I.

Tujuan
Setelah melakukan praktikum, mahasiswa diharapkan :
1. Mampu melakukan berbagai teknik mikrobiologi dalam skrining
(menanam, mengisolasi dan memurnikan biakan, melakukan tes terhadap
kemampuan biakan menghasilkan antibiotik)
2. Mendapatkan mikroorganisme yang menghasilkan antibiotik dari jaringan
tanaman.
3. Mendapatkan mikroorganisme yang menghasilkan antibiotik dari tanah
4. Melakukan fermentasi fungi untuk menghasilkan antibiotik.
5. Menentukan profil pertumbuhan dan waktu panen antibiotik berdasarkan
profil pembentukan antibiotiknya.

II.

Landasan teori
Mikroorganisme adalah sumber enzim yang paling banyak digunakan

dibandingkan dengan tanaman dan hewan. Sebagai sumber enzim, mikroorganisme

lebih menguntungkan karena pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh pada substrat
yang murah, lebih mudah ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan kondisi
pertumbuhan dan rekayasa genetik, serta mampu menghasilkan enzim yang ekstrim
(Buckle, 2003).
Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara, suubstrat
yang berupa bahan pangan, tanaman dan hewan. Jenis mikroorganismenya dapat
berupa bakteri, khamir, kapng dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang ada di
linkungan ini sangatlah beraneka ragam sehinga dalam mengisolasi diperlukan
beberapa tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh koloni yang tunggal. Koloni
yang tunggal ini kemudian yang akan diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian
misalnya untuk menngisolasi DNA mikroba yang dapat mendeteksi mikroba yang
telah resisten terhadap suatu antibiotik. Atau untuk mengetahui mikroba yang
dipakai untuk bioremediasi holokarbon (Ferdiaz, 1992).
Isolasi mikroba berarti memisahkan satu jenis mikroba dari biakkan
campuran menjadi biakan murni. (populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel
individu). Mikroorganisme dibiakkan dilaboratorium pada bahan nutrien yang
disebut medium. Banyak sekali medium yang tersedia, macamnya yang dipakai

bergantung pada beberapa faktor salah satu diantaranya ialah macam organisme
yang akan ditumbuhkan (Schegel, 1994).
Ada beberapa metode dalam mengisolasi bakteri, fungi dan khamir
(miroorganisme) yaitu dengan menggunakan metode gores, metode tuang, metode
sebara, metode pengenceran serta micromanipulator. Dua diantaranya yang paling
sering digunakan adalah teknik cawan dan cawan gores. Kedua metode ini
berdasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan mikroorganisme
sedemikian rupa sehingga tiap individu spesies dapat dipisahkan dengan lainnya
(Hadioetomo, 1993).
Metode piringan tuangan (pour-plate metod) pertama kali mengadakan
piaraan biasanya diperoleh dari piaraan campuran, piaraan pertama disebut primary
culture dan sifatnya murni. Piaraan semacam ini dapat disimpan tetapi harus
diadakan peremajaan dengan memindahkannya ke medium baru yang disebut
piaraan turunan (Sub-culture) yaitu piaraan yang diperoleh dari piaraan pertama.
Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage ialah harus adanya kondisi
optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sebelum diinokulasi tangan dan
tempat kerja disemprot dengan alkohol dengan menggunakan metode aseptik,
jarum inokulasi disterilkan dengan membakarnya, dengan api sampai jarum
tersebut pijar (Irianto, 2006).
Kulturisasi bakteri untuk keperluan yang bermanfaat, pada umumnya
dilakukan dengan biakan murni. Biakan murni hanya mengandung satu jenis. Untuk
mengisolasi bakteri dalam biakan murni, umumnya digunakan dua prosedur yaitu:
metode agar cawan dengan goresan dan metode agar tuang. Sebelum bakteri
diinokulasi, tangan dan tempat kerja disemprot dengan alkohol dengan
menggunakan metode aseptik, jarum inokulasi disterilkan dengan membakarnya,
dengan api sampai jarum tersebut pijar (Volk, 1993).
Medium pertumbuhan mikroba adalah suatu bahan yang terdiri dari
campuran nutrient yang diperlukan mikroba untuk pertumbuhannya. Dengan
menggunakan medium pertumbuhan, aktivitas mikroba dapat dipelajari dandengan
medium tumbuh dapat dilakukan isolasi mikroba menjadi kultur murni,
perbanyakan, pengujian sifat fisiologis, dan perhitungan jumlah mikroba (Pelczar,
1986).

III.

ALAT DAN BAHAN

Tahap I
1. Petri (2)
2. Scalpel dan pinset
3. Erlenmeyer
4. Media PDA dan antibiotic kloramfenikol
5. Aquadest
6. Natrium hipoklorid 5%
7. Etanol 70%
8. Bunsen
9. Tabung reaksi
10. Mikropipet dan yellow tip
11. Larutan saline
12. Spreader glass
13. Sampel tanah dan tanaman
Tahap II
1. Petri
2. Ose bulat
3. Bunsen
4. Media PDA
Tahap III
1. Petri
2. Sumuran
3. Bunsen
4. Media NA dan NB
5. Kultur Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
Tahap IV
1. Erlenmeyer
2. Blue tip, Yellow tip
3. Conical tube
4. Sentrifuge
5. Kertas saring

6. Petri dish
7. Fungi terpilih
8. Media PDB dan NA
9. Kultur Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

IV.

CARA KERJA

Tahap I
A. Jaringan Tanaman
1. Bersihkan bagian tanaman yang akan digunakan dengan air mengalir
2. Potong kecil-kecil menjadi diameter 3 cm, masukkan erlemeyer steril
3. Sterilisasi dengan etanl 70% selama 2 menit kemudian dibilas sekali dengan
4. aquadest
5. Sterilkan dengan Natrium hipoklorid selama 2 menit kemudian dibilas tiga
kali
6. dengan aquadest, tiriskan dalam petri dish yang berisi kertas saring
7. Untuk batang kupas dan hilangkan bagian kulitnya, untuk daun potong
menjadi
8. ukuran 1x1 cm, untuk akar langsung dipotong menjadi 1 1,5 cm.
9. Tanam bagian tanaman tersebut ke dalam petri yang berisi media PDA padat
10. Inkubasi suhu ruangan hingga praktikum selanjutnya
B. Tanah
1. Suspensikan 1 gram sampel tanah dengan 10 ml larutan saline dalam tabung
steril
2. Encerkan hingga konsentrasi 10-2
3. Tuang 0,5 ml suspensi tersebut dalam petri steril yang telah dituangi media
PDA dengan penambahan antibiotik kloramfenikol 100 mg/L. Ratakan
dengan menggunakan spreader glass.
4. Inkubasi pada suhu kamar sampai praktikum selanjutnya
Tahap II
1. Ambil koloni dengan ose dan dipindahkan ke media PDA yang baru
2. Inkubasi pada suhu ruang sampai praktikum selanjutnya
Tahap III

1. Inokulum bakteri uji dipindahkan menggunakan ose ke dalam 1 ml media

NB steril di tabung reaksi secara aseptis, kemudian diinkubasi pada suhu
37C selama 18-24 jam. Setelah itu, kultur bakteri uji disesuaikan dengan
standar McFarland 0,5.
2. Sebanyak 0,1 ml kultur bakteri dicampur dengan 10 ml NA steril dan
dituang ke dalam petri dish. Ditunggu hingga memadat.
3. Buat plug pada media NA diatas
4. Buat plug pada media PDA fungi dan tempatkan pada plug media NA
5. Inkubasi pada suhu 37C semalam. Amati daya hambat sampai 3 hari.
Tahap IV
1. Pembuatan inokulum
Ambil 2 plug fungi terpilih, masukkan ke dalam 60 mL media PDB steril.
Lakukan fermentasi selam 14 sambil di shaker.
2. Fermentasi dan sampling
a. Siapkan Erlenmeyer 100 mL sebanyak 7 buah. Beri tanda label : 2,
4, 6, 8, 10, 12, 14 hari fermentasi
b. Ke dalam masing-masing Erlenmeyer tersebut, masukkan 50 mL
media PDB steril, kemudian inokulasikan 2 plug fungi terpilih (atau
inokulum cair pada poin 1 sebanyak 2 mL) secara aseptis.
c. Taruh di alat shaker dan lakukan fermentasi selama 14 hari tersebut
pada suhu kamar.
d. Sampling dilakukan setiap 2 hari dengan cara : gojok kultur sampai
e. homogen, kemudian saring miselia jamur yang diperoleh dengan
kertas saring yang sudah ditara. Filtrat dimasukkan ke dalam conical
tube steril dan bekukan dalam freezer. Lakukan sampai Erlenmeyer
hari ke-14.
3. Pengukuran bobot kering sel
a. Misel yang sudah disaring dengan kertas saring yang sudah ditara,
begitu didapat segera dikeringkan dalam oven suhu 60C sampai
diperoleh bobot konstan.
b. Buat kurva hubungan antara waktu fermentasi vs bobot kering sel.
4. Ekstraksi

a. Hasil fermentasi selesai, filtrat yang dibekukan dicairkan dengan

cara direndam dalam air hangat suhu 40C sampai benar-benar
mencair sempurna.
b. Masukkan ke dalam corong pisah, ekstraksi dengan etil asetat
sebanyak 3 kali, masing-masing dengan 20 mL.
c. Kumpulkan sari etil asetatnya, dan uapkan hingga diperoleh ekstrak
yang kering.
5. Pengukuran zona hambat bakteri
a. Timbang ekstrak kering etil asetat sebanyak 15 mg. Masukkan ke
dalam eppendrorf. Ekstrak tidak boleh menempel di dinding
eppendorf, tetapi harus berada di dasar eppendorf. Gunakan bantuan
spatula untuk pemindahan ekstraknya.
b. Tambahkan 15 L DMSO, homogenkan dengan cara disentil dengan
jari kira-kira selama 2 menit, kemudian tambah dengan 285 L
akuades steril. Vorteks selama 1 menit.
c. Panaskan media NA sampai mencair. Setelah suhunya mencapai
40C, tambah dengan bakteri (E. coli atau S. aureus) dengan
perbandingan 1 mL kultur bakteri untuk tiap 50 mL media NA.
Gojok homogeny dan tuang sebanyak 10 mL ke dalam petri steril.
Biarkan media NA memadat.
d. Bagilah petri menjadi 8 area. Kedelapan area ini adalah untuk
penempatan paper disk sampel sebanyak 7 dan kontrol pelarut
sebanyak 1 buah.
e. Uji antibakteri yang dikerjakan adalah dengan metode disc diffusion.
Ke dalam paper disc steril, teteskan 10 L larutan uji (yang dibuat
pada poin 5b), dan tempelkan di permukaan media NA.
f. Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam.
g. Amati zona jernih yang terbentuk. Ukur diameternya.
h. Buat kurva hubungan antara waktu fermentasi vs diameter zona
hambat yang terbentuk.
6. Analisa golongan senyawa

a. Siapkan plat KLT setinggi 10 cm. Totolkan ketujuh hasil ekstraksi

media fermentasi yang diperoleh (yang dibuat pada poin 5b)
sebanyak 10 L. Elusi dengan sistem fase gerak yang sesuai
b. Amati bercak pada sinar tampak, sinar UV 254, dan 366 nm.
Kemudian semprot dengan anisaldehid-asam sulfat, segera
panaskan dalam oven suhu 105C selama 3 menit. Segera amati
warna bercak yang terbentuk.
c. Dokumentasikan pola-pola dan warna bercak hasil KLT-nya.
V.

Data pengamatan
Kelompok= 4
Sampel= tanah di dekat pembuangan limbah kimia
Table pengamatan
Hari
ke

bakteri

Foto

pengamatan
Terlihat adanya sedikit
zona bening atau zona
bening mulai terbentuk

E. coli

Terlihat adanya sedikit

zona bening atau zona
bening mulai terbentuk
S.Aureus

Zona bening yang

terbentuk mulai meluas
E. coli

2
Zona bening yang
terbentuk mulai meluas
S.Aureus

Zona bening yang

terbentuk seluas 2,125 cm
E. coli

3
Zona bening yang
terbentuk seluas 0,8 cm
S.Aureus

Perbandingan dengan kelompok lain

klp

sampel

Daun sirih

bakteri
e.coli
S. aureus

Tanah limbah

e.coli

kimia

S. aureus

diamete diamete diamete

diame

Rata-

r (cm)

r(cm)

r (cm)

r(cm)

rata(cm)

1,4

1,2

1,9

1,3

1,45

Tidak terdapat zona bening

0,4

0,2

0,1

Tidak terdapat zona bening

0,2

0,225
-

Tanah limbah

e.coli

kimia

S. aureus

Tanah

e.coli

2,4

1,9

2,2

2,125

10

VI.

0,3

0,2

0,1

S. aureus

0,8

0,7

0,9

0,8

0,8

Tanah limbah

e.coli

0,9

1,1

0,6

0,9

0,875

kimia

S. aureus

0,6

0,3

0,2

0,2

0,325

Tanah

e.coli

1,1

1,4

0,9

1,3

1,175

makam

S. aureus

Tanah

e.coli

makam

S. aureus

Tanah

e.coli

makam

S. aureus

Tanah

e. coli

makam

S. aureus

Tanah

e.coli

makam

S. Aureus

Tidak terdapat zona bening

0,175
-

limbah
kimia

0,1

Tidak terdapat zona bening

0,4

0,6

0,9

0,1

Tidak terdapat zona bening

Tidak terdapat zona bening

Tidak terdapat zona bening

0,5

0,4

0,2

0,5

0,3

Tidak terdapat zona bening

Pembahasan
Pada praktikum kali ini akan melakukan isolasi jamur baik dari
tanah maupun tumbuhan dan kelompok kami memilih untuk menggunakan
tanah. Isolasi ini bertujuan agar dapat dengan mudah untuk melakukan
identifikasi dan mengetahui spesies jamur yang menghasilkan antibiotik.
Sampel tanah yang digunakan adalah tanah yang diambil dari belakang
laboratorium kimia yang dicurigai telah terkontaminasi oleh bahan-bahan
kimia. Dalam pengambilan sampel sebaiknya mengambil tanah yang kering
untuk meminimalisir kandungan air. Semakin banyak kandungan air pada
tanah maka penimbangan tanah juga semakin tidak akurat sehingga sampel
tanah perlu dioven terlebih dahulu.
Isolasi tanah dilakukan dengan melakukan pengenceran pada tanah
hingga tingkat pengenceran 10-2. Langkah yang harus dilakukan yaitu
dengan menimbang terlebih dahulu sampel tanah sebanyak 1 gram.

0,35
-

Kemudian memasukkan tanah ke dalam labu takar ukuran 10 ml dan

menambah aquades hingga tanda batas serta mengocoknya hingga
homogen. Mengambil larutan sebanyak 1 ml dan melakukan pengenceran
hingga 10-2. Memasukkan sebanyak 0,5 ml suspensi tanah pada tingkat
pengenceran 10-2 dengan teknik pour plate pada cawan petri yang telah
terdapat Media PDA (Potato Dextrose Agar) padat. Media PDA dan alatalat harus disterilisasi terlebih dahulu dengan autoklaf untuk meminimalisir
terjadinya kontaminan. Penggunaan media PDA dengan tujuan agar
mikroorganisme yang tumbuh pada media hanya jamur. Selain
menggunakan media pertumbuhan jamur, untuk lebih meminimalisir
terjadinya kontaminasi dari bakteri ditambahkan antibiotik sulphametazole
dalam media PDA karena antibiotik suphametazole bersifat menghambat
pertumbuhan bakteri. Setelah itu, membungkus dengan koran dan
diinkubasi selama 3 hari dengan suhu 37oC. Perlakuan inkubasi selama 3
hari dikarenakan jamur memiliki waktu tumbuh yang lebih lama daripada
bakteri yaitu berkisar antara 3-5 hari.
Pengamatan dilakukan pada hari ke-3 dan didapatkan jamur dengan
warna yang beragam. Ada yang berwarna putih dan hijau. Pengamatan kali
ini tidak menghitung jumlah koloni jamur tetapi hanya melihat berapa jenis
jamur yang terdapat pada sampel tanah. Setelah itu, jamur putih dan hijau
diisolasi kembali pada media PDA yang baru sehingga akan terdapat 2
cawan petri yang masing-masing akan ditumbuhkan jamur dengan warna
yang berbeda-beda. Isolasi jamur dilakukan dengan hanya mengambil
sedikit spora dengan jarum ose steril dan mengetukkan pada media PDA
baru. Isolasi jamur harus dilakukan secara aseptis untuk meminimalisir
terjadinya kontaminan bakteri. Setelah itu, dibungkus dengan koran dan
diinkubasi dengan suhu kamar selama 3 hari.
Pengamatan dilakukan kembali pada hari ke-3 setelah praktikum keII dan didapatkan hasil yaitu pada setiap cawan petri terdapat 1 koloni jamur
dengan hifa warna putih. Warna jamur atau warna spora pada cawan petri
mengikuti warna spora yang diketukkan pada setiap cawan petri. Apabila

hasil yang didapat sesuai dengan yang diinginkan, maka dilanjutkan pada
tahap ke-III.
Tahap ke-III bertujuan untuk mengamati daya hambat jamur pada
sampel tanah. Dalam pengamatan daya hambat, diperlukan inokulum
bakteri uji. Jenis bakteri yang digunakan yaitu Eschericia Coli dan
Staphylococcus Aureus. Pengunaan bakteri tersebut dikarenakan memiliki
sifat yang bertolak belakang yaitu bakteri E.Coli yang bersifat gram negatif
sedangkan bakteri S.Aureus yang bersifat bakteri gram positif. Inokulum
bakteri dibuat dengan membuat suspensi bakteri dan kekeruhan suspensi
disesuaikan dengan larutan Mc.Farland 0,5. Larutan Mc.Farland dapat
dibuat dengan mencampurkan larutan asam sulfat dan barium klorida.
Setelah membuat suspensi bakteri, selanjutnya yaitu memindahkan 0,1 ml
suspensi bakteri E.Coli pada cawan petri I yang telah dibagi menjadi 5
bagian. Kemudian menambahkan media NA dan menunggu hingga padat.
Begitu juga dengan pemindahan suspensi bakteri S.Aureus yaitu dengan
memindahkan 0,1 ml suspensi bakteri S.Aureus pada cawan petri II yang
telah dibagi menjadi 5 bagian. Kemudian menambahkan media NA dan
menunggu hingga padat.
Selanjutnya yaitu membuat plug pada media NA cawan petri I yang
telah memadat dan membuang plug media NA. Hasil koloni jamur pada
tahap ke-2 juga dibuat plug pada media PDA yang ditumbuhi koloni jamur.
Setelah itu menempatkan plug PDA pada plug media NA pada daerah.
Perlakuan yang sama juga pada media NA cawan petri II yaitu membuat
plug pada media NA cawan petri II yang telah memadat dan membuang
plug media NA. Hasil koloni jamur pada tahap ke-2 juga dibuat plug pada
media PDA yang ditumbuhi koloni jamur. Setelah itu menempatkan plug
PDA pada plug media NA pada daerah. Penempatan plug PDA disesuaikan
dengan nama kelompok sehingga daerah 1 untuk plug PDA dari kelompok
1 dan seterusnya. Selanjutnya dilakukan pengamatan selama 3 hari berturutturut. Hasil yang didapat yaitu pada daerah kelompok 4, setiap harinya zona
bening yang terbentuk semakin luas. Pada awalnya memang hanya sebatas
garis plug, namun pada hari ke 3 sudah terbentuk zona bening pada cawan

yag berisi bakteri Eschericia Coli seluas 2,125 cm dan pada cawan yang
berisi bakteri Staphylococcus Aureus seluas 0,8 cm. Dari luas zona bening
yang didapat dapat ditarik kesimpulan bahwa antibiotic yang dihasilkan
jamur yang kami isolasi lebih efektif untuk menghambat bakteri gram
negative daripada gram positif. Namun terdapat kekurangan dalam
praktikum ini karna tidak ada perlakuan lebih lanjut terhadap jamur yang
telah diisolasi sehingga kami tidak mengetahui jenis jamur yang telah
ditumbuhkan. Terdapat juga keanehan terhadap praktikum kali ini karna ada
beberapa sampel yang diambil dari tempat yang sama, namun hasil yang
ditunjukkan berbeda, seperti pada kelompok 8 dan kelompok 9, meski
sama-sama menggunakan sampel dari tanah makam namun jamur yang
diisolasi oleh kedua kelompok tersebut tidak dapat menghasilkan zona
bening yang digunakan sebagai parameter kemampuan daya hambat atau
antibiotik yang dihasilkan oleh jamur. Hal ini dapat dikarenakan perbedaan
dalam proses, baik dalam hal keseterilan maupun tanah yang digunaka bias
saja tanah yang masih basah dan tidak melalui proses pengeringan terlebih
dahulu. Namun rata-rata percobaan dari setiap kelompok menunjukkan
bahwa jamur yang dihasilkan dapat menghambat pertumbuhan bakteri
Eschericia Coli kecuali kelompok 8 dan 9, dan hanya beberapa kelompok
saja yang dapat meghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus Aureus.

VII.

Kesimpulan
1. Dari data pengamatan didapatkan hasil bahwa antibiotic yang

dihasilkan jamur yang kami isolasi lebih efektif untuk menghambat

bakteri gram negative daripada gram positif
2. Dari hasil percobaan yag telah dilakukan diketahui bahwa luas zona
bening pada inoculum bakteri Eschericia Coli 2,125 cm adalah dan
pada bakteri Staphylococcus Aureus adalah 0,8 cm.
3. Tidak diketahui jenis jamur penghasil antibiotic pada percobaan kali ini
karna tidak ada perlakuan lebih lanjut terhadap jamur yang telah
diisolasi.
VIII.

Saran

1. Saat melakukan praktikum harus benar-benar dengan steril

2. Saat melakukan isolasi, hendaknya tidak hanya satu jenis
mikroorganisme yang diisolasi, namun semua jenis yang ada pada
cawan petri sehingga dapat dibandingkan antara mikroorganisme
yang menghasilkan antibiotik
IX.

Daftar pustaka
Schegel, H., 1994. Mikrobiologi Umum. UGM-Press : Yogyakarta.
Buckle, K.A. 1987. Ilmu Pangan. Universitas Indonesia : Jakarta.
Fardiaz, S. 1992.Mikrobiologi Pangan I . PT Gramedia Pustaka
Utama : Jakarta.
Hadioetomo,R.S.1993 .Mikrobiologi Dasar dalam Praktek : Teknik dan
Prosedur Dasar dalam Praktek. PT Gramedia Pustaka Utama :
Jakarta.
Irianto, K. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. CV.
Yrama Widya : Bandung.
Pelczar,M.J dan E.C.S Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Universitas
Indonesia Press : Jakarta.
Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Erlangga :Jakarta.

X.

Lampiran