LAPORAN PRAKTIKUM

DASAR-DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Tugas Mata Kuliah Mikrobiologi

Dosen Pengampu: Vita Meylani, S.Pd., M.Sc.
Mufti Ali, S.Pd., M.Pd.

Oleh:
Reza Novia Ningrum 182154012
Kelas C
Kelompok 6

JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS SILIWANGI
2020
 ACARA III
DASAR-DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGI

A. Tujuan
1. Mempelajari cara-cara pemindahan mikroba secara aseptis.
2. Mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba.
3. Mempelajari teknik pembuatan pulasan bakteri untuk pengecatan/pewarnaan bakteri.
4. Mengenal bermacam-macam mikroba di alam.
B. Tinjauan Pustaka
Menurut Tortora, Funke, dan Case (2014) Mikroba, juga disebut mikroorganisme,
adalah makhluk kecil yang secara individual biasanya terlalu kecil untuk dilihat dengan
mata tanpa bantuan.
Menurut Sanders (2012) Mikroorganisme hadir pada semua permukaan benda mati
yang menciptakan sumber pencemaran di mana-mana di laboratorium. Keberhasilan
eksperimental bergantung pada kemampuan seorang ilmuwan untuk mensterilkan
permukaan dan peralatan kerja serta mencegah kontak dengan instrumen dan solusi steril
dengan permukaan yang tidak steril. Di sini kami menyajikan langkah-langkah untuk
beberapa metode pelapisan yang secara rutin digunakan di laboratorium untuk mengisolasi,
menyebarkan, atau menghitung mikroorganisme seperti bakteri dan fag.
Menurut Stewart (2012) Bakteri yang dapat tumbuh di laboratorium hanyalah
sebagian kecil dari total keanekaragaman yang ada di alam. Di semua tingkat filogeni
bakteri, clades tidak berbudaya yang tidak tumbuh pada media standar memainkan peran
penting dalam siklus karbon, nitrogen, dan unsur-unsur lain, mensintesis produk alami baru,
dan berdampak pada organisme dan lingkungan di sekitarnya.
Menurut Turtura, Funke, dan Case (2014) Jenis-jenis mikroba di alam : bakteri
Proteus kuman yang termasuk genus proteus berbentuk batang, pleomorph, bergerak aktif
dengan flagella peritrika dan gram (-) tumbuh aerobe. Terdapat di alam bebas seperti air,
tanah, sampah, dan tinja (proteus vulgaris). Bakteri Klebsiella, mudah dibiakan di media
sederhana (bouillon agar). Pada media padat tumbuh dengan koloni mucoid (24 jam), putih
keabuan dan permukaannya mengkilat. Ph untuk hidup 6,0 – 7,8 dan suhu 35 0C. Antigen –K
terdiri dari polisakarida, bersifat spesifik dan menimbulkan imunitas yang cukup baik.
Bakteri Psudomonas berbentuk batang bergerak dan menghasilkan pigmen yang mudah
larut dalam air dan berdifusi di dalam medium pertumbuhan. Kuman ini banyak terdapat di
tanah, sampah, air dan udara. Bakteri Vibrio fetus patogen bagi manusia dan hewan, Vibrio
apiseum patogen bagi ikan Vibrio coli patogen bagi babi. Bakteri Escherichia coli, dapat
mengisolasi kuman ini dari feses manusia dan hewan dan distal jumlahnya makin menurun.
Sebagai habitatnya adalah tractus digestifus dari manusia/ binatang, tanah, sampah dan air.
Bayi yang baru lahir, setelah 24 jam dapat kemasukan kuman ini dari ibunya atau perawat,
dan E. coli merupakan salah satu normal flora. E. coli mati pada pemanasan pada suhu
600C, selama 30 menit, tetapi ada juga yang resisten. Dalam media pada suhu kamar, kuman
dapat bertahan selama 1 minggu.
Menurut Cappucicino dan Sherman (2014) Agar berfungsi sebagai agen pembekuan
yang sangat baik karena mencair pada 100 ° C dan membeku pada 40 ° C. Karena sifat-sifat
ini, organisme, terutama patogen, dapat dibudidayakan pada suhu 37,5 ° C atau sedikit lebih
tinggi tanpa takut medium mencairkan. Medium yang benar-benar padat membutuhkan
konsentrasi agar sekitar 1,5 hingga 1,8%. Konsentrasi agar kurang dari 1% menghasilkan
media semi padat. Media padat memiliki keuntungan bahwa ia menghadirkan permukaan
yang mengeras di mana mikroorganisme dapat tumbuh menggunakan teknik khusus untuk
isolasi koloni yang terpisah. Setiap koloni adalah sekelompok sel yang berasal dari perkalian
sel tunggal dan mewakili pertumbuhan satu spesies mikroorganisme. Koloni yang
didefinisikan dan terisolir dengan baik adalah budaya murni. Selain itu, saat dalam keadaan
cair, media padat dapat ditempatkan di tabung reaksi, yang kemudian dibiarkan dingin dan
mengeras dalam posisi miring, menghasilkan miring agar. Ini berguna untuk
mempertahankan budaya murni. Tabung serupa yang, setelah persiapan, dibiarkan mengeras
dalam posisi tegak disebut tabung dalam agar. Tabung agar dalam digunakan terutama untuk
mempelajari kebutuhan gas dari mikroorganisme. Namun, mereka dapat dicairkan dalam
mendidih.
Menurut Verghese dan P.P (2014) Budaya yang hanya mengandung satu jenis
mikroorganisme disebut budaya murni. Suatu kultur yang mengandung lebih dari satu jenis
mikroorganisme disebut kultur campuran. Sebagian besar budaya yang diperoleh di alam
adalah budaya campuran. Budaya murni sangat penting untuk mempelajari karakter budaya,
morfologi dan fisiologis dari spesies individu. Ada berbagai metode untuk memperoleh
kultur murni dari kultur campuran. Teknik isolasi mikroba memiliki berbagai cara, yaitu
metode spread plate, streak plate, dan pour plate.
Spread plate, menurut Sanders (2014) Teknik ini biasanya digunakan untuk
memisahkan mikroorganisme yang terkandung dalam volume sampel kecil, yang tersebar di
atas permukaan lempeng agar, menghasilkan pembentukan koloni diskrit yang terdistribusi
secara merata di permukaan agar ketika konsentrasi sel yang tepat dilapisi. Selain
menggunakan teknik ini untuk jumlah pelat yang layak, di mana jumlah total unit
pembentuk koloni pada satu piring dihitung dan digunakan untuk menghitung konsentrasi
sel dalam tabung dari mana sampel berlapis, spread-plating secara rutin digunakan dalam
percobaan pengayaan, seleksi, dan penyaringan.
Menurut Sanders (2014) Prosedur streak-plate dirancang untuk mengisolasi kultur
murni bakteri, atau koloni, dari populasi campuran dengan pemisahan mekanis sederhana.
Koloni tunggal terdiri dari jutaan sel yang tumbuh dalam kelompok pada atau di dalam agar-
agar piring. Sebuah koloni, tidak seperti sel tunggal, terlihat dengan mata telanjang. Secara
teori, semua sel dalam sebuah koloni berasal dari bakteri tunggal yang awalnya disimpan di
piring dan dengan demikian disebut sebagai klon, atau sekelompok sel yang identik secara
genetik. Dengan prosedur streak-plate, campuran sel tersebar di atas permukaan media
nutrisi berbasis semi-padat, agar-agar dalam cawan petri sehingga lebih sedikit dan lebih
sedikit sel bakteri yang disimpan pada titik-titik yang terpisah secara luas pada permukaan
media. dan, setelah inkubasi, berkembang menjadi koloni.
Pour Plate, menurut Sanders (2014) Metode ini sering digunakan untuk menghitung
jumlah mikroorganisme dalam sampel campuran, yang ditambahkan ke media agar cair
sebelum pemadatannya. Proses ini menghasilkan koloni-koloni yang terdistribusi secara
merata di seluruh media padat ketika pengenceran sampel yang tepat dilapisi. Teknik ini
digunakan untuk melakukan penghitungan lempeng yang layak, di mana jumlah total unit
pembentuk koloni di dalam agar-agar dan pada permukaan agar-agar pada satu lempeng
dihitung. Hitungan lempeng yang layak memberikan para ilmuwan cara standar untuk
menghasilkan kurva pertumbuhan, untuk menghitung konsentrasi sel dalam tabung dari
mana sampel itu dilapisi, dan untuk menyelidiki efek dari berbagai lingkungan atau kondisi
pertumbuhan pada kelangsungan hidup sel bakteri atau tingkat pertumbuhan.
Menurut Sanders (2014) Hasil yang diinginkan untuk tiga percobaan ini biasanya
sama dengan jumlah lempeng, di mana distribusi koloni diskrit terbentuk di permukaan
agar-agar. Namun, tujuannya bukan untuk memastikan semua sel yang hidup membentuk
koloni. Sebaliknya, hanya sel-sel dalam populasi yang memiliki genotipe tertentu yang akan
tumbuh. Prosedur pelat penyebaran dapat digunakan pada teknik pelat tuang untuk
percobaan enumerasi jika tujuan akhirnya adalah untuk mengisolasi koloni untuk analisis
lebih lanjut karena koloni tumbuh diakses pada permukaan agar-agar sedangkan mereka
menjadi tertanam dalam agar-agar dengan prosedur pelat tuang.
Menurut Cappucicino dan Sherman (2014) Mikroorganisme dipindahkan dari satu
medium ke medium lainnya melalui subkultur. Teknik ini sangat penting dan digunakan
secara rutin dalam mempersiapkan dan memelihara kultur stok, serta dalam prosedur uji
mikrobiologis. Mikroorganisme selalu ada di udara dan di permukaan, bangku, dan
peralatan laboratorium. Mereka dapat berfungsi sebagai sumber kontaminasi eksternal dan
 dengan demikian mengganggu hasil eksperimen kecuali teknik aseptik yang tepat digunakan
selama subkultur.
Menurut Verghese dan P.P (2014) Pada pewarnaan sederhana, apusan bakteri
diwarnai dengan reagen tunggal, yang menghasilkan kontras yang berbeda antara organisme
dan latar belakangnya. Noda sederhana yang menodai bakteri adalah noda langsung. Tujuan
dari teknik pewarnaan sederhana adalah untuk menentukan bentuk sel, pengaturan ukuran
sel bakteri.
Menurut Cappucicino dan Sherman (2014) Apusan hanya membutuhkan sedikit
biakan bakteri. Corengan yang baik adalah yang, ketika dikeringkan, muncul sebagai lapisan
tipis atau film tipis.
C. Skema Kerja
1. Teknik Isolasi Spread Plate
a. Bahan
1) Media NA (dalam cawan petri)
2) Kultur murni bakteri
3) Larutan pengencer (BPW atau NaCl fisiologis 0,9%)
4) Alkohol 70%
5) Tissu
6) Korek api
b. Alat
1) Spreader/batang bengkok/batang Drigalsky
2) Pipet volume
3) Cawan petri
4) Lampu bunsen
c. Skema kerja
Praktikan yang akan melakukan praktikum di sterelisasikan menggunakan
alkohol 70% dengan cara disemprotkan ke jas laboratorium dan tangan. Meja kerja,
alat dan bahan yang akan digunakan pada praktikum teknik isolasi spread plate di
sterelisasikan terlebih dahulu menggunakan alkohol dengan cara disemprotkan dan
kemudian dikeringkan menggunakan tissu, agar tidak ada mikroba yang hidup yang
dapat mengkontaminasi pertumbuhan mikroba. Selenjutnya pengenceran 10-1 - 10-6
dibuat dari kultur murni bakteri dengan larutan pengencer. Tabung reaksi yang
mengandung kultur murni bakteri diambil, dibuka, dan dibakar leher tabungnya. 0,1
ml kultur bakteri secara aseptis dipindahkan ke permukaan media NA didalam
cawan petri. Spreader yang telah di celupkan ke alkohol dibakar diatas bunsen yang
 telah dinyalakan menggunakan korek api dan dibiarkan dingin. Kultur bakteri
disebarkan/ditebarkan dengan spreader secara merata dan dibiarkan sampai
permukaan agar kering. Setelah permukaan agar dikeringkan, diinkubasi secara
terbalik selama 24 jam pada suhu kamar dan diamati pertumbuhannya. Pertumbuhan
dari tiap-tiap pengenceran dibandingkan dan pertumbuhannya dibandingkan dengan
hasil teknik spread plate.
2. Teknik Isolasi Streak Plate
a. Bahan
1) Media NA (dalam cawan petri)
2) Kultur murni bakteri
3) Alkohol 70%
4) Tissu
5) Korek api
b. Alat
1) Jarum ose
2) Lampu Bunsen
3) Cawan petri
c. Skema kerja
Praktikan yang akan melakukan praktikum di sterelisasikan menggunakan
alkohol 70% dengan cara disemprotkan ke jas laboratorium dan tangan. Meja kerja,
alat dan bahan yang akan digunakan pada praktikum teknik isolasi streak plate di
sterelisasikan terlebih dahulu menggunakan alkohol dengan cara disemprotkan dan
kemudian dikeringkan menggunakan tissu, agar tidak ada mikroba yang hidup yang
dapat mengkontaminasi pertumbuhan mikroba. Selanjutnya jarum ose dipanaskan
hingga memijar diatas bunsen yang telah dinyalakan menggunakan korek api,
kemudian dinginkan. Ose yang telah dingin digunakan untuk menggores pada
permukaan media agar didalam cawan petri. 1 ose kultur murni bakteri diambil dan
digoreskan pada permukaan media agar dimulai pada satu ujung. Ose disentuhkan
pada permukaan media agar didalam cawan petri, sewaktu menggores ose dibiarkan
meluncur diatas permukaan agar. Ose dipijarkan terlebih dahulu dan dibiarkan
dingin sebelum ose digoreskan pada kuadran berikutnya. Diinkubasi secara terbalik
pada suhu kamar 24 jam dan diamati pertumbuhannya.
3. Teknik Isolasi Pour Plate
a. Bahan
1) Media NA (dalam tabung reaksi)
 2) Kultur murni bakteri
3) Alkohol 70%
4) Tissu
5) Korek api
b. Alat
1) Cawan petri steril
2) Tabung reaksi
3) Pipet volume
4) Lampu bunsen
c. Skema kerja
Praktikan yang akan melakukan praktikum di sterelisasikan menggunakan
alkohol 70% dengan cara disemprotkan ke jas laboratorium dan tangan. Meja kerja,
alat dan bahan yang akan digunakan pada praktikum teknik isolasi pour plate di
sterelisasikan terlebih dahulu menggunakan alkohol dengan cara disemprotkan dan
kemudian dikeringkan menggunakan tissu, agar tidak ada mikroba yang hidup yang
dapat mengkontaminasi pertumbuhan mikroba. Selanjutnya media NA didalam
tabung reaksi didinginkan sampai suhu ± 45-50oC (ciri: terasa hangat dikulit/tidak
“kemranyas”). Tutup tabung yang berisi kultur bakteri murni dibuka dan dibakar
bagian bagian leher botolnya. 1 ml kultur murni bakteri dipindahkan ke dalam
tabung reaksi yang mengandung NA secara aseptis. Leher tabung dibakar di atas
bunsen yang telah dinyalakan menggunakan korek api, dan media NA yang telah
mengandung kultur murni bakteri dituangkan ke dalam cawan petri.Digoyangkan
perlahan-lahan untuk mencampur kultur bakteri dengan NA sampai homogen.
Penggoyangan petri janga terlalu kuat. Pada saat media dituangkan, petri bisa
diletakkan dalam radius maksimal 20 cm dari sumber api (zona steril). Setelah agar
memadat, diinkubasi terbalik pada suhu kamar selama 24 jam. Dilakukan inkubasi
terbalik setelah agar memadat. Dan diamati pertumbuhannya.
4. Pemindahan Kultur Mikroba
a. Bahan
1) Media NA miring (dalam tabung reaksi)
2) Media NA tegak (dalam tabung reaksi)
3) Media nutrient cair atau NB (dalam tabung reaksi)
4) Kultur murni bakteri
5) Alkohol 70%
6) Tissu
 7) Korek api
b. Alat
1) Jarum ose
2) Jarum inokulasi
3) Lampu Bunsen
4) Tabung reaksi
5) Vortex mixer
c. Skema kerja
Praktikan yang akan melakukan praktikum di sterelisasikan menggunakan
alkohol 70% dengan cara disemprotkan ke jas laboratorium dan tangan. Meja kerja,
alat dan bahan yang akan digunakan pada praktikum pemindahan kultur mikroba di
sterelisasikan terlebih dahulu menggunakan alkohol dengan cara disemprotkan dan
kemudian dikeringkan menggunakan tissu, agar tidak ada mikroba yang hidup yang
dapat mengkontaminasi pertumbuhan mikroba. Selanjutnya media NA dan NB dari
hasil percobaan 1 (media NA miring, media NA tegak dan media NB cair) disiapkan.
Pemindahan kultur mikroba dilakukan satu persatu untuk masing-masing media.
Tutup dilonggarkan dari masing-masing tabung reaksi yang berisi media. Tabung
reaksi yang mengandung kultur murni bakteri di pegang di tangan kiri. Jarum ose di
pegang di tangan kanan dan di bakar di atas nyala lampu bunsen hingga kawat
memijar. Perhatian: pemanasan jarum ose dilakukan dari pangkal ke ujung sampai
memijar, sebelum digunakan kawat didinginkan beberapa saat. Ose di pegang
menggunakan ibu jari dan jari telunjuk, jari kelingking digunakan untuk membuka
semua tabung reaksi. Mulut tabung reaksi dibakar, jarum ose dimasukkan dan 1 ose
biakan bakteri diambil. Mulut tabung reaksi kembali dibakar dan tabung reaksi
ditutup kembali. Tabung reaksi yang akan diinokulasi diambil dengan tangan kiri,
dengan cara yang sama tutup tabung reaksi dibuka dan mulut tabung reaksi dibakar.
Biakan bakteri diinokulasikan pada tabung reaksi inokulasi dengan digoresankan
secara zigzag pada permukaan NA miring. Mulut tabung reaksi dibakar dan tabung
reaksi ditutup kembali, kemudian ose dibakar. Diberi label: tanggal percobaan, nama
bakteri, teknik pemindahan dan nama kelompok. Dengan cara yang sama dilakukan
untuk media nutrient cair/NB menggunakan jarum ose dan jarum inokulasi
digunakan media agar tegak secara tusukan tegak lurus. Dinkubasikan selama 24 jam
pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya.
5. Pembuatan Pulasan Bakteri
a. Bahan
1) Label preparat
2) Aquades steril
3) Kultur murni bakteri
4) Alkohol 70%
5) Tissu
6) Korek api
b. Alat
1) Gelas objek
2) Jarum ose
3) Lampu Bunsen
4) Penjepit gelas objek
c. Skema kerja
Praktikan yang akan melakukan praktikum di sterelisasikan menggunakan
alkohol 70% dengan cara disemprotkan ke jas laboratorium dan tangan. Meja kerja,
alat dan bahan yang akan digunakan pada praktikum pembuatan pulasan bakteri di
sterelisasikan terlebih dahulu menggunakan alkohol dengan cara disemprotkan dan
kemudian dikeringkan menggunakan tissu, agar tidak ada mikroba yang hidup yang
dapat mengkontaminasi pertumbuhan mikroba. Selanjutnya gelas objek yang kering
dan bersih diberi label. Jarum ose disterilkan dengan memijarkannya pada nyala
bunsen dan dinginkan. Jika kultur dalam bentuk cair (suspensi), diambil 1 ose penuh
dan diletakkan di tengah-tengah gelas benda dan diratakan seluas ± 1 cm 2. Jika
kultur dalam medium padat, diambil dengan jarum ose satu bagian kecil kultur dan
diletakkan di tengah gelas benda yang sebelumnya telah diberi aquadest steril dan
diratakan. Dibiarkan kering dengan mengangin-anginkan gelas objek. Pulasan
bakteri difiksasi dengan melewatkan diatas nyala bunsen (hati-hati jangan sampai
gosong), tergantung jenis pengecatannya. Pulasan bakteri siap diwarnai.
D. Hasil Pengamatan
No Hasil Percobaan Keterangan
.
1. Metode streak
Keterangan
1. Media
(percobaan
gagal)
1

2. Mikroba alam
Keterangan :
1 1. Koloni
mikroba dari
gagang pintu 2
2. Koloni
mikroba dari
tempat
sampah 4
3. Koloni
mikroba dari
5
keringat
4. Media
5. Koloni
3
mikroba dari
keringat
3. Metode pour plate
Keterangan:
1. Media yang
bercampur
dengan
koloni bakteri
E.coli
1
4. Spread 10-1
Keterangan:
1. Koloni
bakteri E.coli
2. Media

5. Spread 10-2
Keterangan:
1. Media
2. Koloni 1
bakteri E.coli
6. Spread 10-3
Keterangan:
1. Media
2. Koloni
bakteri E.coli

2
1

2
7. Spread 10-4
Keterangan:
1. Media
1
2. Koloni
bakteri E.coli

8. Spread 10-5
Keterangan:
1. Media
2. Koloni
bakteri E.coli
1

2
9. Spread 10-6
Keterangan:
1. Media
2. Koloni
bakteri
1 E.coli
2

10. NA tegak
Keterangan:
1. Koloni
bakteri E.coli
berbentuk
beaded
1 2. Media
11. NB tidak steril
Keterangan:
1. Koloni
bakteri E.coli
2 2. Media
12. NA miring
Keterangan:
1. Media
(gagal)
13. 1 NB steril
Keterangan:
1. Media
(gagal)
14. Jarum ose yang
dipijarkan/dibakar di
2 atas nyala api
1 bunsen.

1
 15. Isolat diambil secara
perlahan dalam
jumlah sedikit
menggunakan ose
yang telah
dipijarkan/dibakar.
Dan setelah itu
diratakan di atas
gelas objek yang
sebelumnya diberi
aquades.

16. Tahap fiksasi, yang

dilakukan dengan
membakar gelas
objek dilalui diatas
nyala bunsen, harus
berhati-hati jangan
sampai terlalu
kering/gosong pada
isolat.

E. Pembahasan
Dalam praktikum dasar-dasar teknik mikrobiologi ini bertujuan untuk mempelajari
cara pembuatan media dan syarat-syarat yang dibutuhkan oleh suatu media untuk
pertumbuhan mikroba., mempelajari macam-macam teknik sterilisasi, mempelajari cara-cara
pemindahan mikroba secara aseptis, mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman
mikroba, mempelajari teknik pembuatan pulasan bakteri untuk pengecatan/pewarnaan
bakteri, serta mengenal bermacam-macam mikroba alam.
Mikroorganisme hadir pada semua permukaan benda mati yang menciptakan sumber
pencemaran di mana-mana di laboratorium. Keberhasilan eksperimental bergantung pada
kemampuan seorang ilmuwan untuk mensterilkan permukaan dan peralatan kerja serta
mencegah kontak dengan instrumen dan solusi steril dengan permukaan yang tidak steril. Di
sini kami menyajikan langkah-langkah untuk beberapa metode pelapisan yang secara rutin
digunakan di laboratorium untuk mengisolasi, menyebarkan, atau menghitung
mikroorganisme seperti bakteri dan fag. (Sanders, 2012).
 Teknik isolasi mikroba memiliki berbagai cara, yaitu metode spread plate, streak
plate, dan pour plate.
Teknik spread plate merupakan teknik yang biasanya digunakan untuk memisahkan
mikroorganisme yang terkandung dalam volume sampel kecil, yang tersebar di atas
permukaan lempeng agar, menghasilkan pembentukan koloni diskrit yang terdistribusi
secara merata di permukaan agar ketika konsentrasi sel yang tepat dilapisi. Metode ini
dilakukan dengan cara mengencerkan biakan kultur mikroba karena konsentrasi sel-sel
mikroba pada umumnya tidak diketaui, maka pengenceran perlu dilakukan dengan cara
memasukkan sejumlah kultur murni bakteri ke dalam tabung yang berisi BPW. Pengenceran
dilakukan dari 10-1 sampai 10-6. Koloni diharapkan akan tumbuh di permukaan agar dengan
menyerap nutrisi dari medium pertumbuhan di bawahnya. Kelebihan teknik spread plate
adalah didapatkan biakan murni koloni bakteri yang terpisah serta memudahkan untuk
pengamatan morfologi koloni yang jelas. Kelemahan dari metode ini adalah bakteri terlalu
banyak sehingga susah untuk mengidentifikasi bakteri majemuk. Perlakuan metode spread
10-2
plate dengan konsentrasi bakteri pada praktikum didapatkan hasil yaitu pertumbuhan
bakteri yang hampir memenuhi permukaan media agar.
Pengamatan pada media cawan petri dengan metode spread plate, 10-1, 10-2, 10-3, 10-
4
, 10-5, 10-6 semakin banyak pengenceran yang dilakukan, maka semakin sedikit bakteri yang
tumbuh pada media tersebut. Secara teoritis, hasil percobaan yang dilakukan sudah sesuai
karena semakin besar pengenceran, konsentrasi bakteri yang tumbuh dalam media menjadi
semakin sedikit.
Teknik streak plate adalah untuk mengisolasi kultur murni bakteri, atau koloni, dari
populasi campuran dengan pemisahan mekanis sederhana. Keuntungan dari metode ini
adalah lebih mudah didapatkan koloni terpisah sehingga dapat diisolasi lebih lanjut untuk
mendapatkan biakan murni. Dengan prosedur streak-plate, campuran sel tersebar di atas
permukaan media nutrisi berbasis semi-padat, agar-agar dalam cawan petri sehingga lebih
sedikit dan lebih sedikit sel bakteri yang disimpan pada titik-titik yang terpisah secara luas
pada permukaan media. dan, setelah inkubasi, berkembang menjadi koloni. Kelemahannya
adalah dibutuhkan keterampilan untuk mendapatkan hasil baik sehingga koloni terpisah.
Perlakuan metode streak plate pada praktikum didapatkan hasil yaitu tidak ada pertumbuhan
bakteri pada permukaan media agar. Hal ini tejadi karena kesalahan praktikan yang belum
memasukan bakteri ke media di cawan petri.
Teknik pour plate adalah metode yang sering digunakan untuk menghitung jumlah
mikroorganisme dalam sampel campuran, yang ditambahkan ke media agar cair sebelum
pemadatannya. Proses ini menghasilkan koloni-koloni yang terdistribusi secara merata di
seluruh media padat ketika pengenceran sampel yang tepat dilapisi. Teknik ini digunakan
untuk melakukan penghitungan lempeng yang layak, di mana jumlah total unit pembentuk
koloni di dalam agar-agar dan pada permukaan agar-agar pada satu lempeng dihitung.
Perlakuan metode pour plate pada praktikum didapatkan hasil yaitu pertumbuhan bakteri
pada permukaan media agar tumbuh secara merata.
Pada praktikum ini, jenis mikroba yang digunakan adalah Escherichia coli, bakteri
pada tempat sampah, bakteri pada gagang pintu, bakteri pada keringat, bakteri pada kaos
kaki. Escherichia coli termasuk dalam famili Entherobacteriaceae. Bakteri ini merupakan
bakteri gram negatif, berbentu batang pendek atau kokobasil, memiliki flagel berukuran 0,4-
0,7 µm x 1,4 µm dan memiliki simpai. E.coli tumbuh baik di hampir semua media
perbenihan, dapat meragi laktosa dan bersifat mikroaerofilik.
Pemindahan kultur mikroba pada NA miring dilakukan dengan cara goresan zig-zag
dengan jarum ose untuk pembuatan stok bakteri. Media NA dibuat miring agar dapat
memperluas daerah pertumbuhan bakteri sehingga bakteri dapat tumbuh secara maksimal.
Perlakuan ini dilakukan dengan tujuan untuk melihat bentuk koloni bakteri. Percobaan NA
miring yang dilakukan gagal karena pada saat mengaplikasikan jarum ose, media tergores
sehingga hancur dan bakteri susah untuk terlihat. Pada media NA tegak dilakukan dengan
cara tusukan dengan jarum inokulasi untuk melihat bentuk pertumbuhan
mikroba/morfologinya. Pada praktikum yang telah dilakukan, bakteri yang didapat pada NA
tegak berbentuk beaded, yaitu berbentuk seperti rantai-rantai mutiara, butiran sepanjang
bekas inokulasi.
Pada praktikum ini NB menggunakan dua perlakuan yaitu steril dan tidak steril. Pada
NB steril mengalami proses sterilisasi dengan autoklaf sedangkan NB tidak steril, tidak
mengalami proses sterilisasi. Pada percobaan NB jika bakteri yang berkembang berada di
bagian atas, berarti bakteri butuh O2 atau dapat dikatakan bakteri merupakan jenis bakteri
aerob. Apabila bakteri berada di bagian bawah, berarti bakteri tidak membutuhkan O 2 untuk
hidup, sehingga disebut anaerob. Apabila sebagian besar bakteri berada di bagian atas, tetapi
ada sedikit di bagian bawah dan tengah, berarti bakteri tersebut membutuhkan O 2 untuk
respirasi, namun tidak sebanyak aerob sehingga disebut anaerob fakultatif. Pada praktikum
ini, pada media NB tidak steril muncul bakteri pada permukaan atas yang berarti bakteri
berupa bakteri aerob karena memerlukan O2 untuk bertahan hidup. Pada NB steril tidak
ditemukan bakteri yang tumbuh pada media.
Selain pengujian terhadap bakteri E. Coli, pada praktikum ini juga dilakukan
pengujian ada tidaknya mikroba alam pada beberapa benda. Mikroba alam diambil dari
tempat sampah, bakteri pada gagang pintu, bakteri pada keringat, bakteri pada kaos kaki.
 Pada praktikum ini didapatkan hasil yaitu pada media yang ditanami dengan bakteri dari
tempat sampah, gagang pintu, keringat, dan kaos kaki terdapat mikroba yang tumbuh pada
media agar. Pertumbuhan mikroba paling banyak terdapat pada media agar yang ditanami
oleh mikroba yang diambil dari gagang pintu.
Pada praktikum membuat pulasan bakteri, mengambil isolat dengan jarum ose yang
telah dipijarkan di atas bunsen sampai membara dan diratakan pada gelas objeknya untuk
selanjutnya siap untuk diwarnai, namun sebelum itu terlebih dahulu gelas objek ditetesi
aquades tepat ditengah gelas objek dengan ose yang membara juga. Pada saat mengambil
isolat, dilakukan secara perlahan dalam jumlah sedikit. Setelah itu isolat dioleskan pada
yang terambil pada bagian tengah yang sebelumnya ditetesi aquades dan kemudian ratakan
agar dengan menggunakan ose hal ini bertujuan untuk bertujuan menghindari terjadinya
penumpukan isolate. Setelah itu tahap fiksasi yang dilakukan dengan membakar gelas objek
dilalui diatas nyala bunsen, pada saat melakukan hal ini harus berhati-hati jangan sampai
terlalu kering/gosong pada isolat.
F. Kesimpulan
Berdasarkan hasil praktikum pada acara III tentang dasar-dasar teknik mikrobiologi
dapat disimpulkan bahwa teknik-teknik isolasi mikroba yang digunakan adalah spread plate,
streak plate, dan pour plate. Spread plate, yaitu dengan cara tebar/sebar, streak plate, yaitu
dengan cara gores, dan pour plate, yaitu dengan cara tabur.
Pembuatan media dalam praktikum ini yaitu media NA dan NB. NA yaitu media
padat berupa agar yang harus ditambahkan aquadest lalu dipanaskan dan dihomogenkan
menggunakan vortex. NA dan NB disterilisasi di autoklaf. Syarat media yang baik adalah
harus mengandung air, nutrisi berupa karbon, mineral, vitamin, gas serta sumber energi,
sumber nitrogen, tekanan osmose yang isotonic serta suhu dan pH netral yang sesuai.
Pemindahan mikroba harus dilakukan secara aseptis agar mencegah adanya
kontaminasi mikroorganisme yang tidak dikehendaki. Hal ini dilakukan dengan cara
meminimalisir adanya kontaminan dengan mendekatkan media pada lampu bunsen saat
pemindahan bakteri.
Teknik pembuatan pulasan bakteri untuk pengecatan/pewarnaan bakteri dilakukan
dengan meletakkan mikroba di atas gelas benda kemudian dipanaskan di atas lampu bunsen
hingga kering dan tidak boleh sampai gosong, dan mikroba siap untuk dicat/diwarna.
Pada percobaan ini, mikroba alam yang digunakan adalah mikroba yang terdapat
pada gagang pintu, tempat sampah, keringat orang, dan kaos kaki.
G. Daftar Pustaka
 Cappucino J.G. and Sherman, Natalie., 2014, Microbiology a Laboratory Manual, 10th ed.,
Pearson Education, San Fransisco, pp. 1-2, 13,

Tortora, J.G., Funke, B.R. and Case, C.L., 2010, Microbiology and Introduction, 13th ed.,
Pearson Education, San Fransisco, pp. 2-7.

Stewart, J.E., 2012, Growing Unculturable Bacteria. Journal of Bacteriology,

DOI: 10.1128/JB.00345-12.

Sanders E.R., 2012, Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63),
e3064, doi:10.3791/3064.

Varghese, P.P., 2014, Microbiology Laboratory Manual. Pineapple Research Station

(Kerala Agricultural University), Vazhakulam-686 670, Muvattupuzha, Ernakulam,
Kerala.
H. Jawaban Pertanyaan
1. Jelaskan prinsip dasar dan tujuan teknik isolasi mikroba secara streak plate, pour plate
dan spread plate!
1) Streak plate : mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain,
sehingga mempermudah proses isolasi.
2) Pour plate : menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperature 45-
50oC dengan suspensi bahan yang mengandung mikroba, dan menuangkannya ke
dalam cawan petri steril. Sehingga kumpulan sel akan tersebar merata ke seluruh
media, dan dapat meningkatkan jumlah sampel yang dimasukkan dalam luasan
cawan petri.
3) Spread plate : menginokulasi kultur mikroba secara pulasan/sebaran dipermukaan
media agar yang telah memadat. Koloni diharapkan akan tumbuh di permukaan agar
dengan menggunakan nutrisi dari medium pertumbuhan dibawahnya.
2. Apa yang dimaksud dengan kulturm murni/biakan murni?
Kultur murni adalah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu
sel tunggal, artinya mikroba ditumbuh kembangkan dari bakteri yang dihomogenkan
dengan kata lain bakteri diisolasikan agar didapatkan bakteri murni yang dibutuhkan
nantinya dalam kegiatan praktikum. Objek yang harus diperhatikan adalah bakteri
(Surbakti, 2010)
3. Bagaimana teknik penggoresan yang benar pada teknik isolasi secara streak plate agar
supaya didapatkan koloni bakteri terpisah?
 Menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada permukaan medium
agar agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan
tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal darin 1 sel mikroba, sehingga
dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980). Penggoresan sempurna akan
menghasilkan koloni yang terpisah, dan menggunakan lempengan agar yang benar-benar
kering permukaannya untuk bakteri yang memiliki flagella karena koloninya menyebar
apabila lempengan yang digunakan basah. Terdiri dari goresan sinambung, goresan T
dan goresan banyak sektor. Ambil 1 ose kultur murni bakteri dan goresan pada
permukaan media agar, dimulai pada satu ujung. Ose disentuhkan pada media agar
dalam cawan petri, sewaktu menggores ose dibiarkan meluncur di atas permukaan agar.
Setiap kali menggores ose untuk kuadran berikutnya, pijarkan ose terlebih dahulu.
4. Kapan fiksasi dilakukan dalam pengecatan bakter? Apa tujuan dilakukannya fiksasi
dalam tahapan pengecatan bakteri?
Dalam pembuatan pulasan bakteri yang siap diwarnai, perlu dilakukan fiksasi terlebih
dahulu. Tujuannya antara lain:
a) Mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel;
b) Merubah afnitas cat;
c) Mencegah terjadinya otolisis sel;
d) Dapat membunuh mikroba secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan-
prubahan bentuk dan strukturnya.
e) Melekatkan bakteri diatas gelas benda; dan
f) Membuat sel-sel lebih kuat/keras.
I. Lampiran
- Pertanyaan
- Referensi