AKTIVITAS BIOKIMIA BAKTERI

Tujuan

1. Untuk mengetahui berbagai macam aktivitas atau reaksi biokimia yang dapat dilakukan oleh
bakteri.
2. Untuk identifikasi suatu jenis mikroorganisme yang belum diketahui.

Pendahuluan

Aktivitas biokimia adalah sejumlah reaksi biokimia yang terjadi di dalam sel / di luar sel
(pada substrat dimana bakteri tersebut berada). Enzim yang bekerja pada bakteri dapat
dibedakan berdasarkan tempat aktivitas, yaitu enzim ekstraseluler dan enzim intraseluler.
Enzim ektraseluler bekerja pada substansi diluar sel dan berperan dalam reaksi biodegradasi
makromolekul/senyawa yang tak dapat melewati membran sel (polisakarida, lipid dan protein)
menjadi mikromolekul agar dapat ditransfer ke dalam sel. Sedangkan enzim intraseluler bekerja
dalam sel dan berperan dalam reaksi biosintesis dan bioenergetik.

Beberapa contoh reaksi biokimia bakteri hidrolisis pati, hidrolisis lipid, hidrolisis
gelatin, fermentasi karbohidrat, reaksi TSIA, reaksi IMViC (Indol, Metil Red, Vogesproskauer,
Citrat) , reduksi nitrat, produksi H2S, reaksi katalase, reaksi oksidase dan sebagainya

A. Hidrolisis Pati
Pati merupakan polimer glukosa dengan ikatan glikosida. Pati digunakan oleh bakteri
sebagai sumber karbon dan energi, tapi sebelum masuk kedalam sel perlu didegradasi (dipecah)
terlebih dahulu menjadi senyawa yang lebih sederhana ole enzim ekstraseluler, yakni amilase
dan maltase. pati secara berturut-turut akan dipecah menjadi dekstrin, maltasa dan glukosa.
Kemampuan bakteri dalam menghidrolisis pati dapat dideteksi dengan penambahan
iodium/lugol ke dalam medium starch agar. Jika pada medium/substrat masih terdapat pati,
maka dengan penambahan iodium akan terbentuk warna biru disekitar koloni, sebaliknya jika
pati sudah dihidrolisis, maka akan terbentuk warna bening disekitar koloni bakteri

- Bahan dan Alat

1. Biakan bakteri yang telah disediakan
2. Medium Starch Agar
3. Lugol
4. Lampu spirutus
5. Jarum ose
- Cara Kerja
1. Inokulasikan bakteri yang telah disediakan kedalam medium Starch agar
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam
3. Teteskan lukol pada medium
4. Amati dan catat apa yang terjadi

B. Hidrolisis Protein
Protein sebelum diasimilasi kedalam sel dipecah secara bertahap menjadi pepton,
polipeptida, dipeptida dan menjadi asam amino. Asam amino masuk kedalam sel dan
digunakan untuk sintesis protein structural atau fungsional bakteri. Adanya protein dalam
medium Skim milk agar, menyebabkan medium ini bewarna buram, akan tetapi bila protein ini
dihidrolisis oleh bakteri akan terbentuk zona bening disekitar koloni

- Bahan dan Alat

1. Biakan bakteri yang telah disediakan
2. Medium Trybutirin agar
3. Lampu spirutus
4. Jarum ose

- Cara Kerja
1. Inokulasikan bakteri yang telah disediakan kedalam medium Trybutirin agar
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam
3. Amati dan catat apa yang terjadi

C. Hidrolisis Lipid
Lipid atau trigliserida dapat dipecah dengan enzim lipase menjadi gliserol dan asam
lemak. Adanya lipid dalam medium Trybutirin agar, menyebabkan medium ini bewarna buram,
akan tetapi bila lipid ini dihidrolisis oleh bakteri akan terbentuk zona bening disekitar koloni,
contoh bakteri Pseudomonas aeruginosa

- Bahan dan Alat

1. Biakan bakteri yang telah disediakan
2. Medium Trybutirin agar
3. Lampu spirutus
4. Jarum ose
- Cara Kerja
1. Inokulasikan bakteri yang telah disediakan kedalam medium Trybutirin agar
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam
3. Amati dan catat apa yang terjadi

D. Hidrolisis Gelatin
Gelatin adalah protein yang dihasilkan dari hidrolisis kolagen. beberapa bakteri
diketahui mempunyai enzim gelatinase yang dapat menghidrolisis gelatin. Gelatin mempunyai
sifat membeku pada suhu <25°C. Bila bakteri dapat mengidrolisis gelatin dalam medium nutrien
gelatin, maka medium tetap cair setelah disimpan dalam lemari es. Sebaliknya bila masih
terdapat gelatin dalam medium, maka medium akan membeku setelah disimpan dalam lemari
es

- Bahan dan Alat

1. Biakan bakteri yang telah disediakan
2. Medium Nutrien gelatin
3. Lampu spirutus
4. Jarum ose

- Cara Kerja
1. Inokulasikan bakteri yang telah disediakan kedalam medium Nutrien gelatin
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam
3. Diamkan dalam lemari es selama 30 menit
4. Amati dan catat apa yang terjadi

E. Fermentasi Gula
Pada kondisi anaerob bakteri dapat memfermentasi gula (karbohidrat) yang terdapat
dalam medium, menghasilkan asam-asam organik seperti asam laktat, asam asetat, asam
format dan sebagainya.
Asam yang terbentuk akan menurunkan pH medium, sehingga menyebabkan
perubahan warna indikator. Indikator yang biasa digunakan untuk pH medium 7,2 – 7,4 adalah
brom cresol purple (ungu) dan phenol red (merah). Bila bakteri dapat memfermentasi gula,
warna medium akan berubah jadi kuning, sebaliknya bila tidak memfermentasi gula tersebut,
warna medium tetap sesuai dengan warna indicator. Akan tetapi medium menjadi keruh, yang
menunjukkan bakteri tetap dapat tumbuh.
 Bila selain menghasilkan asam, bakteri juga dapat menghasilkan gas berupa CO2 dan
H2, maka gas tersebut akan tertampung dalam tabung Durham yang diletakkan dengan posisi
terbalik dalam tabung reaksi.

- Bahan dan Alat

1. Biakan bakteri yang telah disediakan
2. Medium gula (air pepton dengan gula glukosa, laktosa, maltosa, manitol atau sakarosa)
3. Lampu spirutus
4. Jarum ose

- Cara Kerja
1. Inokulasikan bakteri yang telah disediakan kedalam masing-masing medium gula
a. Medium glukosa, kapas penutup tabung bewarna kuning
b. Medium laktosa, kapas penutup tabung bewarna ungu
c. Medium maltosa, kapas penutup tabung bewarna merah
d. Medium manitol, kapas penutup tabung bewarna hijau
e. Medium sakarosa, kapas penutup tabung bewarna biru
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam
3. Amati dan catat apa yang terjadi

F. Reaksi TSIA
Reaksi TSIA (Triple Sugar Iron Agar) digunakan untuk membedakan jenis bakeri dari
famili Enterobacteriaceae. Medium TSIA mengandung 3 macam gula, yakni laktosa 1%, sukrosa
1% dan glukosa 0,1%. Selain itu juga terdapat sodium tiosulfat sebagai substrat penghasil H2S
(hidrogen sulfida). Pada reaksi TSIA ini, dapat diketahui apakah bakteri dapat memfermentasi
glukosa, laktosa dan atau sukrosa, produksi gas CO2 atau H2S. Medium ini terdiri dari dua
bagian, yaitu bagian miring (slant) dan tegak (butt). Reaksi bakteri pada medium dapat berupa:
1. Meragikan semua gula, maka bagian miring dan tegak akan menjadi asam (A/A) dan
terbentuk warna kuning/kuning
2. Hanya meragika glukosa, maka bagian miring menjadi basa dan bagian tegak menjadi asam
(B/A) dan terbentuk warna merah/kuning
3. Tidak meragikan semua gula, maka bagian miring dan tegak tetap basa (B/B) dan terbentuk
warna merah/merah.
H2S akan bereaksi dengan Fe yang terdapat dalam medium, membentuk FeS berupa endapan
bewarna hitam

- Bahan dan Alat

1. Biakan bakteri yang telah disediakan
2. Medium TSIA
3. Lampu spirutus
4. Jarum ose

- Cara Kerja
1. Inokulasikan bakteri yang telah disediakan kedalam medium TSIA
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam
3. Amati dan catat apa yang terjadi

G. Reaksi Indol
Beberapa jenis bakteri dapat membentuk indol dari triptofan selama pertumbuhannya.
Bakteri tertentu seperti Escherichia coli mempunyai enzim triptofanase yang dapat memecah
asam amino trioptofan menjadi indol, asam piruvat dan NH3. Indol yang dihasilkan dapat
dideteksi dengan penambahan reagen Ehrlich atau Kovac’s, yakni dengan terbentuknya cincin
merah dipermukaan medium, dan bila tidak terbentuk indol ditandai dengan cincin kuning.

Medium yang digunakan untuk tes ini adalah SIM (Sulphide Indol Motiliy) atau LIM
(Lisin Indol Motility). Medium ini bersifat semisolid, dapat mendeteksi apakah bakteri
mempunyai flagel atau tidak. Jika bakteri mempunyai flagel maka pertumbuhan bakteri akan
terlihat menyebar, sedangkan tidak maka pertumbuhan bakteri dalam medium hanya pada
bekas tusukan atau garis lurus.

- Bahan dan Alat

1. Biakan bakteri yang telah disediakan
2. Medium SIM
3. Reagen Kovack’s
4. Lampu spirutus
5. Jarum ose
- Cara Kerja
1. Inokulasikan bakteri yang telah disediakan kedalam medium SIM
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam
3. Tambahkan 3 tetes reagen Kovak’s
4. Amati dan catat apa yang terjadi
H. Reaksi Merah Metil
Beberapa jenis bakteri dapat menghasilkan asam organik sebagai produk akhir dalam
fermentasi glukosa. Asam yang dihasilkan akan menurunkan pH menjadi rendah (pH 4),
sehingga indikator merah metil akan berwarna merah (tes positif). Jika asam yang dihasilkan
bukan produk akhir dan dikonversi lagi menjadi senyawa lain maka pH medium mendekati 6
dan warna indikator menjadi kuning (tes negatif)

- Bahan dan Alat

1. Biakan bakteri yang telah disediakan
2. Medium MR-VP
3. Indikator merah metil
4. Lampu spirutus
5. Jarum ose

- Cara Kerja
1. Inokulasikan bakteri yang telah disediakan kedalam medium MR-VP
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam
3. Tambahkan 3 tetes indikator merah metil
4. Amati dan catat apa yang terjadi

I. Reaksi Voges - Proskauer

Beberapa jenis bakteri tidak mengakumulasi asam dalam fermentasi glukosa,
melainkan dikonversi membentuk asetil metil karbinol. Adanya asetil metil karbinol dapat
dideteksi dengan penambahan reagen Barritts, yakni dengan terbentuknya senyawa berwarna
merah muda dalam medium (tes positif)

- Bahan dan Alat

1. Biakan bakteri yang telah disediakan
2. Medium MR-VP
3. Reagen Barritts (α naftol + KOH)
4. Lampu spirutus
5. Jarum ose

- Cara Kerja
1. Inokulasikan bakteri yang telah disediakan kedalam medium MR-VP
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam
3. Tambahkan 3 tetes reagen Barritts, biarkan 5-15 menit
4. Amati dan catat apa yang terjadi
J. Reaksi Sitrat
Jika tidak terdapat karbohidrat, beberapa jenis bakteri dapat menggunakan asam sitrat
sebagai sumber karbon satu-satunya dalam medium. Kemampuan ini tergantung pada adanya
enzim sitrat permiase yang dapat memindahkan sitrat ke dalam sel. Sitrat selanjutnya akan
dipecah oleh enzim sitrase menjadi asam osalat dan asam asetat, kemudian dikonversi secara
enzimatik menjadi asam piruvat dan CO2. CO2 yang dihasilkan ini akan bereaksi dengan sodium
dan air menjadi sodium karbonat, sehingga medium menjadi basa. Hal ini akan menyebabkan
warna indikator brom thymol blue yang terdapat dalam medium berubah menjadi biru (tes
positif)

- Bahan dan Alat

1. Biakan bakteri yang telah disediakan
2. Medium Sitrat
3. Lampu spirutus
4. Jarum ose

- Cara Kerja
1. Inokulasikan bakteri yang telah disediakan kedalam medium Sitrat
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam
3. Amati dan catat apa yang terjadi

K. Tes katalase
Selama respirasi aerob mikroorganisme akan menghasilkan H2O2 yang bersifat toksik.
Akumulasi H2O2 dapat menyebabkan kematian bila tidak didegradasi oleh enzim katalase.
Produksi katalase dapat dideteksi dengan penambahan H2O2 kedalam biakan bakteri pada
medium trypticase soy agar. Jika bakteri mempunyai enzim katalase, ditunjukkan dengan
adanya gelembung gas oksigen yang dilepaskan (tes positif) dari medium

- Bahan dan Alat

1. Biakan bakteri yang telah disediakan
2. Medium Tryticase Soy Agar
3. Larutan H2O2 3 %
4. Lampu spirutus
5. Jarum ose

- Cara Kerja
1. Inokulasikan bakteri yang telah disediakan kedalam medium trypticase soy agar
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam
3. Teteskan larutan H2O2 3 %
4. Amati dan catat apa yang terjadi

L. Reduksi nitrat
Bila tidak ada oksigen, maka beberapa mikroorganisme aerob dan anaerob fakultatif
akan mengunakan nitrat sebagai terminal akseptor elektron (respirasi anaerob). Nitrat tersebut
akan direduksi menjadi nitrit dan air. Reduksi nitrat ini dapat dideteksi dengan menumbuhkan
mikroorganisme dalam nitrat broth yang mengandung potasium nitrat (KNO3). Untuk membuat
medium menjadi semisolid ditambahkan 0,1 % bacto agar untuk mencegah difusi oksigen
kedalam medium.Bila terbentuk nitrit, maka setelah penambahan larutan asam sulfanilat dan
larutan α naftil amin akan terbentuk senyawa berwarna merah (tes positif)

- Bahan dan Alat

1. Biakan bakteri yang telah disediakan
2. Medium Nitrat Broth
3. Larutan asam sulfanilat dan larutan α naftil amin
4. Lampu spirutus
5. Jarum ose

- Cara Kerja
1. Inokulasikan bakteri yang telah disediakan kedalam medium Nitrat broth
2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam
3. Tambahkan larutan asam sulfanilat dan larutan α naftil amin
4. Amati dan catat apa yang terjadi