PEMBUATAN MEDIA PERTUMBUHAN

MIKROBA DAN STERILISASI

I.

II.

TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mengetahui cara membuat media pertumbuhan mikroorganisme.
2. Mengetahui jenis dan kegunaan media.
3. Mengetahui cara mensterilkan media.
DASAR TEORI
1) Media Pertumbuhan Mikroba
Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu
substrat yang disebut medium. Medium yang digunakan untuk
menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus
sesuai susunanya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang
bersangkutan (Volk, dan Wheeler, 1993).
Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka
medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat, antara lain:
1. Harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh
mikroba,
2. Harus mempunyai tekanan osmosis,
3. Tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan
mikroba yang akan tumbuh,
4. Tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan
mikroba,
5. Harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan, agar
mikroba yang ditumbuhkan dapat tumbuh dengan baik (Sutedjo,
1991).
Mikroorganisme tersebar di alam dengan berbagai macam jenis dan
sifat

fisiologis

yang

beragam,

dimana

mikroorganisme

tersebut

mempunyai kebutuhan akan nutrien yang berbeda-beda pula. Namun

demikian susunan kimia selnya hampir sama atau lebih sama, yaitu terdiri
atas air yang merupakan bagian terbesar, yaitu 80-90%, sedangkan sisanya
berupa komponen lainnya seperti protoplasma, dinding sel, membran

sitoplasma, cadangan makanan (lemak, polisakarida, polifosfat, protein,

dan lain-lain) yang berat keringnya kurang lebih 0-20%.
Mikroorganisme dapat menggunakan makanan dalam bentuk padat
dan dapat pula yang hanya menggunakan bahan-bahan dalam bentuk
cairan atau larutan. Mikroorganisme yang menggunakan makanannya
dalam bentuk padat tergolong tipe holozoik. Mikroorganisme yang dapat
menggunakan makanannya dalam bentuk cairan atau larutan disebut
holofitik. Ada beberapa mikroorganisme yang dapat menggunakan
makanannya dalam bentuk padatan, tetapi makanan tersebut sebelumnya
harus dicerna, di luar sel dengan bantuan enzim ekstraseluler.
Peran utama nutrien adalah sebagai sumber energi, bahan
pembangun sel, dan sebagai aseptor elektron dalam reaksi bioenergetik
(reaksi yang menghasilkan energi). Oleh karenanya bahan makanan yang
diperlukan terdiri dari air, sumber energi, sumber karbon, sumber aseptor
elektron, sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan nitrogen. Selain itu,
secara umum nutrient dalam media pembenihan harus mengandung
seluruh elemen yang penting untuk sintesis biologik oranisme baru.
Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupaa molekul-molekul
kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media
pertumbuhan dapat dilakukan isolasi mikroorgamisme menjadi kultur
murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhanya. Bakteri
memerlukan nutrien atau makanan untuk dapat tumbuh. Nutrient ini
merupakan degradasi dari nutrient dengan molekul kompleks. Nutrien
dalam medium harus memenuhi kebutuhan dasar makhluk hidup yang
meiputi air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh.
Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi juga memerlukan
pH yang tepat kebanyakan bakteri tidak dapat tumbuh pada kondisi yang
terlalu basah kecuali vibrio chlolerae yang dapat hidup pada pH lebih dari
8. Suhu juga merupakan variabel yang perlu dikendalikan. Kelompok
terbesar yaitu mesofil suhu optimum untuk pertumbuhannya 2040C(Volk,1993).

Berdasarkan konsistensi atau kepadatannya, medium dibagi

menjadi tiga jenis, yaitu:
a. Medium cair/broth/liquid medium
Contoh: air pepton, nutrient broth, lactose
b. Medium setengah padat/semi solid medium
Contoh: sim agar, cary, brain agar
c. Medium padat/solid medium
Contoh: endo agar, PDA, nutrient agar
Medium semi solid dan solid menggunakan bahan pemadat (seperti
amilum, selulosa, gelatin, dan agar-agar). Untuk medium padat jumlah

agarnya 1,5% - 1,8%, pada medium semi solid atau setengah padat
menggunakan kadar setengah dari medium padat, dan pada medium
cair tidak digunakan pemadat (Ani, 2000).
2) Sterilisasi
Sterilisasi berarti proses pemusnahan bakteri dengan cara membunuh
mikroorganisme. Dalam kegiatan penelitian mikroba, digunakan alat dan
medium yang steril, maka sterilisasi ini adalah usaha untuk membebaskan
alat atau bahan-bahan dari segala macam kehidupan atau kontaminasi oleh
mikroba.
Menurut (Suriawati, 2005), Sterilisasi yang umum dilakukan dapat
berupa:
a. Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang
pendek yang dapat

dilakukan selama senyawa kimia yang akan

disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau

tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat bejana/ruang
panas (oven dengan temperatur 170OC 180oC dan waktu yang
digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas).
b. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan,
larutan alkohol, larutan formalin).
c. Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang
akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami
perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter,

seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikelpartikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba).
Autoklaf digunakan sebagai alat sterilisasi uap dengan tekanan
tinggi. Penggunaan autoklaf untuk sterilisasi, tutupnya jangan diletakkan
sembarangan dan dibuka-buka karena isi botol atau tempat medium akan
meluap dan hanya boleh dibuka ketika manometer menunjukkan angka 0
serta dilakukan pendinginan sedikit demi sedikit. Medium yang
mengandung vitamin, gelatin atau gula, maka setelah sterilisasi medium
harus segera didinginkan. Cara ini untuk menghindari zat tersebut terurai.
Medium dapat langsung disimpan di lemasi es jika medium sudah dapat
dipastikan steril (Dwidjoseputro, 1994).
3) Inokulasi
Inokulasi bakteri dimaksudkan untuk menumbuhkan, meremajakan
mikroba dan mendapatkan populasi mikroba yang murni. Inokulasi adalah
pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang
baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Media untuk
membiakkan bakteri haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran
terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme.
Pemindahan biakan mikroba yang dibiakkan harus sangat hati-hati dan
mematuhi prosedur laboratorium agar tidak terjadi kontaminasi. Oleh
karena itu, diperlukan teknik-teknik dalam pembiakan mikroorganisme
yang disebut dengan teknik inokulasi biakan. Teknik inokulasi merupakan
suatu pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium
yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Dengan demikian
akan diperoleh biakan mikroorganisme yang dapat digunakan untuk
pembelajaran mikrobiologi. Pada praktikum ini akan dilakukan teknik
inokulasi biakan mikroorganisme pada medium steril untuk mempelajari
mikrobiologi dengan satu kultur murni saja.
Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni
mikroorganisme yaitu :

1.

Metode gores
Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi
dan waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang
diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan
menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di
permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum
pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat
sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi
koloni.
Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk
lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling
praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masingmasing laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuat
goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan.
Ada beberapa teknik menggores yang biasa digunakan :

2.

Metode tebar
Setetes inokulum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien
dalam cawan petridish dan dengan menggunakan batang kaca yang
bengkok dan steril. Inokulasi itu disebarkan dalam medium batang
yang sama dapat digunakan dapat menginokulasikan pinggan
kedua untuk dapat menjamin penyebaran bakteri yang merata
dengan baik. Pada beberapa pinggan akan muncul koloni koloni
yang terpisah-pisah.
Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi
dan waktu, tetapi memerlukan keterampilan-keterampilan yang
diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan
menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di
permukaan media agar nutrien dalam cawan petri dengan jarum
pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat
sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi

koloni. Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan

padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah
yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada
masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk
membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium
pembiakan. Ada beberapa teknik dalam metode goresan, antara
lain:

3.

Metode tuang
Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar
melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme
sehingga pada suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung
(Winarni, 1997).

4.

Metode tusuk

Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau

menusukan ujung jarum ose yang didalamnya terdapat inokolum,
kemudian dimasukkan ke dalam media (Winarni, 1997).
Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan
teknik penanaman bakteri (inokulasi) yaitu :
1. Menyiapkan ruangan
Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus
steril

agar

tidak

terjadi

kesalahan

dalam

pengamatan

atau

percobaaan .dalam labotarium pembuataan serum vaksin dan

sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah kotak kaca
(encast) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan
melalui suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet (Pelczar, 1986).
2. Pemindahan dengan dengan pipet
Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada
penyelidikan untuk diambil 1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air
sebanyak 99 ml murni (Pelczar, 1986).
3. Pemindahan dengan kawat inokulasi
Ujung kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel. Ujungnya
boleh lurus juga boleh berupa kolongan yang diametrnya 1-3mm.
Dalam melakukuan penanaman bakteri kawat ini terlebih dahulu
dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyala api saja
setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala
(Pelczar, 1986).
Untuk mengisolasi suatu spesies dikenal beberapa cara, yaitu :

1. Cara cawan gores

2. cara cawan tuang
3. Cara cawan sebar
(Ani Murniati, 2002).
4) Pengamatan Mikroba
Untuk menentukan jumlah mikroba suatu bahan dapat dilakukan
dengan bermacam-macam cara, tergantung pada bahan dan jenis mikroba
yang ditumbuhkan atau dikembangbiakan. Dalam analisa mikrobiologi,
menghitung jasad renik suatu sediaan harus diperhitungkan sifat-sifat
dari bahan yang akan diperiksa. Terutama: kelarutan, kemungkinan
adanya zat anti mikroba, dan derajat kontaminasi yang diperkirakan.
Pertumbuhan dan perkembangan mikroorganismedalam bahan, akan
menyebabkan perubahan-perubahan tertentu, yaitu perubahan fisik dan
kimiawi, contoh: konsistensi bahan menjadi lunak, timbul gas atau aroma
tertentu

daan

zat

racun

yang

membahayakan.

Pertumbuhan

mikroorganisme yang membentuk koloni dapat dianggap bahwa setiap

koloni yang tumbuh berasal dari satu sel, maka dengan menghitung
jumlah koloni dapat diketahu jumlah penyebaran akteri yang ada pada
bahan.

III.

PROSEDUR KERJA
1) ALAT
a.
b.
c.
d.
e.
f.

Autoklaf
Kompor
Beaker glass 100 mL
Mortar porselen
Tabung reaksi
Bunsen spiritus

g.
h.
i.
j.
k.
l.

Kawat
Kapas
Spatula
Timbangan
Gelas arloji
Pengaduk kaca

2) BAHAN
a.
b.
c.
d.
e.

Air 60 ml
Bubuk agar instan 5 gram
Vitamin B kompleks 0.5 butir
Gula pasir 5 gram
Mikroba Aspergillus sp.
f.
3) GAMBAR ALAT
4)

b. Kompor

a. Autoklaf
5)

6)
c. Beaker glass 150 ml
dan 100 ml
7)

8)
9)
10)

11)
d. Mortar porselen
12)
13)

27)
28)
i. Spatula
29)

14)
15)
e. Tabung reaksi
16)
17)
18)
19)
20)
21)
f.

Bunsen spirtus
22)
23)
24)
25)
g. Kawat
26)

h. Kapas

j. Timbangan
30)

31)
32)
k. Gelas arloji

33)
34)
35)
l. Pengaduk kaca

36)

37)

38)

Gambar 3.1. Alat Prosedur Kerja

39) SKEMA KERJA

40)
41)
42)
60 mL air
43)
5 gram gula pasir
dipanaskan
44)
2,545)
gram bubuk agar
tablet
46) vitamin B
Campuran agar
47)
48)
Tuang dalam tabung reaksi yang sudah disterilkan dalam autoklaf, lalu miringkan
49)
50)
51)
52)
Media agar
53)
54)
Tunggu hingga dingin
55)
56)
Media agar
57)
Aspergillus sp.
Inokulasi gores
58)
Gambar 3.2. Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba dan
Media agar sudah terdapat mikroba
Sterilisasi
59)

Tutup rapat, dibiarkan pada suhu ruang selama 3 hari

Media sudah ditumbuhi mikroba

IV.

HASIL PENGAMATAN
60)

61)

No.
63) 64)

Perlakuan

62)

Sterilisasi alat-alat menggunakan 65)

1.
66)

autoklaf
steril
67)
Panaskan 60 mL air, tambahkan 68)

2.

bubuk agar instan 2.5 gram, 5 gram gula

Pengamatan
Alat-alat sudah
Campuran agar

pasir dan 1/2 butir vitamin B kompleks

69)

70)

Tuang ke dalam tabung reaksi, 71)

3.

miringkan

tabung,

tutup

kapas,

tunggu

menggunakan
72)

dingin
73)
Panaskan ujung kawat

4.
75)

76)

5.

pada

Goreskan

ujung

biakan,

Media

agar

rapat sudah jadi

hingga
74)
kawat 77)

Kawat steril
Media

agar

pindahkan sudah terdapat mikroba

Aspergillus sp. ke dalam media

agar, lakukan dengan cepat dan
tutup rapat-rapat menggunakan
kapas
78) 79)
Diamkan
6.

selama 5 hari

81) 82)
7.

dalam

suhu

ruang 80)
sudah

Media

agar
ditumbuhi

mikroba
Simpan Aspergillus sp. di 83) Aspergillus
sp.

dalam kulkas

tersimpan

dalam kulkas
84)
85)
86)
87)
88)
89)

di

93)

90)
91)
DAFTAR PUSTAKA
92)
Tim Dosen Praktikum Teknologi Bioproses. 2015. Petunjuk Praktikum
Teknologi Bioproses. Semarang: Fakultas Teknik.

94)

Anonim. 2008. Pembuatan Media Agar dan Sterilisasi.

http://makalahdanskripsi. blogspot.com/2008/08/pembuatan-media-agar-dan-

95)

sterilisasi.html. diakses pada tanggal 3 April 2015.

Anonim. 2010. Laporan Mikrobiologi.
http://myaluzz.wordpress.com/2010/02/09 /laporan-mikrobiologi/. Diakses

96)

pada tanggal 10 April 2015.

Anonim. 2010. Sterilisasi dan Pemuatan Mikroba. http://www.scribd.com/doc/
24542047/ Sterilisasi-Dan-Pembuatan-Medium-Mikrobia-Dafi017. Diakses
pada tanggal 11 April 2015.

97)

Anonim. 2009. Laporan Pembuatan Media.

http://pocilgembalasapi.blogspot.com /2009/11/laporan-pembuatan-media.html.
diakses pada tanggal 10 April 2015.

98)

Anonim, 2015. Inokulasi. file://localhost/C:/Users/ACER/Downloads/inokulsi.html diakses

pada tanggal 12 April 2015

99)
100)
101)
102)
103)
104)
105)
106)
107)
108)

LAMPIRAN-LAMPIRAN

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
109)

110)

111)
112)
113)

Medium merupakan suatu bahan yang terdiri atas campuran

nutrisi yang dipakai untuk menumbuhkan mikroorganisme. Medium agar

merupakan salah satu tehnik yang sangat baik untuk memisahkan mikroba
sehingga dapat diketahui masing-masing. Menurut Pelczar (1988) dasar
makanan yang paling baik bagi pemeliharaan dan pembiakan bakteri adalah
medium yang mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayursayuran, sisa makanan atau ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia.
114)

Dalam pembuatan medium harus memenuhi syarat-syarat

berikut :

Medium harus memenuhi semua kebutuhan nutrien yang mudah digunakan

oleh mikroorganisme.

Medium tidak mengandung zat pengahambat pertumbuhan.

Medium harus steril.

Medium harus memiliki tekanan osmose, pH dll.

115)

Mikroorganisme tersebar di alam dengan berbagai macam jenis

dan sifat fisiologis yang beragam, dimana mikroorganisme tersebut

mempunyai kebutuhan akan nutrien yang berbeda-beda pula. Namun
demikian susunan kimia selnya hampir sama atau lebih sama, yaitu terdiri atas
air yang merupakan bagian terbesar, yaitu 80-90%, sedangkan sisanya berupa
komponen lainnya seperti protoplasma, dinding sel, membran sitoplasma,
cadangan makanan (lemak, polisakarida, polifosfat, protein, dan lain-lain)
yang berat keringnya kurang lebih 0-20%.

116)

Mikroorganisme dapat menggunakan makanan dalam bentuk

padat dan dapat pula yang hanya menggunakan bahan-bahan dalam bentuk
cairan atau larutan. Mikroorganisme yang menggunakan makanannya dalam
bentuk padat tergolong tipe holozoik. Mikroorganisme yang dapat
menggunakan makanannya dalam bentuk cairan atau larutan disebut holofitik.
Ada beberapa mikroorganisme yang dapat menggunakan makanannya dalam
bentuk padatan, tetapi makanan tersebut sebelumnya harus dicerna, di luar sel
dengan bantuan enzim ekstraseluler.
117)

Peran utama nutrien adalah sebagai sumber energi, bahan

pembangun sel, dan sebagai aseptor elektron dalam reaksi bioenergetik (reaksi
yang menghasilkan energi). Oleh karenanya bahan makanan yang diperlukan
terdiri dari air, sumber energi, sumber karbon, sumber aseptor elektron,
sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan nitrogen. Selain itu, secara umum
nutrient dalam media pembenihan harus mengandung seluruh elemen yang
penting untuk sintesis biologik oranisme baru.
118)

Tiap sel harus mensintesis sendiri konstituen tubuhnya dari zat-

zat sederhana yang ditemukan dalam lingkungannya. Kebanyakan dari zat-zat

ini berupa makanan dalam bentuk suspensi atau larutan yang ditemukan
dalam air laut, sungai, danau, air selokan (gorong), atau bahan-bahan organik
lain yang mengalami penguraian, dan sebagainya. Sifat kimia dan fisika dari
habitat ini menentukan jenis organisme yang dapat tumbuh atau hidup di
lingkungan itu.
119)

Zat-zat tidak menghasilkan energi pada sel tetapi mutlak

diperlukan untuk pertumbuhan dan untuk menjalankan fungsi sel diberi

bermacam-macam nama seperti nutrilit esensial, faktor tumbuh, atau
mikronutrien.

120)

Ada yang dikenal dengan mikronutrin anorganik. Beberapa

unsur logam berat (Co, Mo, Cu, Zn) sangat dibutuhkam untuk kehidupan sel
meskipun jumlah yang digunakan sangat sedikit. Kadang-kadang jumlah itu
demikian kecilnya sehingga sukar dideteksi, atau bila ditemukan tidak mudah
dapat dipastikan apakah zat itu bersifat fungsional atau hanya kotoran belaka.
Ada pula yang dikenal dengan mikronutrin organik. Contoh yang baik adalah
vitamin. Banyak bakteri yang tidak membutuhkannya, sedangkan ada pula
yang hampir selalu memerlukannya seperti halnya manusia.
121)

Medium adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi

yang dipakai untuk menumbuhkan mikroba. Selain untuk menumbuhkan

mikroba, medium dapat digunakan pula untuk osilasi, memperbnayak,
pengujian sifat-sifat fisiologi, dan perhitungan mikroba.
122)

123)

Sumber: Anonim. 2008. Pembuatan Media Agar dan Sterilisasi.

http://makalahdanskripsi. blogspot.com/2008/08/pembuatan-media-agardan-sterilisasi.html. diakses pada tanggal 3 April 2015.

124)
125)

126)
127)

128)

Sumber : Anonym. 2009. Laporan Pembuatan Media.

http://pocilgembalasapi.blogspot.com /2009/11/laporan-pembuatanmedia.html. diakses pada tanggal 10 April 2015.

129)

130)
131)

132)

Sumber: Anonim. 2010. Sterilisasi dan Pemuatan Mikroba.

http://www.scribd.com/doc/ 24542047/ Sterilisasi-Dan-PembuatanMedium-Mikrobia-Dafi017. Diakses pada tanggal 11 April 2015.

133)

134)

137)

135) BAB II
136) TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme yang ingin kita tumbuhkan, yang pertama

harus dilakukan adalah memahami kebutuhan dasarnya kemudian

memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan. Air
sangat penting bagi organisme bersel tunggal sebagai komponen utama
protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan
medium sebaiknya menggunakan air suling. Air sadah umumnya
mengandung ion kalsium dan magnesium yang tinggi. Pada medium yang
mengandung pepton dan ektrak daging, air dengan kualitas air sadah
sudah dapat menyebabkan terbentuknya endapan fosfat dan magnesium
fosfat (Hadioetomo, 1993).
138)
Alat yang akan digunakan dalam suatu penelitian atau praktikum
harus disterilisasi terlebih dahulu untuk membebaskan semua bahan dan
peralatan tersebut dari semua bentuk kehidupan. Sterilisasi merupakan
suatu proses untuk mematikan semua organisme yang teradapat pada suatu
benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu
penggunaan panas (pemijaran dan udara panas); penyaringan; penggunaan
bahan kimia (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan
glutaraldehida alkalin) (Hadioetomo, 1993).
139)
Memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan
digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di dalamnya harus
memperhatikan berbagi macam ketentuan seperti jika yang ingin kita
membuat medium untuk organisme bersel tunggal, biasanya air sangat
penting sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya
nutrien ke dalam sel. Pembuatan medium agar padat, digunakan agar-agar,
gelatin atau gel silika. Bahan agar yang utama adalah galaktan (komplek
karbohidrat yang diekstrak dari alga genus Gelidium). Agar akan larut atau
cair pada suhu hampir 100oC dan akan cair apabila kurang lebih 43oC

(Hadioetomo, 1993). Menurut Schlegel (1993) agar merupakan media

tumbuh yang ideal yang diperkenalkan melalui metode bacteriaological.
140)
Organisme hidup memerlukan nutrisi untuk pertumbuhannya.
Subtansi kimia organik dan inorganik diperoleh dari lingkungan dalam
berbagai macam bentuk. Nutrien diambil dari likungan kemudian
ditransformasikan melalui membran plasma menuju sel. Di sel beberapa
nutrisi diolah menghasilkan energi yang digunakan dalam proses seluler
(Lim, 1998). Bakteri dalam medium juga memerlukan makanan untuk
pertumbuhannya. Bakteri yang tidak punya akar harus berada pada
permukaan larutan makanan yang cair. Pertumbuhan bakteri berarti
meningkatnya jumlah sel yang konstituen (yang menyusun). Apabila
disusun 10 bakteri dalam 1 ml medium yang cocok dan 24 jam kemudian
ditemukan 10 juta bakteri tiap milimeternya, maka terjadilah pertumbuhan
bakteri. Meningkatnya jumlah bakteri terjadi dengan proses yang disebut
dengan pembelahan biner, dimana setiap bakteri membentuk dinding sel
baru (Volk, 1993).
141)
Pertumbuhan bakteri selain memerlukan nutrisi, juga
memerlukan pH yang tepat. Kebanyakan bakteri tidak dapat tumbuh pada
kondisi yang terlalu basa, kecuali Vibrio cholerae yang dapat hidup pada
pH lebih dari 8. Suhu juga merupakan variabel yang perlu dikendalikan.
Kelompok terbesar yaitu mesofil, suhu optimum untuk pertumbuhannya
20-40oC (Volk, 1993).
142)
PH merupakan faktor yang sangat mempengaruhi suatu
keberhasilan dalam pembuatan medium sehingga kondisi pH yang terlalu
basa atau terlalu asam tidak cocok untuk dijadikan medium mikroba
karena mikroba tidak dapat hidup pada kondisi tersebut. Medium
didiamkan atau disimpan selama 2 x 24 jam untuk menyakinkan bahwa
medium masih steril, karena selain pH sebagai penentu tumbuhnya
mikroba, alat dan medium yang steril juga menentukan (Dwidjoseputro,
1994).

143)
144)

Menurut (Suriawati, 2005), Sterilisasi yang umum dilakukan dapat

berupa:
a.
Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang

pendek yang dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan
tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan
udara panas, dipergunakan alat bejana/ruang panas (oven dengan temperatur
170OC 180oC dan waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk
peralatan gelas).
145)
b. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan,
larutan alkohol, larutan formalin).
146)
c. Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang
akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan,
misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada
saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat
(dalam hal ini adalah mikroba).
147)
Autoklaf digunakan sebagai alat sterilisasi uap dengan tekanan
tinggi. Penggunaan autoklaf untuk sterilisasi, tutupnya jangan diletakkan
sembarangan dan dibuka-buka karena isi botol atau tempat medium akan
meluap dan hanya boleh dibuka ketika manometer menunjukkan angka 0
serta dilakukan pendinginan sedikit demi sedikit. Medium yang
mengandung vitamin, gelatin atau gula, maka setelah sterilisasi medium
harus segera didinginkan. Cara ini untuk menghindari zat tersebut terurai.
Medium dapat langsung disimpan di lemasi es jika medium sudah dapat
dipastikan steril (Dwidjoseputro, 1994).
148)
149) Sumber : Anonim. 2010. Laporan Mikrobiologi.
http://myaluzz.wordpress.com/2010/02/09 /laporan-mikrobiologi/.
Diakses pada tanggal 10 April 2015.
150)

151)

Inokulasi bakteri dimaksudkan untuk menumbuhkan, meremajakan mikroba

dan mendapatkan populasi mikroba yang murni. Inokulasi adalah pekerjaan

memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan
tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Media untuk membiakkan bakteri haruslah
steril sebelum digunakan. Pencemaran terutama berasal dari udara yang
mengandung banyak mikroorganisme. Pemindahan biakan mikroba yang
dibiakkan harus sangat hati-hati dan mematuhi prosedur laboratorium agar
tidak terjadi kontaminasi. Oleh karena itu, diperlukan teknik-teknik dalam
pembiakan mikroorganisme yang disebut dengan teknik inokulasi biakan.
152)

Teknik inokulasi merupakan suatu pekerjaan memindahkan bakteri dari

medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat
tinggi. Dengan demikian akan diperoleh biakan mikroorganisme yang dapat
digunakan untuk pembelajaran mikrobiologi. Pada praktikum ini akan dilakukan
teknik inokulasi biakan mikroorganisme pada medium steril untuk mempelajari
mikrobiologi dengan satu kultur murni saja
153)

Teknik Inokulasi

154)

Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni

mikroorganisme yaitu :
155)

1.

Metode gores

156)

Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan

waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan

latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah.
Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri
dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan
terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni.
157)

Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk

lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam
pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi
tujuannya sama yaiitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada
lempeng medium pembiakan.

158)

2.

Metode tebar

159)

Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam

cawan petridish dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan
steril. Inokulasi itu disebarkan dalam medium batang yang sama dapat
digunakan dapat menginokulasikan pinggan kedua untuk dapat menjamin
penyebaran bakteri yang merata dengan baik. Pada beberapa pinggan akan
muncul koloni koloni yang terpisah-pisah.
160)

3.

161)

Isolasi

Metode tuang
menggunakan

media

cair

dengan

cara

pengenceran.

Dasar

melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga

pada suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung (Winarni, 1997).
162)

4.

Metode tusuk

163)

Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung

jarum ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam

media (Winarni, 1997).
164)

Macam-Macam Media

165)

Ada beberapa macam media yang digunakan untuk inokulasi yaitu :

166)

1.

Mixed culture : berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme.

167)

2.

Plate culture: media padat dalam petridish.

168)

3.

Slant culture : media padat dalam tabung reaksi.

169)

4.

Stap culture : media padat dalam tabung reaksi, tetapi

penanamannya dengan cara penusukan.

170)

5.

171)

6.

Liquid culture : media cair dalam tabung reaksi.

penanamannya dikocok.
172)

Shake culture: media cair dalam tabung reaksi yang

173)
174)
175)
176)

populasi mikroba di alam sekitar kita besar lagi kompleks. beratus-ratus

spesies pelbagai mikroba biasanya menghuni bermacam-macam bagian tubuh

kita, termasuk mulut, saluran pencernaan, dan kulit. mereka terdapat dalam
jumlah yang luar biasa besarnya. sebagai contoh, sekali bersin dapat
menyebarkan beribu-ribu mikroorganisme.
177)

Alam

sekitar

kita,

udara,

tanah,

dan

air

juga

dihuni

kumpulan

mikroorganisme. Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam

berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisah-misahkan populasi
campuran yang rumit ini, atau biakan campuran menjadi spesies-spesies yang
berbeda-beda sebagai biakan murni. Biakan murni terdiri dari suatu populasi
sel yang semuanya berasal dari satu sel induk.(1;85)
178)
179)

file://localhost/C:/Users/ACER/Downloads/inokulsi.html

180)

diakses pada 12 Mei 2015 pukul 10.00

181)

182)
183)