LAPORAN AKHIR

MODUL 2
DASAR-DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGI

Disusun Oleh:
Nurhasanah Aini (22416248201090)
Ristin Prasmawati (22416248201080)
Shabrina Zahratun Nisa (22416248201098)

FM22D

PROGRAM STUDI
FARMASI FAKULTAS
FARMASI
UNIVERSITAS BUANA PERJUANGAN
KARAWANG 2023
 DASAR-DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGI

A. TUJUAN

1. Mempelajari cara pembuatan media dan syarat-syarat yang dibutuhkan oleh

suatu media untuk pertumbuhan mikroba.
2. Mempelajari macam-macam teknik sterilisasi
3. Mempelajari cara-cara pemindahan mikroba secara aseptis
4. Mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba
5. Mempelajari teknik pembuatan pulasan bakteri untuk pengecatan atau
pewarnaan bakteri
6. Mengenal bermacam-macam mikroba di alam

B. PRINSIP

1. Pada prinsipnya teknik aseptik adalah usaha menghindarkan setiap kontak

antara kultur murni (pure culture), medium steril dan semua wadah steril serta
permukaan meja kerja, dengan mikroorganisme kontaminan/ kompetitor
(mikroorganisme yang tidak diinginkan). Teknik aseptik dibutuhkan misalnya,
pada saat melakukan kultivasi mikroorganisme dan pemindahamn (transfer)
kultur murni dari satu vessel (misalnya tabung reaksi) ke tabung reaksi yamng
lain.
2. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan
mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini
dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel
mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya. Beberapa
cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan
campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah metode
cawan gores dan metode cawan tuang. Yang didasarkan pada prinsip
pengenceran dengan maksud untuk memperoleh spesies individu. Dengan
anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari satu jenis sel yang dapat
diamati
3. Prinsip dasar sterilisasi yaitu memperpanjang umur simpan bahan pangan
dengan cara membunuh mikroorganisme yang ada di dalamnya.
Mikroorganisme yang tumbuh pada produk pangan biasanya dapat mencemari
produk pangan dan membuat makanan lebih cepat basi.
4. Autoklaf adalah salah satu alat untuk sterilisasi. Prinsip autoklaf adalah
memanfaatkan keringanan uap dibandingkan dengan udara, sehingga udara
terletak di bawah uap. Cara kerjanya dimulai dengan memasukan uap melalui
bagian atas autoklaf sehingga udara tertekan ke bawah. Perhitungan waktu
sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf mencapai 121°C.

C. TINJAUAN PUSTAKA

Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari semua makhluk mikroskopik

dalam bentuk sel tunggal, multisel, maupun aselular seperti bakteri, mikrofungi,
kapang, mikroalga, protozoa, dan archaea. Selain itu, virus merupakan makhluk
mikro aseluler sehingga sering dikaji dalam ilmu mikrobiologi meskipun tidak
dapat sepenuhnya dikatakan sebagai makhluk hidup (Fibriana, 2016)

Di Indonesia, kajian mikrobiologi merupakan kajian wajib dalam bentuk

matakuliah bagi mahasiswa prodi biologi, kimia, IPA, farmasi, kedokteran,
lingkungan, dan teknologi pangan. Di sekolah menengah, kajian mikrobiologi
masuk dalam mata pelajaran IPA terpadu dan IPA Biologi. Kajian mikrobiologi
di perguruan tinggi selalu disertai dengan pelaksanaan praktikum untuk
membekali mahasiswa untuk menguasai softskill keterampilan kerja ilmiah.
(Fibriana, 2016)

Bakteri merupakan salah satu mikroorganisme yang memiliki banyak manfaat

bagi kehidupan. Bakteri pertama kali ditemukan pada tahun 1676 oleh Anthonie
van Leeuwenhoek sebagai sumber penyakit bagi makhluk hidup lain (Chung &
Liu, 2017). Bakteri adalah mikroorganisme yang memiliki ukuran berkisar antara
0.5 hingga 3 mikrometer. Ukuran yang sangat kecil dan kemampuan bakteri untuk
berkembang biak dengan cepat sangat mempengaruhi keberadaan bakteri.
Bakteri
berada di berbagai lingkungan bahkan di tangan dan tubuh manusia. Bakteri di
tangan manusia berasal dari tempat dan lingkungan seperti udara dan juga benda-
benda yang di sentuh. Kulit manusia dapat menyediakan nutrisi yang cukup untuk
pertumbuhan mikroba. (Irawati, 2021)

Bakteri berukuran mikroskopik sehingga manusia tidak dapat melihat bakteri

secara langsung, namun bakteri memiliki kemampuan untuk hidup berkoloni
(Engelkirk, Duben- Engelkirk, & Fader, 2020). Koloni ini dapat diamati dan
dilihat tanpa mikroskop oleh manusia. Praktikum isolasi bakteri dilakukan untuk
melihat pertumbuhan koloni bakteri pada medium pertumbuhan bakteri. Medium
pertumbuhan bakteri berfungsi untuk tempat pertumbuhan, isolasi, inokulasi, dan
mengamati bentuk bakteri. Media pertumbuhan harus memenuhi persyaratan
nutrisi yang dibutuhkan oleh suatu mikroorganisme. (Irawati, 2021)

Proses penanaman sel bakteri di laboratorium, perlu diperhatikan nutrisi

dalam media pertumbuhannya, sehingga kebutuhan bakteri akan nutrisi tertentu
terpenuhi, dan sel bakteri dapat tumbuh dengan maksimal. Dalam penyiapan
media pertumbuhan, nutrisi dan faktor-faktor pertumbuhan lainnya harus
diperhatikan dengan baik, sehingga sel bakteri yang dikehendaki keberadaannya,
dapat tumbuh dengan baik di dalam media tersebut. (Bolang, 2015)

Bakteri-bakteri yang ditumbuhkan di laboratorium, jika semua kebutuhan

hidupnya terpenuhi, maka selnya akan mengalami pertumbuhan. Perbanyakan sel
bakteri dapat terjadi, jika proses reproduksi selnya berlangsung dalam suasana
yang optimal. Sel bakteri dikatakan tumbuh, jika terjadi peningkatan jumlah
selnya. Jadi, pertambahan jumlah sel pada sel bakteri, berarti pertumbuhan sel
bakteri telah terjadi. Hal ini juga berarti bahwa jumlah individu sel bakteri
tersebut juga bertambah. (Bolang, 2015)

Pembiakan mikroba secara buatan memerlukan media pertumbuhan untuk

menjadi tempat tumbuh dan penyedia nutrien bagi mikroba. Media pertumbuhan
terdiri dari garam organik, sumber energi (karbon), vitamin dan zat pengatur
tumbuh (ZPT). Pembuatan media ini dapat pula ditambahkan komponen lain
seperti senyawa organik dan senyawa kompleks lainnya. Perlu kita ketahui
pembuatan media didasarkan pada fungsi, komposisi bahan media, dan
konsistensinya sehingga dalam kultur atau media yang dibuat dapat
menumbuhkan mikroba dengan baik dan sesuai dengan baik dan sesuai dengan
yang diharapkan. Media berfungsi untuk tempat tumbuhnya mikroba, isolasi,
memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah
mikroba, dimana dalam proses pembuatannya harus disterilisasi dan menerapkan
metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada media itu sendiri (suardani
dkk, 2014)

Ada cukup banyak jenis bakteri yang ada di alam. Oleh karena itu, diperlukan
proses identifikasi untuk selanjutnya dilakukan klasifikasi bakteri. Proses
identifikasi dilakukan dengan melakukan serangkaian uji terhadap sel bakteri
yang ditumbuhkan di labaratorium. Dengan mengetahui kesamaan dan perbedaan
pada berbagai sel bakteri, dapat dilakukan klasifikasi bakteri untuk
mengelompokkan bakteri ke dalam kelompok atau kelas-kelas sesuai kesamaan
ciri masing-masing sel bakteri. (Bolang, 2015)

Secara teoritis perhitungan jumlah bakteri dapat dilakukan dengan dua cara
yaitu melalui metode tuang dan sebar. Pemeriksaan angka kuman dengan metode
tuang) adalah suatu teknik untuk menumbuhkan mikroorganisme di dalam media
agar dengan cara mencampurkan media yang masih cair dengan stok kultur
bakteri, sehingga sel-sel tersebut tersebar merata dan diam dengan baik di
permukaan agar atau di dalam agar. (Damayanti, 2020)

Dalam metode ini diperlukan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada

medium agar di dalam cawan petri. Setelah diinkubasi akan terbentuk koloni pada
cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung. Metode spread plate (cawan
sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam
media agar dengan cara pat menuangkan stok kultur bakteri di atas media yang
telah padat. (Damayanti, 2020)

Kedua teknik penanaman tersebut memiliki keunggulan dan kekurangan

masing-masing, keunggulan metode tuang adalah dapat digunakan untuk
memperoleh biakan murni, sedangkan pada metode cawan sebar dapat digunakan
untuk memperkirakan jumlah bakteri dalam satua sel. Adapun kekurangan pada
metode cawan tuang adalah hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel
mikroba yang sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin
membentuk satu koloni, mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada
medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menjalar,
memerlukan persiapan dan waktu inkubasi sehingga pertumbuhan koloni dapat
dihitung. Sementara itu pada metode cawan sebar ini cukup sulit terutama saat
meratakan suspensi dengan batang bengkok, untuk menumbuhkan koloni secara
merata, biakan justru terkontaminasi. (Damayanti, 2020)

Selain itu ada penanaman dengan teknik penanaman dengan goresan yang
bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau
meremajakan kultur ke dalam medium baru. Teknik ini dibagi dua yaitu goresan
sinambung dan goresan T. Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk
mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium
baru. (Ramadhani, 2020)

D. SKEMA KERJA

I. Alat dan Bahan

1. Media dan Cara Pembuatan Media

a. Media Nutrien Agar (NA) (Oxoid)

b. Media Nutrien Broth (NB) (Oxoid)
c. Aquades
d. Cawan Petri
e. Tabung Reaksi
f. Batang Pengaduk
g. Pipet Volume
h. Erlenmeyer
i. Penangas/elemen pemanasan

2. Teknik-Teknik Pemindahan Kultur Mikroba

a. Media NA miring dalam tabung reaksi

b. Media NA tegak dalam tabung reaksi
c. Media nutrient cair atau NB dalam tabung reaksi
d. Jarum ose
e. Jarum inokulasi
 f. Kultur murni bakteri
g. Lampu bunsen
h. Vortex mixer

3.Teknik-teknik isolasi atau penanaman mikroba

A. Spread Plate Method

a. Spreader/batang bengkok/batang drigalsky

b. Pipet volume
c. Lampu bunsen
d. Media NA dalam cawan petri
e. Larutan pengencer (BPW atau NaCl fisiologis 0.9%)

B. Pour Plate Method

a. Media NA dalam tabung reaksi

b. Cawan petri steril
c. Kultur murni bakteri
d. Pipet Volume
e. Lampu Bunsen

C. Streak Plate Method

a. Media NA dalam cawan petri

b. Kultur murni bakteri
c. Jarum ose
d. Lampu Bunsen

II. Skema Cara Kerja

1. Media dan Cara Pembuatan Media

Siapkan alat dan bahan yang diperlukan

 Timbang dengan teliti dan cepat, media NA dan NB yang dibuat 50
ml, lalu serbuk media dimasukkan ke erlenmeyer dengan hati-hati

Panaskan dengan elemen pemanas sampai media tercampur homogen

(warna kuning jernih), jangan sampai terbentuk buih sampai meluap

Tuangkan media NA dengan volume tertentu menggunakan pipet

volume sebanyak 5 ml ke dalam tabung reaksi untuk NA miring, 10
ml ke dalam tabung reaksi untuk NA tegak, 15 ml untuk NA dalam
cawan petri (metode isolasi pour plate) sisanya untuk NA dalam
cawan petri untuk pengenalan mikroba di alam lalu tutup tabung
reaksi

Tuangkan NB ke dalam tabung reaksi untuk 6 praktikum dalam 1

golongan dengan masing-masing 8 ml, lalu tutup tabung dengan kapas

Sterilkan semua media dalam tabung reaksi tersebut menggunakan

autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 1 atm 121°C

Setelah diautoklaf media NA 10 ml dalam tabung reaksi diletakkan

tegak lurus pada rak tabung dan biarkan memadat, media NA 5 ml
inkubasikan miring dan biarkan memadat, media sisa NA tuangkan
dalam cawan petri dan biarkan memadat, media NA 15 ml
dibiarkan dalam suhu 45-50°C

Media NB dalam tabung reaksi dibiarkan dingin, dan seluruh media NA

dan NB ini akan digunakan untuk percobaan selanjutnya.
2. Teknik-Teknik Pemindahan Kultur Mikroba
 Siapkan media NA miring, Na tegak dan NB cair hasil percobaan 1
(pemindahan kultur mikroba dilakukan satu persatu untuk masing-
masing media)

Longgarkan tutup dari masing-masing tabung reaksi yang berisi media

Pegang tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri di

tangan kiri

Pegang jarum ose pada tangan kanan da bakar di atas di atas

nyala lampu bunsen hingga kawat memijar

Pegang ose menggunakan ibu jari dan jari telunjuk, gunakan

jari kelingking untuk membuka tutup tabung reaksi

Bakar mulut tabung reaksi, masukkan jarum ose dan ambil 1

ose biakan bakteri, lalu bakar kembali mulut tabung reaksi dan
tutup tabung reaksi kembali

Ambil tabung reaksi yang akan diinokulasikan dengan tangan kiri

(buka tutup tabung reaksi dan bakal mulut tabung)

Inokulasikan biakan bakteri pada tabung reaksi inokulasi dengan

cara goresan zigzag pada permukaan NA miring

Bakar mulut tabung reaksi dan tutup tabung tabung reaksi

Beri label (tanggal percobaan, nama bakteri, teknik pemindahan)

Lakukan cara yang sama untuk nutrient cair (NB) dengan jarum ose
 Inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar dan
amati pertumbuhannya

3. Teknik-Teknik Isolasi atau Penanaman Mikroba

a. Spread Plate Method (Cara Tebar/Sebar)

Buat pengenceran 10-1-10-6 dari kultur murni bakteri dengan larutan

pengencer

Ambil tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri, buka dan
bakar leher tabung

Pindahkan 0,1 ml kultur bakteri secara aseptis ke permukaan media

NA dalam cawan petri

Bakar spreader yang sebelumnya telah dicelupkan alkohol, biarkan

dingin

Sebarkan kultur bakteri dengan spreader secara merata dan biarkan

sampai permukaan agar mengering

Setelah permukaan mengering, inkubasikan secara terbalik selama 24

jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya

gkan pertumbuhan dari tiap-tiap pengenceran dan bandingkan pertumbuhannya dengan hasil teknik spread plate pada percobaan

b. Pour Plate Method (CaraTabur)

 Dinginkan media NA dalam tabung reaksi sampai suhu ±45-50°C

Buka tutup tabung yang mengandung kultur murni bakteri dan bakar
leher botol

Pindahkan 11 ml kultur murni bakteri ke dalam tabung reaksi yang

mengandung NA secara aseptis

Bakar leher tabung di atas bunsen, dan tuangkan media NA yang telah
mengandung kultur murni bakteri ke dalam cawan petri

Goyangkan perlahan untuk mencampur kultur bakteri dengan NA sampai homogen, dan pada penuangan media petri bis
dalam radius maksimal 20 cm dari sumber api

Setelah agar memadat, dinkubasi terbalik pada suhu kamar selama 24 jam dan amati pertum

c. Streak Plate Method (Cara Gores)

Panaskan jarum ose hingga memijar di atas bunsen, lalu dinginkan

Gunakan ose yang telah dingin untuk menggores pada permukaan

media agar dalam cawan petri

Ambil 1 ose kultur murni bakteri dan goreskan pada permukaan media agar dimulai pada s
atas permukan agar
 Setiap menggoreskan ose untuk kuadran berikutnya, pijarkan ose terlebih dahulu dan biark

Inkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam dan amati pertumbuhannya.

E. DATA PENGAMATAN
Dalam pembuatan media untuk pertumbuhan mikroba dengan menggunakan bahan media NA, dengan
menggunakan:
1 cawan = 15 ml
Aquades = 30 ml x 6 = 180 ml
28 gram x
Perhitungan serbuk NA yang dipakai: =
1000 mL 180 mL
28 x 180
x=
1000
5040
=
1000
= 5,04 gram
Keterangan:
28 gram
a. Dalam kemasan media nutrien agar (media NA)
1000 mL
b. 180 mL aquadest diambil dari 5 kelompok yang dilebihkan 1 kelompok menjadi 6 kelompok , masing-
masing kelompok 30 mL aquadest
c. Serbuk NA yang ditimbang dan dipakai dalam praktikum ini 5,04 gram

F.PEMBAHASAN
Praktikum mikrobiologi kali ini mengenai “Pembuatan Media Nutrien Agar (Media
NA)” dan “Sterilisasi Alat-Alat dengan Autoklaf”. NA (nutrient agar ) digunakan sebagai
media pertumbuhan bakteri..Pembuatan medium percobaan ini dengan menggunakan NA
(nutrient agar ),dimana dalam pembuatan NA instant terlebih dahulu dengan cara
menimbangbahan yang sudah tersedia dan diproduksi secara paten kedalam neraca analitik
sesuai dengan jumlah yang diperlukan.
Pembuatan media cair yaitu dengan cara menimbang NA sebanyak 5,04 gram lalu dilarutkan
ke dalam erlenmeyer 250 ml dengan 180 ml aquadest. Larutan NA diaduk dengan batang
pengaduk sampai semua serbuk larut dalam aquadest. Kemudian media dipanaskan di atas
penangas sambil diaduk. Tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini adalah untuk
menghomogenkan NA dengan aquades, dimana dengan pemanasan dapat mempercepat
pelarutan dari NA dan aquades. Setelah dipanaskan beberapa menit larutan berubah warna
dari kuning menjadi kuning jernih hal ini menandakan larutan telah homogen. Setelah itu
media dalam erlenmeyer didiamkan beberapa menit, lalu erlemeyer dibungkus mengunakan
kertas alumunium foil.
Sebelum menggunakan alat dan bahan diperlukan proses sterilisasi. Peralatan seperti cawan
petri, gelas ukur, corong yang telah dibungkus kertas sampul coklat dan media NA tadi yang
telah dibungkus kertas alumunium foil terlebih dahulu disterilisasikan menggunakan
autoklaf. Alat dan media disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 121 °C, tekanan 1
atm selama 15 menit. Autoklaf adalah alat serupa pressure cooker dengan pengatur tekanan
dan klep pengaman. Prinsip autoklaf adalah terjadinya koagulasi yang lebih cepat dalam
keadaan basah dibandingkan keadaan kering. Proses sterilisasi dengan autoklaf dapat
membunuh mikroorganisme dengan cara mendenaturasi atau mengkoagulasi protein pada
enzim dan membran sel mikroorganisme. Proses ini juga dapat membunuh endospora
bakteri.
Setelah proses sterilisasi selesai, kemudian alat dan media NA dikeluarkan dari autoklaf lalu
tuangkan 15 ml media NA yang masih cair ke gelas ukur menggunakan corong gelas, lalu
dipindahkan ke cawan petri yang sudah disterilkan tadi, kemudian cawan ditutup dan media
dibiarkan hingga memadat. Setelah dipastikan padat, media disimpan di dalam freezer.

G. KESIMPULAN
. Peralatan dan bahan dalam praktikum sterilisasi dan pembuatan medium pertumbuhan
bakteri yaitu erlenmeyer 250 ml, gelas ukur 100 ml, penangas, cawan petri, gelas ukur,
aluminium foil,sampul coklat, kertas label, gunting, timbangan analitik. Lalu untuk bahan:
media biakan padat Nutrient Agar. Alat dan bahan tersebut harus disterilisasikan dengan
metode sterilisasi menggunakan autoklaf untuk menghilangkan mikroorganisme pada alat
dan bahan yang akan digunakan dalam praktikum selanjutnya. Media NA dibuat berdasarkan
perhitungan dengan hasil 5.04 gram. Media NA berfungsi sebagai penumbuhan
bakteri/mikroba dalam bentuk padat, media NB berfungsi sebagai penumbuhan
bakteri/mikroba dalam bentuk cair sedangkan media PDAberfungsi untuk menumbuhan
Jamur

DAFTAR PUSTAKA
Boleng, D.T. 2015. Bakteriologi Konsep-Konsep Dasar. Malang: UMM Press.

Chung, K., & Liu, J. 2017. Pioneers in microbiology: the human side of science.
Danvers: World Scientific.

Damayanti, N.W.E.,dkk.. 2020. Perbedaan Jumlah Bakteriuri Pada Wanita Lanjut

Usia Berdasarkan Kultur Mikrobiologi Menggunakan Teknik Cawan Tuang
dan Cawan Sebar. Denpasar: Stikes Wiramedika.

Engelkirk, P. G., Duben-Engelkirk, J., & Fader, R. C. 2020. Burton’s microbiology

for the health sciences, enhanced edition. Texas: Jones & Bartlett Learning.

Fauzi, Hikmah. 2013.Sterilisasi dan Macam-macamnya. Bogor: Lembaga Sumber

Daya Informasi, IPB

Fibriana, F., Amalia, A.V. 2016. Potensi Kitchen Microbiology Untuk Meningkatkan
Keterampilan Teknik Hands-on Dalam Pembelajaran Mikrobiologi.
Semarang: Unnes Science Education Journal 5(2).
 Irawati, W. 2021. Praktikum sederhana di rumah tentang pengaruh penggunaan
Hand Sanitizer terhadap keberadaan koloni bakteri di tangan. Bali: Fakultas
Biologi Undiksha

Permata sari, et al. 2013. Pengenalan Laboratorium IPA-BIOLOGI Sekolah. Bandung:

Refika Aditama

Ramadhani, I., Wahyuni. 2020. Dasar-Dasar Praktikum Mikrobiologi. Banyumas:

CV. Pena Persada

Suhardi, S.H., Koesnandar, D. K. Indriani, H. Arnaldo 2015. Biosafety: Pedoman

Keselamatan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit. PT.
Multazam Mitra Prima

H. LAMPIRAN
I Job Desk

Nurhasanah Aini: Mempersiapkan alat dan membungkus alat menggunakan

kertas sampul coklat untuk di strerilisasikan
Ristin Prasmawati : Mendokumentasikan prosedur kerja selama praktek
Shabrina Zahratun Nisa : Membuat media NA dan mensterilkan media di
autoklaf