LAPORAN PRAKTIKUM

FISIOLOGI TUMBUHAN

PRAKTIKUM IV

PEMISAHAN PIGMEN-PIGMEN DAUN

NAMA : NADHILA IDRIS

NIM : H041171518

KELOMPOK : III (TIGA)

HARI/TANGGAL : RABU/ 24 OKTOBER 2018

ASISTEN : MUHAMMAD ICHSAN

LABORATORIUM BOTANI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2018
 BAB I

PENDAHULUAN

I. 1 Latar Belakang

Kromatografi adalah metode yang digunakan untuk memisahkan campuran

senyawa kedalam komponen-komponennya. Semua bentuk kromatografi

memiliki prinsip kerja yang sama, yaitu fase diam dan fase gerak. Semua tipe

kromatografi terdiri atas fase diam (berupa padat atau cair yang diletakkan

pada benda padat), dan fase gerak (cair atau gas). Fase gerak mengalir melalui

fase diam dan membawa komponen-komponen pada campuran (Aulia, 2015).

Kromatografi kertas termasuk dalam kelompok kromatografi planar, yang

pemisahannya menggunakan medium pemisah dalam bentuk bidang (umumnya

bidang datar) yaitu bentuk kertas. Pada kromatografi kertas, kertas saring

paling banyak digunakan, sedangkan kertas minyak tidak dapat digunakan

sebagai fase diam. Fase cair yang digunakan adalah solvent tertentu yang sesuai

dengan komponen yang akan dipisahkan. Pada kromatografi kertas, solut dalam

analit akan terelusi atas dasar konsep partisi, dimana solut akan terdistribusi

diantara fase gerak dan fase diam sesuai dengan kelarutan relatif diantara

keduanya (Alen dkk., 2017).

Berdasarkan penjelasan di atas maka dilakukanlah percobaan ini agar

mahasiswa mampu mengetahui dan mempelajari teknik-teknik kromatografi

sederhana yang bisa digunakan dalam skala laboratorium untuk memisahkan

pigmen-pigmen warna pada daun.

I.2 Tujuan

Adapun tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengetahui dan

mempelajari teknik-teknik kromatografi sederhana yang bisa digunakan dalam

skala laboratorium untuk memisahkan pigmen-pigmen warna pada daun.

I.3 Waktu dan Tempat Praktikum

Adapun waktu percobaan ini adalah Rabu, 24 Oktober 2018 pada pukul

14:00 WITA – selesai, di Laboratorium Biologi Dasar, Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Hasanuddin, Makassar.

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Pigmen

Pigmen adalah suatu zat yang mengubah warna cahaya yang

dipantulkannya, sebagai hasil dari absorpsi (penyerapan) terhadap cahaya

dengan panjang gelombang tertentu. Warna hijau pada daun berasal dari

kandungan klorofil pada daun. Pigmen-pigmen tanaman biasanya dijumpai

dalam plastid serta dalam vakuola. Tipe-tipe plastid yaitu kloroplas, kromoplas,

dan leukoplas. Kloroplas berwarna hijau sebagai akibat adanya pigmen klorofil

yang lebih banyak. Kromoplas berwarna kuning, jingga, atau merah karena

pigmen karotenoid. Leukoplas adalah plastid tanpa pigmen, biasanya terdapat

pada jaringan yang tidak terkena cahaya. Warna hijau ditimbulkan oleh klorofil

yang terdapat di dalam kloroplas (Aulia, 2015).

Dalam kloroplas juga dijumpai karotenoid yaitu pigmen kuning sampai

merah, tetapi ditutupi oleh klorofil. Karotenoid akan tampak jika hanya terdapat

sedikit atau tidak ada klorofil sama sekali. Untuk terjadinya fotosintesis,

energi dalam bentuk elektron yang tereksitasi pada berbagai pigmen harus

disalurkan ke pigmen pengumpul energi yang disebut sebagai pusat reaksi. Ada

terdapat dua macam pusat reaksi pada membran tilakoid, keduanya merupakan

molekul klorofil a yang berasosiasi dengan protein tertentu dan komponen-

komponen membran lainnya. Pigmen pada membran tilakoid sebagian besar

terdiri dari dua jenis klorofil hijau, yaitu klorofil a (pigmen berwarna hijau) dan

klorofil b yang mempunyai struktur mirip klorofil a, yaitu pigmen yang

berwarna kuning sampai jingga yang disebut karotenoid. Ada dua macam

karotenoid, yaitu karotenoid hidrokarbon murni dan xantofil yang mengandung

oksigen. Karotenoid tertentu juga ditemukan pada selimut kloroplas yang

memberinya warna kekuningan, sedangkan klorofil tidak dijumpai pada selimut

tersebut (Aulia, 2015)

II.2 Jenis Pigmen

Variasi warna dan corak dalam satu daun dapat dipelajari dengan

menganalisis kandungan pigmen dan mengamati struktur anatomi daun seperti

struktur mesofil. Variasi warna pada daun disebabkan oleh adanya pigmen

klorofil, karotenoid dan antosianin dalam jaringan daun. Daun yang memiliki

warna dan corak yang bervariasi memiliki struktur anatomi yang berbeda

(Hasidah, 2017).

Istilah klorofil berasal dari bahasa Yunani yaitu chloros artinya hijau dan

phyllos artinya daun. Istilah ini diperkenalkan pada tahun 1818, dan pigmen

tersebut diekstrak dari tanaman dengan menggunakan pelarut organik. Klorofil

adalah pigmen pemberi warna hijau pada tumbuhan, alga dan bakteri

fotosintetik. Pigmen ini berperan dalam proses fotosintesis tumbuhan dengan

menyerap dan mengubah energi cahaya menjadi energi kimia.Klorofil

mempunyai rantai fitil (C20H39O) yang akan berubah menjadi fitol

(C20H39OH)jika terkena air dengan katalisator klorofilase. Fitol adalah alkohol

primer jenuh yang mempunyai daya afinitas yang kuat terhadap O2 dalam proses

reduksi klorofil (Ai, 2011).

Sifat fisik klorofil adalah menerima dan atau memantulkan cahaya

dengan gelombang yang berlainan (berpendar = berfluoresensi). Klorofil banyak

menyerap sinar dengan panjang gelombang antara 400700 nm, terutama sinar

merah dan biru. Sifat kimia klorofil, antara lain (1) tidak larut dalam air,

melainkan larut dalam pelarut organik yang lebih polar, seperti etanol dan

kloroform; (2) inti Mg akan tergeser oleh 2 atom H bila dalam suasana asam,

sehingga membentuk suatu persenyawaan yang disebut feofitin yang berwarna

coklat (Ai, 2011).

Klorofil merupakan faktor utama yang mempengaruhi fotosintesis.

Fotosintesis merupakan proses perubahan senyawa anorganik (CO2 dan H2O)

menjadi senyawa organik (karbohidrat) dan O2 dengan bantuan cahaya

matahari. Klorofil merupakan pigmen utama yang terdapat dalam kloroplas.

Kloroplas adalah organel sel tanaman yang mempunyai membran luar, membran

dalam, ruang antar membran dan stroma. Permukaan membran internal yang

disebut tilakoid akan membentuk kantong pipih dan pada posisi tertentu akan

bertumpukan dengan rapi membentuk struktur yang disebut granum. Seluruh

granum yang terdapat pada kloroplas disebut grana. Tilakoid yang memanjang

dan menghubungkan granum satu dengan yang lain di dalam stroma disebut

lamela. Stroma merupakan rongga atau ruang dalam kloroplas dan berisi air

beserta garam-garam yang terlarut dalam air. Klorofil terdapat di dalam ruang

tilakoid (Campbell et al., 2010).

Tiga fungsi utama klorofil dalam proses fotosintesis adalah

memanfaatkan energi matahari, memicu fiksasi CO2 untuk menghasilkan

karbohidrat dan menyediakan energi bagi ekosistem secara keseluruhan.

Karbohidrat yang dihasilkan dalam fotosintesis diubah menjadi protein, lemak,

asam nukleat dan molekul organik lainnya. Klorofil menyerap cahaya yang
berupa radiasi elektromagnetik pada spektrum kasat mata (visible). Cahaya

matahari mengandung semua warna spektrum kasat mata dari merah sampai

violet, tetapi tidak semua panjang gelombang diserap dengan baik oleh klorofil.

Klorofil dapat menampung cahaya yang diserap oleh pigmen lainnya melalui

fotosintesis, sehingga klorofil disebut sebagai pigmen pusat reaksi fotosintesis

(Ai, 2011).

Tanaman tingkat tinggi mempunyai dua macam klorofil yaitu klorofil a

(C55H72O5N4Mg) yang berwarna hijau tua dan klorofil b (C55H70O6N4Mg) yang

berwarna hijau muda. Klorofil a dan klorofil b paling kuat menyerap cahaya di

bagian merah (600700 nm), dan paling sedikit menyerap cahaya hijau (500-600

nm). Sedangkan cahaya berwarna biru diserap oleh karotenoid. Karotenoid

membantu menyerap cahaya, sehingga spektrum cahaya matahari dapat

dimanfaatkan dengan lebih baik. Energi yang diserap oleh klorofil b dan

karotenoid diteruskan kepada klorofil a untuk digunakan dalam proses

fotosintesis fase I (reaksi terang) yang terdiri dari fotosistem I dan II, demikian

pula dengan klorofil-b. Klorofil a paling banyak terdapat pada Fotosistem II

sendangkan Klorofil b paling banyak terdapat pada Fotosistem I (Ai, 2011).

Sayuran yang berwarna hijau merupakan sumber pigmen, mineral, dan

vitamin terbaik dan penting bagi kesehatan manusia. Klorofil mampu berfungsi

sebagai pembersih alamiah (mendorong terjadinya detoksifikasi); antioksidan,

antipenuaan dan antikanker. Karotenoid juga merupakan pigmen alami yang

memberikan warna kuning, jingga atau merah. Karotenoid dikenal sebagai

prekursor vitamin A (beta karoten), dikembangkan sebagai efek protektif

melawan sel kanker, penyakit jantung, mengurangi penyakit mata, antioksidan,

dan regulator dalam sistem imun tubuh (Iriyani, 2014).

Kandungan antosianin diukur dengan menggunakan metode

spektrofotometri mengikuti prosedur Raharja & Dianawati (2001) dalam

Kurniasih (2010). Daun Caladium diambil dari tiga individu sebagai ulangan.

Masing-masing individu dari berbagai variasi diambil 2 helai daun dan digerus

dengan mortar kemudian ditimbang sebanyak ±1 gram. Sampel daun tersebut

kemudian diekstraksi dengan larutan HCl 5% dalam akuades. Ekstraksi

dilakukan dengan merendam bahan di dalam botol kaca yang berwarna gelap

dengan larutan HCl 5% tersebut (1:10), kemudian campuran disimpan di dalam

lemari pendingin bersuhu 40 C selama 24 jam. Selanjutnya campuran tersebut

disaring dengan kertas saring. Filtrat sebanyak 5 ml hasil ekstraksi diencerkan

menjadi 10 ml dengan larutan etanol 96% : HCl 1,5 N (85 : 15) lalu di vorteks.

Filtrat kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 535 nm

menggunakan spektrofotometer. Total antosianin (mg/g) dihitung menggunakan

rumus Lees & Francis (1972) dalam (Hasidah, 2017):

Antosianin (mg/g) = (absorbansi × FP) X 100

98,2 × w sampel (g)

II.3 Kromatografi

Kromatografi adalah teknik pemisahan suatu campuran zat menggunakan

fase gerak dan fase diam, dimana pemisahan terjadi akibat adanya perbedaan

daya adsorpsi, kelarutan, partisi, ukuran moleul, ukuran

 ion dan tekanan uap pada komponen yang dibawa oleh fase gerak melaui

fase diam Pemisahan pada kromatografi partisi berdasarkan kepada perbedaan

partisi analit dalam fase gerak dan fase diam cair yang tidak bercampur yang

terikat pada penyangga kolom (Aulia, 2015).

1. Dua jenis teknik kromatografi partisi antara lain adalah (Aulia, 2015):

Kromatograsi fase balik. Teknik ini menggunakan fase gerak yang bersifat

polar dan fase diam besifat non polar atau kurang polar. Pada teknik ini

sampel yang memilki tingkat kepolaran lebih tinggi akan terelusi lebih awal.

2. Kromatografi fase normal. Teknik ini menggunakan fase gerak yang bersifat

kurang polar atau non polar dan fase diam bersifat lebih polar. Pada teknik

ini sampel yang memilki tingkat kepolaran lebih rendah akan terelusi lebih

awal.

Pemisahan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dilakukan beberapa

kali menggunakan beberapa eluen dengan tingkat kepolaran yang berbeda untuk

mendapatkan pelarut yang mampu memberikan pemisahan yang baik serta noda

zat warna yang bagus. Bercak pada plat KLT dimonitor di bawah lampu UV 254

nm dan UV 365 nm. Penentuan golongan senyawa pada uji KLT dilakukan

dengan penyemprotan plat KLT dengan beberapa pereaksi. Komponen kimia

yang yang dievaluasi dari ekstrak meliputi uji alkaloid, fenol, terpenoid, dan

flavonoid dengan menggunakan pereaksi Dragendorff’s reagent, FeCl3, dan

Vanilin Asam Sulfat, secara berturut-turut (Alen, 2017).

 BAB III

METODE PERCOBAAN

III.1 Alat

Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah Mortar, Pastle, Kertas

kromatografi, Pipa kapiler, Tabung reaksi, Sumbat botol dan pengait.

III.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah Bayam Amaranthus

sp., Miyana Coleus hibridus, Puring Codiaeum sp., Jadam Rhoe discolor, Air,

Larutan n-heksana, Kertas saring dan larutan etanol

III.3 Tahapan Kerja

Adapun tahapan kerja pada percobaan ini meliputi:

1. Disiapkan Alat dan Bahan

2. Dibuat rangkaian alat

2
3

Gambar 1. Rangkaian alat percobaan

 Keterangan:

1. Sumbat tabung

2. Tabung reaksi

3. Pengait

4. Kertas Kromatografi

5. Larutan etanol

3. Dimasukkan beberapa daun Bayam Amaranthus sp., Miyana Coleus hibridus,

Puring Codiaeum sp., Jadam Rhoe discolor (dikerjakan terpisah) dalam

mortar, dan gerus sampai halus, ditambahkan etanol secukupnya.

4. Dicuci tangan sebelum memegang kertas kromatografi karena minyak yang

ada pada tangan akan mempengaruhi hasil percobaan.

5. Dipotong kertas kromatografi sesuai dengan tinggi tabung reaksi, disesuaikan

dengan sumbat tabung dan pengait agar kertas menggantung tanpa

menyentuh dasar tabung dan diberi tanda pada tabung reaksi.

6. Dituang larutan aseton ke dalam tabung reaksi sebanyak 6 ml.

7. Ditotolkan masing-masing setetes ekstrak daun yang diperoleh pada ujung

bawah kertas kromatografi yang telah diberi tanda.

8. Dibuka sumbat tabung dan digantungkan kertas kromatografi pada sumbat

tabung, ujung bawah kertas saring menyentuh sedikit larutan. Tabung reaksi

lalu ditutup.

9. Diamati kertas saring tersebut dan dicatat warna yang terlihat.

 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil

IV.1.1 Gambar Pengamatan

Gambar 2. Jadam Rhoeo discolor Gambar 3. Puring kuning Codeum sp.

Gambar 4. Miyana Coleous hybridus Gambar 5. Bayam Amaranthus sp.

IV.1.2 Tabel Hasil Pengamatan

Tabel 1. Hasil Pengamatan terhadap Kertas Kromatografi

Warna yang tampak
Jumah Lapis
Nama Tanaman Jumlah Warna pada kertas
Warna
Kromatografi
Amaranthus sp. - - -

Coleus hybridus - - -

Rhoeo discolor 1 1 Hijau (Klorofil)

Codeaum sp. 1 1 Kuning (Xantofil)

IV. 2 Pembahasan

Kromatografi merupakan salah satu teknik analisis yang terpenting

untuk pemisahan campuran senyawa-senyawa kimia. Pada dasarnya teknik

krornatografi terdiri atas dua fase yaitu fase diam (berupa cairan atau padat)

dan fase gerak (berupa cairan dan gas). Pemisahan komponen campuran

dapat tetjadi karena adanya perbedaan, kecepatan migrasi. Perbedaan

kecepatan migrasi ini timbul karena adanya perbedaan perbandingan

distribusi (penyerapan) dari komponen campuran di antara dua fase tersebut.

Menurut teori dalam buku (Campbel dkk., 2002), semua tanaman hijau

mengandung klorofil. Warna daun berasal dari klorofil, yaitu pigmen wrna hijau

yang terdapat di dalam kloroplas. Warna hijau pada kloroplas disebabkan oleh

adanya empat tipe utama pigmen didalamnya yaitu klorofil a, dan klorofil b,

berwarna hijau karena banyak menyerap warna lembayung dan merah dan

memancarkan sinar hijau, selain klorofil juga terdapat xantofil dan karoten.

Benda-benda berwarna menyerap cahaya dengan berbagai panjang gelombang

sampai pada tingkat tertentu, dan warna yang timbul pada warna tersebut adalah
cahaya yang diserap paling sedikit. Pada proses fotosintesis warna yang paling

sedikit diserap adalah warna dengan cahaya hijau, warna inilah tersebar

dipantulkan oleh tumbuhan sehingga tampak warna hijau.

Klorofil tidak larut dalam air, melainkan larut dalam etanol, methanol,

eter, aseton, bensol dan klorofrom. Untuk memisahkan klorofil a dan klorofil b

beserta pigmen-pigmen lain karotin, xantofil, organ menggunakan suatu teknik

kromatografi. Pada teknik kromatografi ini terdapat 2 fase yaitu fase gerak dan

fase diam. Fase gerak terjadi pada larutan tanaman sedangkan fase diam terjadi

pada kertas kromatografi. Cara melakukannya, campuran yang akan dipisahkan

diteteskan/diletakkan pada daerah yang diberi tanda di atas sepotong kertas

saring dimana ia akan meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda telah

kering, kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang sesuai dengan satu ujung,

dimana tetesan cuplikan ditempatkan, tercelup dalam pelarut yang dipilih

sebagai fasa bergerak (jangan sampai noda tercelup karena berarti senyawa yang

akan dipisahkan akan terlarut dari kertas). Pelarut bergerak melalui serat dari

kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen dari campuran cuplikan

pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Bila permukaan pelarut telah

bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah

ditentukan, kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut

diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawa-senyawa

berwarna maka mereka akan terlihat sebagai pita atau noda yang terpisah. Jika

senyawa tidak berwarna harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia. Yaitu

dengan menggunakan suatu pereaksi-pereaksi yang memberikan sebuah warna

terhadap beberapa atau semua dari senyawa-senyawa.

 Berdasarkan tabel pengamatan, didapati tanaman bayam berduri atau

Amarantus Sp tidak memperlihatkan warna pada kertas saring. Hal ini

bertentangan dengan teori yang menyatakan bahwa bayam berduri Amarantus

Sp. Memiliki pigmen warna hijau tua (klorofil a), hijau muda (korofil b) dan

kuning (karotenoid). Hal ini karena terjadi kesalahan selama praktikum yaitu

kertas saring tercelup dalam pelarut. Pada tanaman Coleus hibridus, terlihat 1

garis warna hijau. Ini membuktikan bahawa tanaman Coleus hibridus memiliki

pigmen warna klorofil sedangkan pada tanaman puring atau Rhoeo discolor,

terlihat ada 2 garis warna yaitu warna kuning (karotenoid) dan warna hijau

(klorofil). Ini jelas menunjukkan bahawa tanaman puring memiliki pigmen

warna hijau (klorofil) dan kuning (karotenoid). Namun warna hijau pada

tanaman puring ini ditutupi oleh warna kuning yang bersifat dominan sehingga

warna daun pada tanaman puring kelihatan kuning. Pada tanaman Codeaum sp.

terlihat garis bewarna kuning (karotenoid) pada kertas saring. Ini jelas

menunjukkan bahwa tanaman ini memiliki pigmen warna jenis karotenoid.

 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

V.1 Kesimpulan

Kesimpulan yang dapat saya tarik dari percobaan ini yaitu terdapat

banyak teknik-teknik kromatografi yang bisa digunakan untuk memisahkan

pigmen-pigmen warna pada daun antaranya adalah kromatografi lapis tipis.

V.2 Saran

Saya menyarankan agar pada percobaan selanjutnya bisa menggunakan

larutan aseton untuk mendapatkan hasil yang lebih baik.

 DAFTAR PUSTAKA

Alen. Y., Agresa. F. L., Yuliandra.Y., 2017. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
(KLT) dan Aktivitas Antihiperurisemia Ekstrak Rebung Schizostachyum
brachycladum Kurz (Kurz) pada Mencit Putih Jantan. Jurnal Sains
Farmasi & Klinis. Vol. 3(2) : 147-148

Ai. N. S., Banyo. Y., 2011. Konsentrasi Klorofil Daun Sebagai Indikator
Kekurangan Air Pada Tanaman. Jurnal Ilmiah Sains. Vol. 11(2) : 167-
168

Aulia. S. S., Sopyan. I., Muchtaridi. 2015. Penetapan Kadar Simvastatin

Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Vol. 14(4) : 72-73

Campbell. N. A., Reece. J. B., Urry. L. A., Cain. M. L., Wasserman. S. A.,
Minorsky. P. V., Jackson. R. B., 2010. Biologi. Penerbit Erlangga.
Jakarta

Hasidah. Mukarlina. Rousdy. D. W., 2017. Kandungan Pigmen Klorofil,

Karotenoid dan Antosianin Daun Caladium. Protobiont. Vol. 6(2) : 29

Iriyani. D., Nugrahani. P., 2014. Kandungan Klorofil, Karotinoid, dan Vitamin
C Beberapa Jenis Sayuran Daun Pada Pertanian Periurban di Kota
Surabaya. Jurnal Matematika, Sains, dan Teknologi. Vol. 15(2) : 85

Lakitan. B., 2015. Dasar-Dasar Fisiologi Tumbuhan. Pt Rajagrafindo Persada.

Jakarta

Maulid. R. R., Layli. A. N., 2015. Kadar Total Pigmen Klorofil dan Senyawa
Antosianin Ekstrak Kastuba (Euphorbia pulcherrima) Berdasarkan Umur
Daun. 225-226