebar terutama bila digunakan lempengan yang basah.
Untuk mencegah hal itu harus digunakan lempengan agar yang benar-benar kering
permukaannya

3. Bisakah isolasi mikroba berhasil jika tidak menggunakan sistem pengenceran?

Jawab:
Menurut sumber yang saya baca bahwa teknik pengenceran dilakukan untuk mengurangi
jumlah mikroba dalam sampel sehingga dapat diamati dan dihitung jumlahnya secara
spesifik. Maka dari itu perlu dilakukan pengenceran, dan apabila tidak ada teknik
pengenceran kemungkinan isolasi mikroba tidak akan berhasil.

4. Apa tujuan dari pengenceran bertingkat?

5. Mengapa perlu dilakukan pengenceran bertingkat dalam mengisolasi mikroba?
Jawab:
Sebelum melakukan kegiatan isolasi dan inokulasi, biasanya dilakukan terlebih dahulu
kegiatan pembuatan pengenceran bertingkat.Menurut (Wasteson and Hornes, 2009)
tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba
yang tersuspensi dalam cairan. Sehingga memudahkan dalam proses penghitungan
jumlah mikrobia. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung
kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk
sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya
mengandung 1/10 sel mikroorganisme dari pengenceran sebelumnya. Maka dapat
disimpulkan bahwa semakin banyak tingkat pengenceran maka akan
meghasilkan mikroba yang semakin sedikit.
https://faperta.untidar.ac.id/wp-content/uploads/2017/09/PANDUAN-PRAKTIKUM-
MIKROBIOLOGI-2019-Peternakan-Baru.pdf
6. Apakah hanya dengan teknik pengenceran dapat mengetahui jenis mikroba yang
potensial atau merugikan kehidupan?
Jawab:
Melalui teknik pengenceran dan beberapa metode yaitu:
a. Spread Plate Method (Tebar/Sebar)
Teknik spread plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi
kultur mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah
memadat. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba.
Karena konsentrasi sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui, maka
pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap, sehingga sekurang-kurangnya ada satu
dari pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah (30-300 koloni). Koloni
mikrobia yang terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung

b. Pour Plate Method (Tuang)

Dasar dari metode ini yaitu menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada
temperatur 45-50oC dengan suspensi bahan  yang mengandung mikroba, dan
menuangkannya ke dalam cawan petri steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-
koloni yang tersebar di permukaan agar yang mungkin berasal dari 1 sel bakteri,
sehingga dapat diisolasi lebih lanjut.

c. Streak Plate Method (Gores)

Metode gores umumnya digunakan mengisolasi koloni mikroba pada cawan agar
sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni. Dasar metode ini
yaitu dengan menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada
permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada
bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel
mikroba, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut. Penggoresan yang sempurna akan
menghasilkan koloni yang terpisah. Bakteri yang memiliki flagella seringkali
membentuk koloni yang menyebar terutama bila digunakan lempengan yang
basah.Untuk mencegah hal itu harus digunakan lempengan agar yang benar-benar
kering permukaannya.

7. apakah dengan teknik pengenceran saja untuk mengetahui perhitungan jumlah sel
mikroba?
Jawab:
Penghitungan jumlah sel mikroba dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, antara
lain
-Penghitungan langsung menggunakan haemocytometer
Pada haemocytometer ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu
kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu
kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar
tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri
yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri
per satuan volume dapat diketahui.
 -Penghitungan tidak langsung : hitung cawan / Angka Lempeng Total / Total Plate
Count
Prinsip metode hitung cawan adalah jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan
pada media agar, maka sel mikroba itu akan berbiak membentuk koloni yang dapat
dilihat dan dihitung dengan mata telanjang, dan disebut dengan “colony forming unit” =
cfu.
Metode hitungan cawan dapat dilakukan dengan menggunakan metode tuang (pour plate)
dan metode permukaan (surface/spread plate). Penghitungan jumlah mikroba dianggap
valid jika dalam satu cawan tumbuh koloni sebanyak 30-300, sehingga jika pertumbuhan
mikroba terlalu padat, maka harus dilakukan pengenceran terlebih dahulu

file:///C:/Users/HP/Downloads/PANDUAN-PRAKTIKUM-FIX.pdf

8. Kenapa prosedur isolasi dan pengenceran hanya menggunakan sampel mikroba dari tanah
dan udara saja? Apakah mikroba dari air juga dapat diisolasi?
Jawab:
Tidak hanya mikroba dari tanah dan udara saja, karena mikroorganisme ini terdapat
dimana-mana seperti di air, tanah, udara, hewan, dan tumbuhan maka prosedur isolasi
pengenceran ini dapat menggunakan sampel dari air, tanah, udara,dll.

Tentu saja bisa melakukan isolasi mikroba dari air, tetapi caranya beda dengan isolasi
dari tanah dan udara. Sebagai contoh saya mengambil contoh isolasi mikroba air laut

Cara kerja :

1. Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel air laut dilakukan dengan mengambil air laut saat air laut surut dan
dimasukkan kedalam botol.

2. Media Pertumbuhan Bakteri

Sebelum dilakukan kultur bakteri, disiapkan terlebih dahulu media kultur bakteri. Media
kultur bakteri yaitu media Nutrient Agar (NA). Media nutrient agar dibuat dengan tujuan
sebagai media kultur isolat bakteri. Sebelum membuat media nutrient agar, dilakukan
sterilisasi cawan petri di dalam autoclave selama ± 1 jam dengan suhu 121ºC. Setelah itu,
bahan media agar dibuat dengan mencampurkan 1 gram nutrient broth (1%), dan 2gram
agar (2%) ke dalam 50 ml air laut steril dan 50 ml aquades pada Erlenmeyer yang
berkapasitas 250 ml dan diaduk menggunakan magnetic steerer. Setelah bahan teraduk
secara sempurna, erlenmeyer ditutup menggunakan kapas dan alumunium foil dan
disterilkan.
 3. Pengenceran Sampel

Pengenceran sampel ini bertujuan untuk memperoleh isolat murni bakteri. Setiap koloni
bakteri yang tumbuh dipisahkan berdasarkan warna, ukuran danbentuk koloni kemudian
diisolasi dengan menumbuhkannya pada media yang sama menggunakan autoclave
dengan suhu121ºC selama ± 1 jam.

4. Isolasi Bakteri

Sampel hasil pengenceran kemudian disebarkan dalam media NA dengan menggunakan

metode penyebaran (spread) dengan cara mengambil 100 μl sampel hasil pengenceran,
dan masing -masing dituang di atas media NA dan disebarkan menggunakan L-glass.
Diinkubasi pada suhu 370C selama 24- 48 jam. Diamati koloni bakteri yang tumbuh.

5. Karakterisasi Morfologi Bakteri

Setelah diperoleh koloni bebas bakteri hasil pengennceran, tahap selanjutnya dilakukan
karakterisasi morfologi bakteri yang bertujuan untuk melihat ciri-ciri dari bakteri secara
fisik.

https://ejournal.unsrat.ac.id/index.php/jplt/article/viewFile/24448/pdf

9. Kebanyakan bakteri peka terhadap ph yang agak asam. Apa yang menyebabkan hal itu
terjadi? Apa yg menyebabkan bakteri lebih peka terhadap pH yang agak asam?
sedangkan fungi lebih tahan terhadap rentang pH yang lebih lebar?
Jawab:
pHmerupakan salah satu faktor penting dalam pertumbuhan bakteri. Bakteri memerlukan
suatu pH optimum (6,5 - 7,5) untuk tumbuh optimal. Pengaruh pH terhadap pertumbuhan
bakteri ini berkaitan dengan aktivitas enzim.Enzim ini dibutuhkan oleh beberapa bakteri
untuk mengkatalis reaksireaksi yang berhubungan dengan pertumbuhan bakteri. Apabila
pH dalam suatu medium atau lingkungan tidak optimal maka akan mengganggu kerja
enzim-enzim tersebut dan akhirnya mengganggu pertumbuhan bakteri.

10. Pada PH dan temperatur berapa yang diperlukan dalam mengevaluasi bakteri?
Jawab:
Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba
1. Tingkat keasaman (pH)
Kebanyakan mikroba tumbuh baik pada pH sekitar netral dan pH 4,6 – 7,0 merupakan
kondisi optimum untuk pertumbuhan bakteri, sedangkan kapang dan khamir tumbuh pada
pH yang lebih rendah.
2. Suhu
Suhu merupakan salah satu factor lingkungan yang berpengaruh terhadap pertumbuhan
mikroba.Setiap mikroba mempunyai kisaran suhu dan suhu optimum tertentu untuk
 pertumbuhannya. Berdasarkan kisaran suhu pertumbuhan, mikroba dibedakan atas tiga
kelompok sebagai berikut:
 Psikrofil, yaitu mikroba yang mempunyai kisaran suhu pertumbuhan pada suhu
0-20o C.
 Mesofil, yaitu mikroba yang mempunyai kisaran suhu pertumbuhan 20- 45o C.
 Termofil, yaitu mikroba yang suhu pertumbuhannya diatas 45 o C.
Kebanyakan mikroba perusak pangan merupakan mikroba mesofil, yaitu tumbuh baik
pada suhu ruangan atau suhu kamar.Bakteri pathogen umumnya mempunyai suhu
optimum pertumbuhan sekitar 37o C, yang juga adalah suhu tubuh manusia.Oleh karena
itu suhu tubuh manusia merupakan suhu yang baik untuk pertumbuhan beberapa bakteri
pathogen.Mikroba perusak dan pathogen umumnya dapat tumbuh pada kisaran suhu 4–
66oC.

11. Apakah dalam pelaksanaan isolasi mikroba, benar-benar dapat diperoleh mikroba yang
sebanyak-banyaknya? dalam artian tak terbatas? Mengapa kita membutuhkan mikroba
sebanyak²nya? Lebih ke tujuan isolasi mikroba
Jawab:
Prinsip isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya
yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba.Pada prinsipnya tujuan isolasi
mikroba yaitu untuk mendapatkan mikroba yang dikehendaki sebanyak-banyaknya.
Untuk maksud tersebut dapat digunakan teknik diperkaya dan sistem
pengenceran.Misalnya sampel tanah atau air diencerkan sedemikian rupa sehingga
diharapkan pertumbuhan koloni tidak lebih 200 koloni per plate. Suspensi tersebut
dengan metode taburan spread
plate diinokulasikan pada cawan petri yang mengandung media diperkaya. Setelah
diinkubasi, akan terlihat koloni-koloni pada cawan tersebut dan siap untuk diisolasi.
Mengisolasi suatu mikroba ialah memisahkan mikroba tersebut dari lingkungannya di
alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan.Untuk isolasi
harus diketahui cara-cara menanam dan menumbuhkan mikroba pada medium biakan
serta syarat-syarat lain untuk pertumbuhannya.

12. Dalam mengisolasikan mikroorganisme, mikroorganisme jenis apa atau hanya mikroba
jenis tertentu yang harus diisolasi?
Jawab:
Populasi mikroorganisme yang ada di alam sekitar kita ini sangatlah besar dan cukup
kompleks.Beratus spesies mikroba menguasai setiap bagian tubuh kita seperti mulut,
saluran pencernaan dan kulit.Mereka terdapat dalam jumlah yang cukup besar.Sebagai
contoh, sekali kita bersin dapat menebarkan beribu- ribu mikroorganisme.Udara, tanah,
 dan air yang merupakan komponen alam sebagai tempat tinggal kita juga dihuni oleh
beragam mikroorganisme.Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri, khamir, kapang
dan sebagainya.Populasi dari mikroba yang ada di lingkungan ini sangatlah beraneka
ragam dan masih dalam bentuk campuran Oleh karena itu, di dalam penelaahan terhadap
suatu mikroorganisme, selain ditumbuhkan juga perlu dilakukan isolasi. Isolasi mikroba
berarti memisahkan satu jenis mikroba dari biakan campuran menjadi satu biakan murni
(populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk) Penelitian yang layak mengenai
mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisahkan
populasi campuran yang rumit ini, atau yang biasanya dikenal dengan istilah biakan
campuran, menjadi spesies yang berbeda- beda yang dikenal dengan istilah biakan murni,
dengan kata lain terdiri dari beberapa jenis mikroorganisme atau belum murni. Biakan
murni ini terdiri dari satu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk (Hans,
1996)

13. Apakah kemungkinan besar proses isolasi dapat terkontaminasi? Apa saja penyebabnya?
Dan apa yang akan terjadi jika proses isolasi terkontaminasi?
Jawab:
Apa itu Sterilisasi? Pentingkah?
Sterilisasi merupakan suatu proses untuk membebaskan alat, media, bahan dari
mikroorganisme kontaminan yang tidak diinginkan. Baik berupa bakteri patogen dan
apatogen Sterilisasi menjadi suatu hal yang perlu diperhatikan ketika ingin melakukan
penilitian atau praktikum, karena sterilisasi sangat berperan penting dalam membunuh
mikroba yang dapat mengganggu proses pengamatan akibat kontaminan dari bakteri yang
tidak diinginkan.
Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikrooganisme
sehingga biakan murni terbebas dari kontaminan. Kontaminan adalah organisme yang
tidak diinginkan ada bersama biakan murni (Madigan dkk., 2011. Hal-hal yang perlu
diperhatikan dalam isolasi mikroorganisme tersebut misalnya prosedur teknik aseptik,
jenis medium yang digunakan, teknik isolasi, teknik pemilihan sumber biakan (koloni),
dan penyimpanan pasca isolasi mikroorganisme (Harley & Prescott, 2002; Madigan dkk.,
2011).

14. Pada prosedur isolasi mikroba dari tanah terdapat bahan berupa media NA..apa media
NA itu?
Jawab:
Media NA = Media Nutrient Agar (NA) kebanyakan digunakan untuk bahan yang
ditumbuhi bakteri. Nutrient Agar (NA) termasuk kedalam media non selektif karena pada
media ini tidak hanya ditumbuhi satu macam mikroorganisme tertentu.Nutrient Agar
(NA) termasuk ke dalam media sintetik karena dalam pembuatan media ini dapat
diketahui komposisinya secara pasti.Hal ini sesuai dengan pernyataan Himedia (2016),
 bahwa NA (Nutrient Agar) merupakan nutrisi Agar digunakan untuk budidaya
mikroorganisme dan juga dapat diperkaya dengan darah atau cairan biologis lainnya.
Komposisi Natrium klorida , Beef ekstrak ,Yeast ekstrak Agar pH Akhir pada suhu 25 0C

15. mengapa media yang digunakan untuk isolasi akan mempengaruhi jenis mikroba yang
akan terisolasi?
Jawab:
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrient) yang
digunakan untuk membiakkan mikroba. Dalam pemeriksaan mikrobiologi, media
menjadi suatu hal yang penting agar mikroba yang dapat hidup dan menentukan bahwa
mikroba yang diperiksa adalah benar-benar mikroba yang dicari atau yang
diharapkan.Suatu media dapat menumbuhkan mikroorganisme dengan baik diperlukan
persyaratan antara lain: Media diinkubasikan pada suhu tertentu, kelembapan harus
cukup, pH sesuai, dan kadar oksigen cukup baik, media pembenihan harus steril, media
tidak mengandung zat-zat penghambat, dan media harus mengandung semua nutrisi yang
mudah digunakan mikroorganisme Nutrisi yang dibutuhkan mikroorganisme untuk
pertumbuhan meliputikarbon, nitrogen, unsur non logam seperti sulfur dan fosfor, unsur
logam seperti Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, dan Fe, vitamin, air, dan energi. Karena
mikroorganisme memiliki perbedaan pada kebutuhan nutrisinya, tidak ada satupun
medium yang dapat menumbuhkan seluruh mikroorganisme yang sama, maka dari itu
nutrisi dalam media lah yang mempengaruhi jenis mikroba apa yang akan terisolat.

16. Pada bab 2 ada disebutkan “Misalnya sampel tanah atau air diencerkan sedemikian rupa
sehingga diharapkan pertumbuhan koloni tidak lebih 200 koloni per plate. Suspensi
tersebut dengan metode taburan spread plate diinokulasikan pada cawan petri yang
mengandung media diperkaya” apakah maksud dari diinokulasikan itu bu?
Jawab:
Inokulasi merupakan kegiatan pemindahan mikroorganisme
baikberupa bakteri maupun jamur dari tempat atau sumber asalnya ke medium baru yang
telah dibuat dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi dan aseptis.Pemindahan sel-sel
mikroorganisme dari biakan ke medium

17. Bagaimana cara kerja dari tekhnik diperkaya?

Jawab:
Teknik kultur diperkaya merupakan suatu teknik isolasi kultur untuk mengisolasi bakteri
yang mempunyai sifat fisiologis yang khusus (jumlah kecil & tumbuh lambat) Prinsip
teknik kultur diperkaya menggunakan komposisi media dan kondisi inkubasi tertentu,
sehingga yang tumbuh hanya bakteri tertentu. Teknik kultur diperkaya :
  Menggunakan komposisi media
 Media cair dengan substrat khusus
 Mengisolasi organisme kedalam media padat
Inkubasi

Medium ini berpengaruh terhadap selektivitas bakteri namun dalam proses lebih lanjut
akan terjadi sukresi yang akan diikuti oleh pertumbuhan bakteri lain . Untuk mengatasi
hal tersebut biasanya pada periode tertentu harus diinokulasikan kembali kedalam
medium segar. Umumnya organisme dalam kultur diperkaya akan tergantung pada
besarnya laju pertumbuhan spesifik maksimum dibanding dengan laju pertumbuhan
spesifik maksimum organisme lain yang mampu tumbuh dalam inokolum tersebut.
Dalam hal ini yang perlu diperhatikan adalah saat perpindahan yang tepat agar organisme
yang diharapkan dapat tumbuh lebih baik.

18. Sampel tanah seperti apa yang dibutuhkan dalam isolasi mikroba?
Jawab:
Tanah merupakan salah satu habitat bagi mikroorganisme, dalam satu gram tanah
terdapat jutaan bakteri, fungi, protozoa dan mikroorganisme lainnya. Semua jenis tanah
dapat digunakan sebagai sampel isolasi bakteri, dengan ketentuan mengambil sampel
tanah dari kedalaman sekitar 5 cm. Yang disimpan menggunakan kantong plastik steril.

19. Pada tahapan isolasi mikroba dari tanah, dikatakan untuk memasukkan tanah kedalam
tabung reaksi yang terdapat 10 ml garam fisiologis. Kenapa garam fisiologis itu dicampur
dengan tanah? Dan kenapa harus menggunakan garam fisiologis? Apakah saat melakukan
isolasi mikroba harus menggunakan garam fisiologi 5%, apakah tidak boleh garam dapur
biasa? Apa perbedaan nya?
Jawab:
http://repository.poltekkes-kdi.ac.id/270/1/KTI%20Mahasiswa%20Oleh%20Monika
%20S%20Manggalik.pdf

Larutan ini digunakan sebagai media karena sifatnya yang isotonis sehingga tidak
merusak membrane sel pada bakteri.Pengguaan NaCl 0.9% disebabkan oleh larutan
tersebut bersifat isotonis. Larutan isotonis yang mempunyai komposisi yang sama dengan
cairan tubuh, sehingga sel tidak pecah atau mengkerut dan tetap stabil pada bentuk yang
sama seperti biasa. Dalam hal ini, peneliti melihat terdapat jenis NaCl 0.9% siap pakai
dan NaCl 0.9% yang dibuat terlebih dahulu sebelum digunakan.NaCl 0.9% siap pakai
yang berupa cairan intravena lebih umum digunakan pada pemeriksaan
laboratorium.Namun NaCl 0.9% juga dapat dibuat, baik dari serbuk NaCl murni ataupun
dari garam dapur (Sherwood, 2001).
 Sebagai alternatif NaCl dengan kadar 0.9% dapat dibuat melaui penimbangan NaCl
sebesar 0.85 gram dalam 100 mL aquadest. Garam NaCl yang dapat digunakan dan
beredar dipasaran saat ini ada beberapa macam, diantaranya adalah garam murni keluaran
pabrikan yang dibuat untuk kebutuhan bahan kimia pada laboratorium industri dan
kesehatan.Jenis NaCl lainnya adalah garam dapur yang dikenal secara umum sebagai
salah satu bumbu dapur. Selain karena mudah ditemukan dan penyuplaian bahan yang
tidak sulit, garam dapur dapat digunakan sebagai salah satu alternatif bahan pembuatan
NaCl 0.9% sebab dalam peraturan standarisasi nasional dikatakan bahwa garam dapur
minimal mengandung 94.9% kadar NaCl. Unsur lain seperti sulfat, magnesium dan
kalsium maksimum sebesar 2% dan kotoran kecil lainnya sebesar 1% (Badan standarisasi
nasional, 2000). Dengan kadar NaCl melebihi 90% ini dianggap dapat digunakan sebagai
salah satu sumber NaCl.

Meskipun NaCl dari garam murni memiliki efektifitas dan kualitas yang lebih baik dalam
pemeriksaan laboratorium jika dibandingkan dengan NaCl dari garam dapur. Namun 4
pembuatan NaCl dari garam dapur menunjukkan keunggulan dalam efisiensi biaya dan
kemudahan mendapatkan bahan baku. Selain itu penggunaan reagen buatan memiliki
keuntungan diantaranya dapat dibuat segar sehingga tidak memerlukan pengawet, bila
reagen terkontaminasi atau rusak dapat segera diganti dengan reagen baru tanpa perlu
menuggu pengiriman, serta memberikan penghematan kepada laboratorium. Namun juga
memiliki kerugian yaitu tidak melalui uji quality control dan tidak dapat ditentukan
stabilitasnya.

Menurut Lestari (2014) larutan garam fisiologis merupakan media terbaik untuk

menjaga ketahanan hidup isolat bakteri asam laktat, karena NaCl (larutan garam
fisiologis yang terbuat dari garam NaCl dengan konsentrasi 0,9% b/v) berfungsi untuk
menjaga keseimbangan ion sel mikroba.

Larutan fisiologis adalah larutan yang digunakan untuk mengencerkan.Contoh padaanalis
is mikrobiologi,contohnya adalah garam fisiologis (0,85 % NaCl).Natrium klorida
jugadikenal dengan garam dapar atau halit adalah senyawa kimia dengan rumus molekul 
NaCl.Senyawa ini adalah garam yang paling mempengaruhi salinitas laut dan cairanekstr
aseluler pada banyak organisme multiseluler. Sebagai komponen utama dari garamdapur,
natrium klorida sering digunakan sebagai bumbu dan pengawet makanan

20. Pengocokan tabung reaksi pada proses saat isolasi mikroba dari tanah menggunakan alat
atau secara manual?
Jawab:
Secara manual menggunakan tangan, atau dengan alat pengocok horizontal.Isolasi
Bakteri Penghasil Enzim Protease Alkalin Termostabil,Medium yang telah diinokulasi
 tersebut dikocok pada suhu 50°C selama 48-72 jam dengan alat pengocok horizontal
(Taiyo Incubator M-100N, Japan) pada kecepatan 120 ekskursi per menit.

21. Dalam isolasi mikroba dari tanah, ada proses mengkocok hingga homogen, pertanyaan
saya bagaimana kita tau sample tersebut telah homogen, seperti apa ciri – cirinya?
Jawab:

Ciri-ciri campuran homogen adalah:

- Partikel penyusun antara yang satu dengan yang lain tidak dapat dibedakan.
- Mempunyai warna yang sama rata.
- Mempunyai rasa yang sama.
- Zat yang tercampur memiliki perbandingan yang sama.
- Memiliki tingkat konsentrasi yang sama.
- Wujudnya berupa padatan, gas dan juga cairan.

22. Pada isolasi mikroba dari tanah, apakah terjadi perubahan bentuk pada pengenceran 10-1
dan seterusnya?
Jawab:
Benar sekali terjadi perubahan
https://biologi.uin-malang.ac.id/wp-content/uploads/2020/11/PANDUAN-
PRAKTIKUM-FIX.pdf
23. Bagaimana cara/proses isolasi mikroba dari tumbuhan? Apakah sama dengan isolasi
tanah?
Jawab:
Mikroorganisme pada suatu lingkungan alami merupakan populasi campuran dari
berbagai jenis, baik mikroorganisme pada tanah, air, udara, makanan, maupun yang
terdapat pada tubuh hewan maupun tumbuhan.Pemisahan bakteri diperlukan untuk
mengetahui jenis, mempelajari kultural, morfologi, fisiologi, dan karakteristik.Teknik
pemisahan tersebut disebut isolasi yang disertai dengan pemurnian. Pengertian isolasi
bakteri yaitu suatu proses mengambil bakteri dari medium atau dari lingkungan asalnya
lalu menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni
(Singleton & Sainsbury, 2006).

Antibiotik telah lama digunakan sebagai pencegahan dan pengobatan

penyakit.Penggunaan antibiotik semakin meningkat seiring dengan peningkatan kasus
penyakit, terutama penyakit infeksi.Sebagian besar antibiotik yang secara komersil
digunakan merupakan antibiotik sintetik yang rentan memicu resistensi terhadap patogen,
terutama bakteri (Ruhe et al 2005; Kiyomizu et al 2008; Savini et al 2009).Eksplorasi
untuk menemukan sumber antibiotik alami yang baru perlu dilakukan.Salah satunya
dengan memanfaatkan bakteri endofit.
 Bakteri endofit adalah bakteri yang hidup di dalam jaringan tanaman inang tanpa
menyebabkan gejala-gejala penyakit (Bhore dan Sathisha 2010).Beberapa jenis bakteri
endofit diketahui mampu menghasilkan senyawa aktif yang bersifat antibiotik (Castillo et
al 2003), antimalaria (Simanjuntak et al 2004) dan antifungi (Beck et al
2003).Kemampuan bakteri endofit menghasilkan senyawa aktif tersebut merupakan
potensi yang dapat dikembangkan mengingat umumnya senyawa aktif diperoleh dengan
mengekstraksi tanaman, khususnya tanaman obat. Untuk memperoleh senyawa aktif dari
tanaman dibutuhkan waktu dan proses yang lebih rumit dibandingkan jika mengekstraksi
senyawa dari bakteri.
Salah satu tanaman obat yang dapat dijadikan sumber bakteri endofit adalah sirih
hijau (Piper betle L.). Sirih hijau merupakan tanaman yang memiliki khasiat medis dan
banyak digunakan di Indonesia, India dan negara-negara di wilayah Indo-Cina lainnya,
yaitu Malaysia, Vietnam, Laos, Kamboja, Thailand, Myanmar dan Singapura. Bagian
tanaman sirih yang banyak digunakan adalah daunnya.Kajian mengenai sirih hijau dalam
bidang kesehatan telah dilakukan.Sebagai contoh, daun sirih hijau yang diekstrak dengan
akuades steril menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap Streptococcus mutans
secara in vitro (Nalina & Rahim 2007).Al-Adhroey et al (2011) menyatakan bahwa
esktrak metanol daun sirih hijau memiliki aktivitas antimalaria terhadap Plasmodium
berghei.
Kajian tentang manfaat sirih hijau telah dilakukan dengan mengisolasi dan
mengidentifikasi senyawa aktif yang terkandung di dalamnya. Senyawa Hydroxychavicol
(HC) dari sirih hijau diketahui memiliki aktivitas penghambatan terhadap xantin oksidase
(Murata et al 2009) dan juga bersifat antifungi terhadap genus Candida dan Aspergillus
dalam uji in vitro (Ali et al 2010). Senyawa yang merupakan turunan HC, yaitu
Hydroxychavicol acetate (HCA) memiliki berbagai aktivitas diantaranya sebagai
imunomodulator (Min et al 2009), antibakteri (Sharma et al 2009) dan anti penggumpalan
darah (Chang et al 2007).
Allylpyrocatechol (APC) yang sebagian besar diisolasi dari daun sirih memiliki
efek terhadap pencernaan diantaranya melindungi lambung dari timbulnya ulkus (luka
lambung) (Tripathi 2008), menyembuhkan ulkus (Yadav et al 2009) dan berperan sebagai
anti-inflamasi (Santhakumari et al 2006). Menurut (Zeng et al 1997 dalam Kumar et al
2010), senyawa Piperbetol dalam sirih memiliki kemampuan selektif dalam menghambat
agregasi platelet yang diinduksi oleh mekanisme platelet activating factor (PAF) pada
konsentrasi tertentu, sehingga diharapkan dapat mencegah timbulnya penyakit
kardiovaskular. Senyawa lain yang merupakan turunan Piperbetol seperti
Methylpiperbetol, Piperol A dan Piperol B juga telah berhasil diidentifikasi namun
aktivitasnya belum diuji lebih lanjut.
Bakteri endofit yang berada dalam tanaman sirih hijau kemungkinan besar
mampu menghasilkan salah satu senyawa aktif tersebut atau senyawa lain yang bersifat
antibiotik. Sejauh ini belum dilaporkan adanya isolasi bakteri endofit dari tanaman sirih
hijau serta pengujian terhadap senyawa aktif yang diproduksi bakteri endofit dari
tanaman sirih hijau.Penelitian ini bertujuan mengisolasi bakteri endofit dari tanaman sirih
hijau sekaligus melakukan penapisan awal untuk memperoleh isolat bakteri endofit yang
berpotensi menghasilkan senyawa antibiotik, khususnya antibakteri.

2. BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah tanaman sirih (Piper betle L.) yang
diperoleh dari daerah Ciampea-Bogor dalam kondisi segar, kultur Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Bacillus cereus, dan Salmonella enteritidis (koleksi dari Laboratorium
Bakteriologi Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor), media Nutrient Agar
(NA), media Nutrient Broth (NB), larutan natrium hipoklorit 5.25 %, etanol 70 %,
akuades, nistatin, antibiotik kanamycin. Alat-alat yang digunakan antara lain cawan Petri,
tabung reaksi, autoklaf, dan inkubator.

Metode Penelitian

Isolasi Bakteri Endofit

Bagian tanaman sirih yang digunakan adalah daun, batang dan akar dalam kondisi segar.
Sampel tanaman dalam keadaan segar dibersihkan dengan air mengalir kemudian
dipotong-potong sepanjang 1-3 cm dan dipisahkan menurut bagian tanamannya.
Potongan sampel direndam dalam etanol 70 % selama 1 menit, larutan natrium hipoklorit
5.25 % selama 5 menit, dan dicuci dengan etanol 70 % sebanyak tiga kali. Potongan
sampel diiris secara steril kemudian ditanam dalam media nutrient agar (NA) yang
mengandung nistatin.Media yang sudah mengandung sampel tersebut diinkubasi pada
suhu ruang dalam keadaan gelap dan diamati setiap hari sampai ada pertumbuhan koloni.
Jika selama 24 jam di sekitar sampel tanaman belum menunjukkan adanya pertumbuhan
mikroba, sterilisasi permukaan dikatakan berhasil. Bakteri endofit yang tumbuh
dimurnikan satu per satu dan dikultivasi dalam agar miring. Isolat bakteri endofit yang
telah murni diidentifikasi secara morfologi berdasarkan warna koloni, bentuk tepian
koloni, elevasi koloni dan konsistensi koloni serta kecepatan pertumbuhan koloni
(Modifikasi Desriani et al. 2013)

Penapisan untuk memperoleh isolat bakteri endofit potensial

Isolat bakteri endofit dari agar miring diregenerasi ke media NA, sedangkan bakteri uji
diregenerasi ke dalam 5 mL media nutrient broth (NB) lalu diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 28-30 °C. Sebanyak 0.4 mL kultur cair bakteri uji dimasukkan ke dalam 80 mL
media NA yang bersuhu ±40 °C. Lalu dituangkan sebanyak 20 mL ke dalam cawan Petri
steril dan ditunggu hingga memadat. Isolat bakteri endofit yang akan diuji diinokulasikan
ke media berisi patogen menggunakan ose, kemudian diinkubasi selama 24 – 48 jam.
Zona hambat yang terbentuk diamati dan dibandingkan dengan kontrol positif
(kanamycin 50µg/mL).Kemudian diameter zona hambat diukur dan isolat bakteri endofit
yang positif menunjukkan zona hambat dikatakan sebagai isolat potensial (Simarmata et
al. 2007).

file:///C:/Users/ASUS/Downloads/17890-Article%20Text-54261-1-10-20170902.pdf

Udara bukan merupakan medium tempat mikroba tumbuh, tetapi merupakan pembawa
bahan partikulat, debu, dan tetesan air yang semuanya sangat mungkin dimuati
mikroba.Jumlah dan tipe mikroba yang mencemari udara ditentukan oleh sumber
pencemaran di dalam lingkungan, misalnya dari saluran pernafasan manusia
disemprotkan melalui batuk atau bersin. Pengambilan sampel udara dilakukan dengan
cara “Settled Down Plate” yang menggunakan media Agar Darah, Agar Nutrient dan
Agar MacConkey dalam cawan petri yang diletakan di sekitar meja operasi/tempat tidur
pasien. Ada 4 ruang/kamar operasi di Instalasi Bedah Sentral (IBS) yang masing-masing
diambil sampel udaranya sesaat sebelum dan sesudah operasi.1 Media spesifik Agar
Darah (AD), 1 Agar Nutrient (NA) dan 1 Agar MacConkey diletakan di sekitar meja
operasi di setiap ruangan.Media dibuka selama 10 – 30 menit dalam ruang operasi,
setelah selesai ditutup. Untuk perjalanan ke ruang operasi Instalasi Bedah Sentral (IBS)
maupun perjalanan kembali ke laboratorium mikrobiologi sampel ditempatkan dalam
boks berisi es.

https://media.neliti.com/media/publications/59344-ID-identifikasi-bakteri-aerob-di-udara-
ruan.pdf

Udara bukan merupakan medium tempat mikroba tumbuh, tetapi merupakan pembawa
bahan partikulat seperti debu tetesan air yang semuanya sangat mungkin dimuati
mikroba.Kualitas udara dalam ruang selain dipengaruhi oleh keberadaan agen abiotik
juga dipengaruhi oleh agen biotik seperti partikel debu, dan mikroorganisme termasuk di
dalamnya bakteri, jamur, virus dan lain-lain.

Keberadaan mikroorganisme secara alamiah tidak ada di udara, karena udara bukan
habitat mikroorganisme.Mikroorganisme berada di udara karena terbawa angin bersama
partikel debu atau untuk sementara mengapung di udara.Udara bukan merupakan habitat
hidup mikroba, aktivitas manusia baik disengaja maupun tidak membantu terciptanya
media hidup sementara di udara, misalnya kelembaban yang terjadi saat manusia
bernapas atau bersin, furniture atau alas ruangan yang basah, dalam ruangan dan lain
-lain.

suhu optimum sekitar 37ºC.Penghitungan dan identifikasi dilakukan setelah inkubasi

selama 1x24 jam
 Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain
yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan
menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni sel yang
tetap pada tempatnya. Beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari
suatu biakan campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah metode
cawan gores dan metode cawan tuang. Yang didasarkan pada prinsip pengenceran dengan
maksud untuk memperoleh spesies individu.Dengan anggapan bahwa setiap koloni dapat
terpisah dari satu jenis sel yang dapat diamati (Afrianto, 2004).

24. Dalam pratikum isolasi dan pengenceran, terdapat pratikum isolasi mikroba dari udara.
Apakah kita mesti menggerakkan cawan petrinya ke udara atau meletakkan disuatu
tempat menunggu beberapa menit ?
Jawab:
Pengambilan sampel udara dilakukan dengan cara “Settled Down Plate” yang
menggunakan media Agar Darah, Agar Nutrient dan Agar MacConkey dalam cawan petri
yang diletakan di sekitar meja operasi/tempat tidur pasien. Ada 4 ruang/kamar operasi di
Instalasi Bedah Sentral (IBS) yang masing-masing diambil sampel udaranya sesaat
sebelum dan sesudah operasi.1 Media spesifik Agar Darah (AD), 1 Agar Nutrient (NA)
dan 1 Agar MacConkey diletakan di sekitar meja operasi di setiap ruangan.Media dibuka
selama 10 – 30 menit dalam ruang operasi, setelah selesai ditutup. Untuk perjalanan ke
ruang operasi Instalasi Bedah Sentral (IBS) maupun perjalanan kembali ke laboratorium
mikrobiologi sampel ditempatkan dalam boks berisi es.

https://fk.uii.ac.id/mikrobiologi/materi/sterilisasi/

25. Untuk isolasi mikroba dari udara cukup dengan membuka cawan petri yang sudah
mengandung media di udara terbuka selama 1, 3, dan 5 menit. Jika terbuka lebih dari
waktu itu bisa mengakibatkan apa? bagaimana jika waktu yang digunakan lebih dari 5
menit? apa yg terjadi?
Jawab:
Pengambilan sampel udara dilakukan dengan cara “Settled Down Plate” yang
menggunakan media Agar Darah, Agar Nutrient dan Agar MacConkey dalam cawan petri
yang diletakan di sekitar meja operasi/tempat tidur pasien. Ada 4 ruang/kamar operasi di
Instalasi Bedah Sentral (IBS) yang masing-masing diambil sampel udaranya sesaat
sebelum dan sesudah operasi.1 Media spesifik Agar Darah (AD), 1 Agar Nutrient (NA)
dan 1 Agar MacConkey diletakan di sekitar meja operasi di setiap ruangan.Media dibuka
selama 10 – 30 menit dalam ruang operasi, setelah selesai ditutup. Untuk perjalanan ke
ruang operasi Instalasi Bedah Sentral (IBS) maupun perjalanan kembali ke laboratorium
mikrobiologi sampel ditempatkan dalam boks berisi es.
https://fk.uii.ac.id/mikrobiologi/materi/sterilisasi/

26. Apa proses isolasi mikroba dari udara akan berhasil jika proses inkubasi tidak dilakukan
selama 24 jam dan tidak pada suhu 37°?
Jawab:
1. Tidak berhasil, karena pada proses inkubasi ini dibutuhkan waktu min 24 jam, apabila
tidak sampai 24 jam maka koloni tidak akan tumbuh.
2. Sama halnya dengan inkubasi, suhu optimum pertumbuhan bakteri adalah 37 C
sehingga jika tidak pada suhu ini maka bakteri tidak akan tumbuh

https://fk.uii.ac.id/mikrobiologi/materi/sterilisasi/

27. Diantara ketiga teknik untuk mengisolasi dan menanam mikroba, manakah dari ketiga
teknik yang baik untuk digunakan? cara mana yang memiliki tingkat keberhasilan paling
tinggi?
Jawab:
Teknik isolasi bakteri dilakukan dengan metode gores dengan tujuan untuk menghasilkan
koloni-koloni bakteri yang terpisah dengan baik dari suspensi yang masih pekat.

https://fk.uii.ac.id/mikrobiologi/materi/sterilisasi/