Teknik Inokulasi

Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni

mikroorganisme yaitu :
a. Metode gores
Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu,
tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan.
Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum
digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum
pindah ( lup inokulasi ). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang
cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni. Cara penggarisan
dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan
baik teknik inilah yang paling praktis.
Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium
tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada
lempeng medium pembiakan. Penentuan atau pengukuran jumlah sel biasanya
dilakukan untuk organisme bersel tunggal (misalnya bakteri), sedangkan
penentuan massa sel dapat dilakukan bukan hanya untuk organisme bersel
tunggal, tetapi juga untuk organisme berfilamen (misalnya kapang). Setetes
inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam cawan petridish dan
dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itu
disebarkan dalam medium batang yang sama dapat digunakan dapat
menginokulasikan pinggan kedua untuk dapat menjamin penyebaran bakteri yang
merata dengan baik. Pada beberapa pinggan akan muncul koloni koloni yang
terpisah-pisah. Berikut ada beberapa contoh dalam teknik penggoresan yang
biasanya dilakukan oleh praktikkan dalam percobaan teknologi bioproses, yang
dibedakan menjadi beberapa teknik dalam penggoresan yaitu goresan T, kuadran,
radian dan sinambung.
Cara lain untuk mengukur jumlah sel antara lain dengan penyaring sampel
dengan suatu saringan membran, lalu diinkubasikan pada permukaan medium
yang sesuai. Jasad-jasad renik yang tertahan pada permukaan saringan menyerap
nutrien dari medium dan menghasilkan koloni-koloni yang masing-masing berasal
dari satu sel tunggal yang dapat hidup.
Metode Cawan Gores (Streak Plate), prinsip metode ini yaitu mendapatkan
koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah
proses isolasi. Cara ini dilakukan dengan membagi 3-4 cawan petri. Ose steril
yang telah disiapkan diletakkan pada sumber isolat , kemudian menggoreskan ose
tersebut pada cawan petri berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3-4 kali
membentuk garis horisontal disatu cawan. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen.
Setelah kering, ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya
pada sisi cawan ke dua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan
tergores (Dwijoseputro, 2002).
Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yakni :
1) Goresan T

Gambar 1. Goresan T
2) Goresan Kuadran

Gambar 2. Goresan kuadran

3) Goresan Radian

Gambar 3. Goresan radian

4) Goresan Sinambung

Gambar 4. Goresan sinambung

b) Metode tuang
Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar
melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada
suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung. Biasanya metode seperti ini
akan digunakan untuk medium yang cair dan tempat perkembangbiakkan nya
cawan petri.
Khamir (yeast) merupakan jasad renik (mikroorganisme) yang pertama
digunakan manusia dalam industry pangan. Yeast adalah salah satu
mikroorganisme yang termasuk dalam golongan fungi yang dibedakan bentuknya
dari mould (kapang) karena berbentuk uniseluler. Reproduksi vegetative pada
khamir terutama dengan cara pertunasan. Sebagai sel tunggal yeast tumbuh dan
berkembang biak lebih cepat dibandingkan dengan mould yang tumbuh dengan
pembentuk filamen. Yeast sangat mudah dibedakan dengan mikroorganisme yang
lain misalnya dengan bakteri, yeast mempunyai ukuran sel yang lebih besar dan
morfologi yang berbeda. Sedangkan dengan protozoa, yeast mempunyai dinding
sel yang lebih kuat serta tidak melakukan fotosintesis bila dibandingkan dengan
gangggang atau algae. Dibandingkan dengan kapang dalam pemecahanbaha
komponen kimia yeast lebih efektif memecahnya dan lebih luas permukaan serta
volume hasilnya lebih baik (Buckle, 2001).
Begitu pentingnya isolasi bakteri ini dalam mata kuliah fermentasi yang
sedang kita pelajari sekarang agar kita dapat mengidentifikasi dan meneliti suatu
mikroba dengan pertumbuhan yang diinginkan. Selain itu kita juga harus
mengetahui lingkungan optimum yang dapat digunakan untuk mengembangkan
mikroba yang kita inginkan dalam sebuah penelitian atau pembelajaran tentang
fermentasi secara praktik. Lingkungan, suhu yang optimum beserta PH yang
standar.
c) Metode tusuk
Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung
jarum ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam
media.
d) Metode tebar
Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam
cawanpetridish dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril.
Inokulasi itudisebarkan dalam medium batang yang sama dapat digunakan dapat
menginokulasikan pinggan kedua untuk dapat menjamin penyebaran bakteri yang
merata dengan baik. Menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan
cara menuangkan stok kultur bakteri atau menghapuskannya di atas media agar
yang telah memadat, sedangkan pour plate kultur dicampurkan ketika media
masih cair (belom memadat). Pada beberapa pinggan akan muncul koloni koloni
yang terpisah-pisah. Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh
dapat tersebar merata pada bagian permukaan agar. Digunakan untuk
mengencerkan atau mengisolasi yang terdapat pada contoh. Setelah inkubasi pada
suhu dan waktu tertentu, koloni akan tumbuh pada permukaan dan bagian bawah
agar. persyaratan utama bagi isolasi dan kultuvasi fage adalah harus adanya
kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofag
yang paling baik dan paling utama adalah habitat inangnya. Sebagai contoh fage
coli yang dijumpai di dalam pencernaan dapat diisolosi dari limbah atu pupuk
kandang. Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi bahan sumbernya dan
penambahan kloroform untuk membunuh sel-sel bakterinya. Selain itu juga
penambahan kloroform berfungsi untuk memperkaya zat warna dari bakteri
masing – masing, kloroform merupakan zat hijau pada daun.

....................
......
....................
....................
.
Gambar 5. Metode tebar
Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri
1. Inokulasi jamur menggunakan jarum ose bentuk batang. Hifa yang berbentuk
seperti benang mudah diambil dengan jarum oase batang dan mudah sekali
tumbuh di dalam suatu media.
2. Inokulasi bakteri menggunakan jarum ose bentuk bulat. Pada ujung jarum ose
yang berbentuk bulat, bakteri akan dapat terambil dalam jumlah yang relatif
banyak. Cara ini merupakan perhitungan kerapatan materi (sel) di dalam larutan,
yang diberi cahaya. Kualitas bias cahaya yang dilkakukan identik dengan
kerapatan materi sel yang berada dalam larutan.
Teknik Aseptik

Sebelum benar-benar dilakukan proses kultur mikroorganisme, pertama kali

kita harus mempertimbangkan bagaimana agar tidak terjadi kontaminasi.
Mikroorganisme ada dimana-mana. Karena ukurannya yang sangat kecil, mereka
mudah lepas dalam udara danpermukaan. Maka dari itu, kita harus
mensterilisasikan medium kultur secepatnya setelah preparasi untuk pemindahan
mikroorganisme siap dikontaminasikan, ini biasanya terbunuh. Bagaimanapun, itu
sama pentingnya untuk tindakan pencegahan sampai penanganan berikutnya
medium kultur harus tetap steril. Demikian materi yang lain yang akan
kontak juga harus tetap terjaga kesterilannya (Cappuccino, 1983).
Teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi hingga kultur
manipulasi dan media kultur steril disebut teknik aseptik. Keunggulan itu
dibutuhkan keberhasilan dalam laboratorium mikrobiologi, dan salah satu cara
belajar dengan pendamping mikrobilogi. Kontaminasi udara paling sering menjadi
masalah karena udara selalu kontak dengan partikel debu dan umumnya banyak
komunitas mikroorganisme didalamnya. Ketika wadah dibuka maka segera
ditangani agar tidak terkontaminasi dengan udara sekitar. Transfer aseptik pada
kultur dari salah satu medium ke medium yang lain harus lihai dengan loop
inokulasi atau jarum harus disterilkan oleh pembakaran pada nyala api. Dalam
pertumbuhan kultur dibutuhkan tempat yang mudah dipindahkan ke permukaan
agar datar, dimana pertumbuhan suatu koloni berasal dari pertumbuhan dan
pembelahan sel tunggal (Capuccino, 1983).
 Gambar 6. Teknik aseptik
Escherichia coli Menurut Kenneath tahun (2008), termasuk dalam famili
Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang
fermentatif. E.coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu
membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen.
Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang
menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic
(hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di
air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses
manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi (Mikrolibrary, 2008). Klasifikasi
Kingdom : Bakteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Order : Enterobacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escheriachia
Spesies : E. coli
Escherichia coli biasanya hidup di dalam intestinum pada manusia ataupun
hewan,memiliki gram negative, dan fakultatif anaerob. Merupakan makhluk
prokariot. Pada kondisi tertentu bisa menjadi pathogen atau dapat menyebabkan
penyakit. Dan bakteri ini juga dapat menyebabkan keracunan makanan, dan yang
paling sering adalah dapatmenyebabkan diare serta beberapa penyakit yang
sejenis (Anonim, 2008). Escherichia coli memproduksi racun yang berbahaya di
lapisan intestinum. Bilaterjadi desakan pada intestinum maka akan menghasilkan
racun tersebut untuk menkontaminasi daging dan susu. Escherichia coli
merupakan mikroorganisme normalyang berasal dari kotoran hewan atau manusia
baik dalam kondisi sehat maupun sakit. Oleh karena itu, dikenal juga dengan
istilah koli tinja. Morfologi sel bakteri Escherechiacoli berupa batang pendek (0,5-
1,0 X 1,0-3,0 µm), serta motil (sel-selnya peritrikus, yaitu flagela secara merata
tersebar diseluruh permukaan sel) dan ada juga yang non motil. Ciri-ciri
biokimiawi nya adalah banyak sekali terjadi perubahan pada substrat. Keterangan
ini memberikan cara-cara dasar untuk membedakannya dengan yang lain.
Habitatnya pada lingkungan aquatik, tanah, makanan, air seni dan tinja (Pelczar,
1986)

Gambar 7. Aseptik transfer

Isolasi

Isolasi bakteri adalah proses mengambil bakteri dari medium atau

lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh
biakan yang murni. Bakteri dipindahkan dari satu tempat ke tempat lainnya harus
menggunakan prosedur aseptik. Aseptik berarti bebas dari sepsis, yaitu kondisi
terkontaminasi karena mikroorganisme lain. Teknik aseptik ini sangat penting bila
bekerja dengan bakteri. Beberapa alat yang digunakan untuk menjalankan
prosedur ini adalah bunsen dan laminar air flow Bila tidak dijalankan dengan
tepat, ada kemungkinan kontaminasi oleh miroorganisme lain sehingga akan
mengganggu hasil yang diharapkan. Teknik aseptik juga melindungi laboran dari
kontaminasi bakteri (Singleton dan Sainsbury, 2006).
Bakteri di alam umumnya tumbuh dalam populasi yang terdiri dari berbagai
spesies. Oleh karena itu, untuk mendapatkan biakan murni, sumber bakteri harus
diperlakukan dengan pengenceran agar didapat hanya 100-200 bakteri yang
ditransfer ke medium, sehingga dapat tumbuh menjadi koloni yang berasal dari
bakteri tunggal.
Ada beberapa metode untuk menginokulasi bakteri sesuai dengan jenis
medium tujuannya. Pada medium agar tegak, dilakukan metode tusuk
menggunakan jarum ose. Pada medium agar miring, dilakukan metode gores
dengan menggunakan loop ose. Pada medium petridisk, dapat digunakan metode
streak plate (metode gores), pour plate (metode tuang) atau spread plate (metode
sebar) Setelah inokulasi, dilakukan proses inkubasi, yaitu menyimpan medium
pada alat atau kontainer ada temperatur tertentu dan periode tertentu, sehingga
tercipta lingkungan yang menyediakan kondisi cocok untuk pertumbuhan bakteri.
Metode gores atau streak plate menggunakan loop ose dan
menggoreskannya ke permukaan medium agar dengan pola tertentu dengan
harapan pada ujung goresan, hanya sel-sel bakteri tunggal yang terlepas dari ose
dan menempel ke medium. Sel-sel bakteri tunggal ini akan membentuk koloni
tunggal yang kemudian dapat dipindahkan ke medium selanjutnya agar
didapatkan biakan murni.
Metode tuang atau pour plate dilakukan dengan 2 cara, yaitu dengan
mencampur suspensi bakteri dengan medium agar pada suhu 50ºC kemudian
menuangkannya pada petridisk atau dengan menyemprotkan suspensi pada dasar
petridisk, kemudian menuang medium agar keatasnya dan diaduk. Setelah agar
mengeras, bakteri akan berada pada tempatnya masing-masing dan diharapkan
bakteri tidak mengelompok sehingga terbentuk koloni tunggal.
Metode sebar atau spread plate dilakukan dengan menyemprotkan suspensi
ke atas medium agar kemudian menyebarkannya secara merata dengan trigalski.
Dengan ini diharapkan bakteri terpisah secara individual, kemudian dapat tumbuh
menjadi koloni tunggal. Metode pemaparan pada udara terbuka adalah metode
untuk mengisolasi bakteri udara. Metode ini sangat simpel, yaitu dengan
memaparkan medium pada udara terbuka, dengan harapan ada bakteri yang
menempel dan kemudian akan tumbuh menjadi koloni. Koloni pada bakteri
tergantung pada tekanan osmosis berapa dan PH berapa karena bakteri berkoloni
hidup secara bersamaan dan butuh kualifikasi bersama, sehingga kita sulit
membedakan bakteri jenis nya apa saja.
1. Isolasi pada agar cawan
Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan
mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari
organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut
setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam
metode isolasi pada agar cawan, yaitu metode gores kuadran, dan metode agar
cawan tuang. Metode gores kuadran, Bila metode ini dilakukan dengan baik akan
menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari
satu sel. Metode agar tuang, Berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang
menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (50 oC), yang
kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan
yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan/di
dalam cawan.
2. Isolasi pada medium cair
Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat
tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur
cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial
pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel
semakin besar.
3 Isolasi sel tunggal
Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme
berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium
cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali.
Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat
halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis.
Isolasi Mikroba

Setelah diperoleh biakan murni (koloni yang berasal dari sel tunggal),
mikroorganisme tersebut siap dilakukan telaah dan identifikasi,dan kemudian
ditumbuhkan sesuaitujuan. Pertumbuhan pada mikroorganisme diartikan sebagai
penambahan jumlah atau total massa sel yang melebihi inokulum asalnya. Telah
dijelaskan pada bahasan sebelumnya, bahwa sistem reproduksi bakteri adalah
dengan cara pembelahan biner melintang, satu sel membelah diri menjadi 2 sel
anakan yang identik dan terpisah. Selang waktu yang dibutuhkan bagi sel untuk
membelah diri menjadi dua kali lipat disebut sebagai waktu generasi. Waktu
generasi pada setiap bakteri tidak sama, ada yang hanya memerlukan 20 menit
bahkan ada yang memerlukan sampai berjam-jam atau berhari-hari. Bila bakteri
diinokulasikan ke dalam medium baru, pembiakan tidak segera terjadi tetapi ada
periode penyesuaian pada lingkungan yang dikenal dengan pertumbuhan.
Kemudian akan memperbanyak diri (replikasi) dengan laju yang konstan,
sehingga akan diperoleh kurva pertumbuhan.
Teknik pertumbuhan bakteri

1. Media biak dan persyaratan bagi pertumbuhan

Untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme diperlukan
suatu substrat yang disebut media. Dikarenakan dengan media yang cocok, maka
pertumbuhan mikroorganisme akan maksimal, subur dan cepat. Media biak
(larutan biak) dapat di buat dari senyawa-senyawa tertentu. Media biak dapat
dibagi menjadi 3 macam yaitu:
1. Media biak sintetik : media ini dibuat dari senyawa – senyawa kimia.
2. Media biak kompleks : media ini dibuat dari senyawa yang mengandung ektrak
ragi, otolitas ragi, pepton dan ekstrak daging.
3. Media biak padat, media ini dibuat dari larutan biak benar – benar kemudian
ditambahkan bahan pemadat yang memberi konsistensi seperti selai pada larutan
air.
Salah satu syarat untuk pertumbuhan mikroorganisme adalah kadar ion
hidrogen yang ada dilingkungannya. Perubahan kadar yang kecil saja sudah
mampu menimbulkan pengaruh yang besar. Alasan inilah yang amat penting
untuk menggunakan nilai pH awal yang optimum dan mempertahankannya
sepanjang pertumbuhan. Organisme hidup paling baik pada pH 7. selain kadar ion
hydrogen, dibutuhkan juga karbondioksida dan kadar air, suhu dan tekanan
osmatik. Pertumbuhan mikroorganisme tergantung dari bahan-bahan makanan.
Pada dasarnya larutan biak sekurang-kurangnya harus mengandung sebagai
berikut :
1. Kebutuhan nutrien pokok. Diantaranya karbon, oksigen, hidrogen,nitrogen,
belerang, fosfat, kalium, magnesium dan besi.
2. Sumber-sumber karbon dan energi.
3. Zat-zat pelengkap, yaitu suplemen yang termasuk komponen dasar dan
yang oleh beberapa mikroorganisme tidak dapat disintesis dari komponen-
komponen sederhana.
Dalam upaya mendukung pertumbuhan mikroorganisme secara
berkelanjutan dapat dilakukan dengan menyediakan media yang dikayakan.
Kondisi pengkayaan adalah kondisi dimana organisme dapat tetap tumbuh dengan
kehadiran saingan dengan menetapkan sejumlah faktor (sumber energi, sumber
karbon dan sumber nitrogen akseptor hidrogen dan atmosfir gas, cahaya, suhu, pH
dan selanjutnya) dapat ditetapkan kondisi lingkungan tertentu dan dapat
ditanamkan populasi campur yang terdapat dalam tanah atau dalam lumpur.
Bahan-bahan penanaman yang menguntungkan ialah bahan-bahan yang berasal
dari tempat dimana telah terjadi “pengkayaan alamiah” seperti : mikroorganisme
pengolah CO dalam limbah air pabrik gas, pengolah hemoglobin dalam limbah
pajagalan dan oksidator hidrokarbon di ladang minyak bumi dan bak minyak.
Untuk mikroorganisme yang sangat terspesialisasi harus dibuat kondisi
pengkayaan yang sangat selektif.
Medium mineral yang bebas nitrogen terikat dan tanpa cahaya merupakan
medium yang amat selektif untuk sianobakteri yang memfiksasi nitrogen. Bila
larutan medium yang sama dilengkapi dengan suatu sumber energi atau sumber
energi dan sumber karbon maka pada keadaan gelap dan pada kondisi aerob dan
tumbuh Azotobacter dan kalau Biak Murni. Untuk menumbuhkan dan
mengembang-biakan mikroorganisme, diperlukan suatu substrat yang disebut
media.