LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DAN VIROLOGI

PRAKTIKUM V
IDENTIFIKASI DAN DETERMINASI BAKTERI

Hari, Tanggal Praktikum : Selasa, 28 Desember 2021

Nama : Ni Kadek Dewi Wulaningsih
NIM : 201021059
Kelas : A5B
Kelompok :6
Dosen Pengampu : Apt. I Putu Gede Adi Purwa, S. Farm., M. Farm

PROGRAM STUDI FARMASI KLINIS

FAKULTAS ILMU-ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS BALI INTERNASIONAL
DENPASAR
2022

PRAKTIKUM V
 IDENTIFIKASI DAN DETERMINASI BAKTERI
BAB I

DETERMINASI BAKTERI DENGAN UJI BIOKIMIAWI

1.1. Tujuan

Mengidentifikasi dan mendeterminasi bakteri berdasarkan sifat-sifat

biokimiawinya.

1.2. Dasar Teori

Bakteri adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki
membran inti (prokariota). Bakteri dulu terbagi menjadi Bacteria dan
Archaebacteria, namun sekarang Archaebakteria memiliki domain sendiri yang
disebut Archaea. Bakteri memiliki ciri-ciri antara lain tidak memiliki membran
inti, tidak memiliki organel bermembran, memiliki dinding sel peptidoglikan, dan
materi asam nukleatnya berupa plasmid (Postlethwait dan Hopson, 2006).

Uji biokimia bakteri merupakan suatu cara atau perlakuan yang dilakukan
untuk mengidentifikasi dan mendeterminasi suatu biakan murni bakteri hasil
isolasi melalui sifat-sifat fisiologinya. Proses biokimia erat kaitannya dengan
metabolisme sel, yakni selama reaksi kimiawi yang dilakukan oleh sel yang
menghasilkan energi maupun yang menggunakan energi untuk sintesis
komponen-komponen sel dan untuk kegiatan seluler, seperti pergerakan.
(Petczar, Michael J. dan E.C.S Chan ,2010).
Uji biokimia dilakukan untuk mengetahui sifat-sifat fisiologis koloni
bakteri hasil isolasi. Biokimia bakteri berkaitan dengan proses metabolisme sel
bakteri. Identifikasi bakteri tidak dapat dilakukan dengan mengetahui sifat
mofologinya saja, namun harus mengetahui sifat fisiologis bakteri juga. Sifat
fisiologis bakteri sangat penting diketahui apabila melakukan identifikasi bakteri
karena sifat moroflogis bakteri dapat tampak serupa bahkan tidak dikenal
sehingga dengan melakukan uji biokimia terhadap koloni bakteri dapat
mengetahui sifat dan menentukan spesies bakteri. Uji biokimia yang dilakukan
menggunakan reagen test (Handayani dkk., 2013).
Identifikasi dan determinasi suatu biakkan murni bakteri yang diperoleh
dari hasil isolasi dapat dilakukan melalui pengamatan ciri-ciri morfologi koloni
tersebut serta pengujian fisiologi dan biokimianya. Bakteri dapat diidentifikasi
dengan mengetahui reaksi biokimia tersebut. Menanam bakteri pada medium,
dapat diketahui sifat suatu koloni bakteri. Sifat metabolisme bakteri dalam uji
biokimia dapat dilihat dari interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan
reagen kimia yang digunakan (Waluyo, 2007).

Mikroba tumbuh dan berkembang biak dengan menggunakan berbagai

bahan yang terdapat di lingkungannya melalui proses metabolisme. Nutrien yang
terdapat di lingkungan sekelilingnya terdiri dari molekul sederhana
4 seperti H2S
dan NH + atau molekul organik yang kompleks seperti protein dan polisakarida
dimetabolisme untuk memperoleh energi dan prekursor untuk sintesis dinding
sel, membran dan flagella. Selain energi juga dihasilkan zat zat buangan yang
kadang bersifat toksik. Untuk menjalankan proses metabolisme maka mikroba
mengunakan berbagai enzim yang aktifitasnya dapat diamati dan terkadang
menjadi ciri khas dari mikroorganisme tersebut seperti bakteri aerob yang

menghasilkan enzim katalase. Skema metabolisme ini dapat diamati pada

gambar 3.2 sebagai berikut ;

Gambar 3.2 Proses metabolisme

(Purwa Hita,2021)
Pada identifikasi bakteri mula-mula diamati morfologi sel individual secara
mikroskopik dan pertumbuhannya pada bermacam- macam medium. Karena suatu
bakteri tidak dapat dideterminasi hanya berdasarkan sifat-sifat morfologinya saja,
maka perlu diteliti pula sifat-sifat biokimiawi dan faktor-faktor yang
mempengaruhi pertumbuhannya. Percobaan-percobaan dalam uji biokimiawi
mencakup berbagai uji untuk mengetahui aktivitas metabolisme mikroba.
Pengamatan aktivitas metabolisme diketahui dari kemampuan mikroba untuk
menggunakan dan menguraikan molekul kompleks, seperti zat pati, lemak, protein
dan asam nukleat. Selain itu pengamatan juga dilakukan pada molekul yang
sederhana seperti asam amino dan sakarida. Hasil dari berbagai uji ini digunakan
untuk pencirian dan identifikasi mikroba. Bebarapa uji metode biokimia yang
penting adalah sebagai berikut :

1. Uji Katalase
Sebagian besar bakteri aerob dan bakteri anaerob fakultatif
mengunakan oksigen dalam proses metabolismenya. Sebagian besar proses
metabolisme ini akan menghasilkan senyawa hidrogen peroksida (H2O2).
Senyawa ini merupakan senyawa radikal bebas yang bersifat toksik bagi
pertumbuhan sel. Bakteri aerob dan bakteri anaerob fakultatif mampu
bertahan hidup karena memiliki enzim catalase yang mampu memecah
hydrogen peroksida menjadi senyawa air dan oksigen. Kedua senyawa ini
tidak berbahaya bagi proses metabolisme sel. Diduga bahwa bakteri yang
bersifat anaerob tidak dapat tumbuh dalam lingkungan yang mengandung
oksigen karena bakteri anaerob ini tidak memiliki enzim katalase. Reaksi
pengubahan hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen ditunjukan pada
gambar 3.3 sebagai berikut : (Purwa Hita,2021)

Gambar 3.3 Aktifitas katalase

2. Tes Pengunaan Sitrat

Beberapa bakteri usus mampu mengunakan asam sitrat sebagai sumber

utama karbon. Metode ini berguna untuk mengelompokan bakteri gram negative
berdasarkan kemampuannya mengunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.
Media yang sering digunakan untuk menganalisis adalah media Simmons Citrate
Agar yang mengandung indicator pH Brom Thymol Blue (BTB), asam sitrat dan
garam amonium. Bakteri yang tumbuh pada media ini akan mengunakan asam
sitrat sebagai sumber karbon dan mengubah garam ammonium menjadi
ammonia. Perubahan ini menyebabkan perubahan komposisi media. Perubahan
ini dapat dideteksi dengan indikator BTB yang akan bewana hijau pada pH di
bawah 6,9 dan akan berwarna biru pada pH di atas 7,6. Hasil positif dengan
metode ini ditunjukan dengan media yang berubah warna menjadi biru.

Gambar 3.4 Hasil Tes Pengunaan Sitrat

(Purwa Hita,2021)

3. Tes Dekarboksilase Lisin

Tes ini bertujuan untuk melihat organisme yang mengunakan asam amino
lysin sebagai sumber karbon. Mikroba yang mampu mengunakan lysin sebagai
sumber karbon biasanya memiliki enzim lysin dekarboksilase di dalam selnya.
Ketika lysin dikonsumsi maka akan menghasilnkan senyawa yang dapat
meningkatkan pH dari medium. Perubahan pH ini selanjutya diamati dengan
indikator. Indikator yang sering digunakan adalah Brom Cresol Purple (BCP).
Indikator ini akan ungu pada pH netral atau basa dan akan berubah warna menjadi
kuning pada pH di bawah 5,2. Pada percobaan dengan mikroba dengan
mengunakan agar Lysin Iron Agar maka mikroba harus mengunakan glukosa
terlebih dahulu sehingga menyebabkan pH medium menjadi turun di bawah 5,2
sehingga akan diamati perubahan media dari unggu menjadi kuning setelah 24
jam inkubasi. Setelah pH medium turun maka enzim lysin dekarboksilase
diaktifkan oleh sel mikroba. Kultur selanjutnya diinkubasi lagi selama 24 jam
sehingga mikroba sekarang mengunakan lysin sebagai sumber karbon dan
merubah pH medium menjadi basa kembali. Setelah 48 akan diamati perubahan
warna dari kuning menjadi unggu lagi. Kegagalan terjadi jika medium tidak
berubah menjadi kuning dalam waktu 24 jam atau tidak berubah menjadi unggu
dalam waktu 48 jam. Hasil tes dekarboksilase lysin ditunjukan pada gambar 3.5
sebagai berikut :

Gambar 3.5 Tes dekarboksilase lysin (kuning 24 jam, unggu 48 jam)

(Purwa Hita,2021)
4. Produksi Hidrogen Sulfida (H2S)

Beberapa jenis bakteri seperti Proteus vulgaris mampu merubah asam

amino sistein.dan menghasilkan produk berupa hidrogen sulfide. Jika bakteri ini
ditumbuhkan dalam media yang mengandung garam besi maka akan terjadi reaksi
antara H2S dengan ion besi membentuk endapan iron sulfide yang berwarna gelap.
Proses produksi H2S ditunjukan pada gambar 3.6 sebagai berikut :
 Gambar 3.6 Produksi Hidrogen Sulfida
(Purwa Hita,2021)

BAB II
METODE

2.1. Alat Dan Bahan

1. Isolat murni bakteri dalam NA miring dan NB (nutrien cair)

2. Reagen untuk test katalase : 10% atau 30% H2O2
3. Bahan untuk test sitrat : Simmons Citrate Agar yang mengandung indikator
Brom Thymol Blue (BTB)
4. Bahan untuk test dekarboksilase lisin : media Lysin Iron Agar (LIA) yang
mengandung Lisin dan indikator Brom Cresol Purple (BCP)
5. Media Nutrien Agar (NA)
6. Media McConkey
 7. Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
8. Jarum ose
9. Mikropipet

2.2. CARA KERJA

1. Test Katalase
Diletakkan 1-2 tetes 10 % atau 30% H2O2 pada gelas benda.

Ditambahkan 1 ose atau 2-3 tetes suspensi isolat murni bakteri

Staphylococus aureus.

Dimati, katalase positif ditandai oleh pembentukan buih seketika.

Dibandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri).

2. Test Penggunaan Sitrat

Isolat murni bakteri diinokulasikan secara goresan zig zag
menggunakan ose dan secara tusukan menggunakan jarum inokulasi
pada media Simmons Citrat Agar miring,

Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam.

Diperhatikan perubahan warna dengan melihat perubahan warna dari

hijau menjadi biru. Dibandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi
bakteri).

3. Test Dekarboksilase Lisin

Pada medium yang mengandung lisin (Lysin iron Agar) dan kontrol
(media tanpa lisin) diinokulasi secara tusukan dengan isolat murni
bakteri.

Diinkubasikan pada suhu 370C selama 24 jam, diamati lalu

dilanjutkan lagi dengan inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam.
 Positif jika terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning (24
jam) dan kembali ke ungu (48 jam). Sementara pada kontrol (media
tanpa lisin) tidak terjadi perubahan warna.

4. Test H2S dan Fermentasi Gula

Dengan menggunakan media TSIA, diinokulasikan isolat murni
bakteri secara goresan menggunakan jarum ose dan secara ditusukan
menggunakan jarum inokulasi.

Diinkubasikan selama 24 jam. Pembentukan H2S ditunjukkan

dengan terbentuknya endapan warna hitam. Perubahan warna TSIA
dari merah menjadi kuning menunjukkan adanya fermentasi gula
(glukosa, sukrosa, laktosa).

Diamati juga apakah terbentuk gas yang ditandai dengan pecahnya

media atau terangkatnya media ke atas. Dibandingkan dengan
kontrol (media tanpa inokulasi bakteri).
BAB III
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

3.1. Hasil Pengamatan

3.2. Pembahasan
Adapun tujuan dari praktikum mikrobiologi dan virologi ini
mengidentifikasi dan mendeterminasi bakteri berdasarkan sifat-sifat
biokimiawinya. Pada uji biokimiawi dilakukan 3 pengujian yaitu uji penggunaan
sitrat, tes dekarboksilase lysine, dan tes H2S dan fermentasi gula-gula.
Adapun langkah kerja yang harus dilakukan adalah di awali dengan test
katalase dengan meletakan 1-2 tetes 10 % atau 30% H2O2 pada gelas benda dan
tambahkan 1 ose atau 2-3 tetes suspensi isolat murni bakteri Staphylococus
aureus. Amati, katalase positif ditandai oleh pembentukan buih seketika.
Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri). Lalu dilanjutkan dengan
Test Penggunaan Sitrat, dimana Isolat murni bakteri diinokulasikan secara
goresan zig zag menggunakan ose dan secara tusukan menggunakan jarum
inokulasi pada media Simmons Citrat Agar miring, kemudian diinkubasi pada
suhu kamar selama 24 jam. Perhatikan perubahan warna dengan melihat
perubahan warna dari hijau menjadi biru. Bandingkan dengan kontrol (tanpa
inokulasi bakteri).
Selanjutnya adalah Test Dekarboksilase lisin dengan cara lisin pada
medium yang mengandung lisin (Lysin iron Agar) dan kontrol (media tanpa
lisin) diinokulasi secara tusukan dengan isolat murni bakteri, inkubasikan pada
suhu 370C selama 24 jam diamati lalu dilanjutkan lagi dengan inkubasi pada
suhu 370C selama 24 jam. Positif jika terjadi perubahan warna dari ungu menjadi
kuning (24 jam) dan kembali ke ungu (48 jam). Sementara pada kontrol (media
tanpa lisin) tidak terjadi perubahan warna. Kemudian yang terakhir adalah Test
H2S dan Fermentasi Gula Dengan menggunakan media TSIA, yang dawali
dengan meng inokulasikan isolat murni bakteri secara goresan menggunakan
jarum ose dan secara tusukan menggunakan jarum inokulasi. Inkubasikan selama
24 jam Pembentukan H2S ditunjukkan dengan terbentuknya endapan warna
hitam. Perubahan warna TSIA dari merah menjadi kuning menunjukkan adanya
fermentasi gula (glukosa, sukrosa, laktosa). Amati juga apakah terbentuk gas
yang ditandai dengan pecahnya media atau terangkatnya media ke atas.
Bandingkan dengan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri).
Hasil dari pengujian katalase menggunakan reagen H202 dengan preparate
menggunakan ose bulat. Media yang digunakan yaitu bakteri P.Acne dan S.
Aureus menghasilkan hasil yang positif ditandai dengan adanya gelembung dan
buih, selanjutnya pada uji koagulase menggunakan reagen plasma darah dengan
preparate yang menggunakan ose bulat. Media yang digunakan yaitu bakteri
P.Acne dan S. Aureus menghasilkan hasil yang positif ditandai dengan
terbentuknya kristal.
Pada uji test nutrient agar (NA) pada test nutrien digunakan bakteri E.
Coli pada test NA menggunakan jarum ose bulat yang diaplikasikan secara zig
zag tarik. Hasil yang didapatkan yaitu positif (+) ditandai dengan tumbuhnya
bakteri E. Coli yang mengikuti garis zig zag tarik pada lereng media yang
 berwarna putih selama 24 jam inkubasi. Pada uji test H2S dan fermentasi gula-
gula sebelum dilakukan inkubasi gula- gula berwarna hijau, setelah dilakukan
inkubasi selama 24 jam gula- gula berubah warna menjadi warna kuning dan
terdapat gelembung pada ujung tabung durham yang menandakan hasil positif.
Selanjutnya pada uji test triple sugar iron agar (TSIA ) pada test triple sugar
iron agar menunjukkan hasil positif dengan ditandai lereng dan dasar berwarna
kuning serta terdapat gas negatif terdapatnya H2S. Pada test sulfit indol motility
(SIM) menunjukkan hasil negatif H2S , positif gerak, positif indol yang dapat
dilihat setelah ditambahkan dengan reagen kovacs, dan positif mortiliti. Pada uji
test simmons citrate agar (SC) menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan
warna media tidak berubah ( tetap berwarna hijau ) dan positif gas. Pada uji test
dan fermentasi gula-gula menghasilkan tanda positif gas pada tabung burham
glukosa (+g), laktosa (+g), maltosa(+g), manitol (+g), dan sukrosa (+g).

BAB IV
KESIMPULAN DAN SARAN

4.1. KESIMPULAN
Uji biokimia yang dilakukan menggunakan reagen test, pada praktikum ini
hanya menggunakan 3 tipe uji yaitu uji penggunaan sitrat, tes dekarboksilase
lysine, dan tes H2S dan fermentasi gula-gula. Pada determinasi bakteri dengan uji
biokimiawi ini didapatkan hasil yaitu pada saat pengujian pada bakteri dengan
tiga tes tersebut, didapatkan bahwa belum ditemukannya ada pertumbuhan
bakteri. Tetapi pada saat pengontrolan uji penggunaan sitrat ditemuakan terjadi
perubahan warna media, dari hijau menjadi biru, dan terjadi perubahan warna
dari hijau menjadi biru menunjukan citrat (+) atau positif. Pada uji test nutrient
agar (NA) pada test nutrien digunakan bakteri E. Coli pada test NA
menggunakan jarum ose bulat yang diaplikasikan secara zig zag tarik. Hasil yang
didapatkan yaitu positif (+) ditandai dengan tumbuhnya bakteri E. Coli yang
mengikuti garis zig zag tarik pada lereng media yang berwarna putih selama 24
jam inkubasi. Pada uji test H2S dan fermentasi gula-gula sebelum dilakukan
inkubasi gula- gula berwarna hijau, setelah dilakukan inkubasi selama 24 jam
 gula- gula berubah warna menjadi warna kuning dan terdapat gelembung pada
ujung tabung durham yang menandakan hasil positif. Selanjutnya pada uji test
triple sugar iron agar (TSIA ) pada test triple sugar iron agar menunjukkan
hasil positif dengan ditandai lereng dan dasar berwarna kuning serta terdapat gas
negatif terdapatnya H2S. Pada test sulfit indol motility (SIM) menunjukkan hasil
negatif H2S , positif gerak, positif indol yang dapat dilihat setelah ditambahkan
dengan reagen kovacs, dan positif mortiliti. Pada uji test simmons citrate agar
(SC) menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan warna media tidak
berubah ( tetap berwarna hijau ) dan positif gas. Pada uji test dan fermentasi
gula-gula menghasilkan tanda positif gas pada tabung burham glukosa (+g),
laktosa (+g), maltosa(+g), manitol (+g), dan sukrosa (+g).

4.2 SARAN
Diharapkan praktikum selanjutnya dapat berjalan lebih baik lagi agar
mahasiswa mampu mengerti secara maksimal materi atau teori yang didapatkan
pada saat praktikum
 DAFTAR PUSTAKA

Handayani, N. I., Misbachul, M., Nanik, I. S., & Rizal, A. M. 2013. Isolasi Bakteri
Heterotrofik Anaerobik pada Pengolahan Air Limbah Industri Tekstil.
Jurnal Riset Teknologi Pencegahan Pencemaran Industri. Vol. 7. No. 1.

Jutono,dkk.2007. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum (untuk pengukuran

tinggi). Yogyakarta : UGM Press

Murray (2005). Biokimia Harper. Jakarta: EGC.

Pelczar dan Chan, 1986, Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid I, diterjemahkan oleh Ratna
Siri Hadioetomo, Teja Imas, S. Sutami, Sri Lestari. Jakarta: Universitas
Indonesia, 116-117
Petczar, Michael J. dan E.C.S Chan (2010). Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI
press.

Purwa Hita, I Putu Gede Adi. 2021. Modul Praktikum Mikrobiologi dan Virologi.
Denpasar : Program Studi Farmasi Klinis Fakultas Ilmu-Ilmu Kesehatan
Universitas Bali Internasional.
 LAMPIRAN

No. Gambar Keterangan

1. Alat-alat yang
digunakan pada
praktikum kali ini
yaitu rak tabung
reaksi tabung reaksi
besar, tabung reaksi
kecil, tabung
durham, erlenmeyer,
beaker glass, batang
pengaduk, spatula
logam, pipet tetes,
kaca, objek glass,
jarum ose bulat,
jarum ose lurus,
bunsen, kapas putih,
kapas berwarna
(Kuning, ungu,
hijau, merah dan
biru), autoclave
basah, alat inkubasi
dan timbangan
analitik
2. Alat disamping
merupakan autoclave
basah yang
digunakan untuk
mensterilkan alat dan
bahan yang akan
digunakan.
3. Uji katalase yang
menggunakan
bakteri
Staphylococcus
aureus dan
Propionibacterium
acnes yang
menjukkan hasil
positif dengan
adanya buih

4. Uji koagulase yang

menggunakan
bakteri
Staphylococcus
aureus dan
Propionibacterium
acnes yang
menjukkan hasil
positif dengan
terbentuknya kristal

5. Penimbangan SIM
sebanyak 5 gram
6. Penimbangan
glukosa sebanyak
200 mg

8. Penimbangan laktosa
sebanyak 200 mg

9. Penimbangan
maltosa sebanyak
200 mg
10. Penimbangan
manitol sebanyak
200 mg

11. Penimbangan
sukrosa sebanyak
200 mg

12. Larutan gula-gula

(glukosa, laktosa,
maltosa, manitol,
dan sukrosa) yang
akan di sterilakan
menggunakan alat
autoclave basah.
13. Larutan gula-gula
(glukosa, laktosa,
maltosa, manitol,
dan sukrosa) yang
telah dimasukkan
kedalam chiller atau
pendingin
14. Larutan gula-gula
(glukosa, laktosa,
maltosa, manitol,
dan sukrosa) yang
telah dimasukkan ke
dalam tabung reaksi
medium yang di
dalam tabung reaksi
medium telah berisi
tabung durham
15. Media NA, TSIA,
SIM, SC, gula-gula
yang akan di
dilakukan
penanaman dengan
bakteri Escherichia
coli
16. Proses penanaman
bakteri terhadap
media
17. Media SIM yang
ditanami bakteri
Escherichia coli,
yang telah diinkubasi
selama 24 jam

18. Reagen konvacs

yang digunakan pada
uji SIM

19. Media SIM yang

sudah diberikan
reagen kovacs
sehingga
menimbulkan cincin
merah pada media
SIM dan menyebar
mengikuti
penanaman bakteri
20. Hasil dari 4 media
(NA, TSIA, SIM dan
SC) yang
menandakan hasil
positif terdapatnya
atau tumbuhnya
bakteri Escherichia
coli pada media.

21. Larutan gula-gula

yang telah ditanami
bakteri Escherichia
coli dan di inkubasi
selama 24 jam yang
menunjukan
perubahan warna
dari hijau menjadi
kuning yang
menandakan hasil
positif yaitu terdapat
pada larutan gula-
gula (glukosa, laktos,
maltosa dan manitol)
sedangkan pada
larutan gula-gula
sukrosa tidak adanya
perubahan warna
larutan (tetap
berwarna hijau)