PRAKTIKUM III

IDENTIFIKASI BAKTERI DENGAN PENGECATAN GRAM DAN UJI

BIOKIMIAWI

I. PENGECATAN GRAM
A. TUJUAN
Melihat bentuk sel bakteri dan identifikasi bakteri gram negatif dan gram positif

B. DASAR TEORI
Bakteri atau mikroba lainnya dapat dilihat dengan mikroskop cahaya tanpa pewarnaan
/pengecatan atau dengan pewarnaan /pengecatan. Pengamatan tanpa pengecatan lebih sukar
dan tidak dapat dipakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti karena sel bakteri atau
mikroba lainnya transparan atau semi transparan. Dengan pengecatan, dapat dilihat struktur
sel mikroba lebih seksama. Fungsi pengecatan adalah :
a). Memberi warna pada sel atau bagian-bagiannya sehingga memberi kontras dan tampak
lebih jelas,
b). Dapat untuk menunjukkan bagian-bagian struktur sel,
c). Membedakan mikroba satu dengan yang lain,
d). Menentukan pH dan potensial oksidasi reduksi ekstraseluler dan intraseluler
Pengecatan bakteri umumnya menggunakan lebih dari satu tingkat pengecatan. Hasil
pengecatan dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti : fiksasi, substrat, dekolorisator dan
sebagainya. Dalam pembuatan pulasan bakteri yang siap diwarnai, perlu dilakukan
fiksasi terlebih dahulu yang bertujuan antara lain : a). mencegah
1 mengkerutnya globula-
globula protein sel, b). merubah afnitas cat, c). mencegah terjadinya otolisis sel, d). dapat
membunuh mikroba secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan-perubahan
bentuk atau strukturnya, e). melekatkan bakteri di atas gelas benda dan f). membuat sel-sel
lebih kuat/keras.
Cara fiksasi yang paling banyak digunakan dalam pengecatan bakteri adalah dengan
membuat lapisan suspensi/pulasan bakteri di atas gelas benda, kemudian dikeringanginkan
dan dilalukan beberapa kali di atas nyala lampu spiritus

Terdapat berbagai macam metode pewarnaan sederhana seperti pewarnaan dengan

Methylen blue, pewarnaan dengan Fuchsin atau pewarnaan dengan Kristal violet. Teknik
pewarnaan ini mengunakan fakta bahwa dinding dan membrane sel bakteri bersifat
negative sehingga kemungkinan dapat berikatan dengan senyawa bermuatan positif yang
memiliki sifat sebagai kromofor (zat pewarna). Pengecatan sederhana ini tidak dilakukan
pada praktikum ini.
Selain pengecatan sederhana tersebut terdapat juga pengecatan diferensial yaitu pengecatan
Gram. Pengecatan ini dikembangkan pertama kali oleh Christian Gram (1884) dan
termasuk pengecatan differensial, karena dapat membedakan bakteri yang bersifat gram
positif dan gram negatif. Dari segi pewarnaan perbedaan antara bakteri Gram positif dan
Gram negative. Bakteri Gram positif mengikat cat utama (crystal violet) dengan kuat
sehingga tidak dapat dilunturkan oleh bahan peluntur (alcohol) dan tidak diwarnai lagi oleh
cat lawan (safranin). Penambahan iodin akan menyebabkan pembentukan kompleks kristal
violet-iodin yang tidak luntur pada bakteri gram positif. Bakteri Gram negatif tidak
mengikat kompleks Kristal violet-iodin secara kuat, sehingga dapat dilunturkan oleh
peluntur dan dapat diwarnai oleh safranin.
Perbedaan sifat bakteri gram positif dan gram negatif tidak mutlak tegas dan spesifik, tetapi
masih tergantung pada beberapa faktor yang dapat menyebabkan variasi dalam pengecatan
Gram. Sel bakteri gram positif yang berasal dari kultur yang cukup tua bias menunjukan
warna pink atau menyerupai gram negatif sehingga disarankan
2 tidak mengunakan kultur
bakteri yang berusia di atas rentang 16-30 jam. Selain itu beberapa kultur bakteri Bacillus
kadang berubah ubah sehingga kadang bias berupa gram negative dan terkadang berupa
gram positif. Metode kerja pewarnaan gram ditunjukan pada gambar 3.1 sebagai berikut :
 Gambar 3.1 Skema pewarnaan gram.

C. ALAT DAN BAHAN

1. Mikroskop cahaya
2. Crystal violet (Gram A)
3. Larutan iodine (Gram B)
3
4. Alkohol 96% (Gram C)
5. Safranin (Gram D)
6. Minyak immersI
7. Isolat murni bakteri
8. Gelas benda
9. Jarum ose
D. PROSEDUR KERJA
1. Buatlah pulasan bakteri di atas objek gelas, keringkan dan fiksasi dengan api.
2. Teteskan cat crystal violet (Gram A) dan diamkan 30 - 60 detik.
3. Buanglah sisa cat dan cuci sisanya dengan air mengalir.
4. Teteskan larutan iodine (Gram B) dan diamkan selama 1-2 menit.
5. Cuci dengan air mengalir, kemudian di decolorisasi (di beri larutan peluntur)
dengan alkohol (Gram C) (kira- kira 20 detik, hati-hati jangan sampai berlebihan
yang mengakibatkan kesalahan hasil).
6. Cuci dengan air mengalir, tambahkan larutan safranin (Gram D) selama 10-20 detik.
7. Cuci kembali dengan air mengalir, angin-anginkan dan amati di bawah mikroskop
dengan perbesaran kuat (1000x) menggunakan minyak immersi.
8. Gambar hasil-hasil pengecatan bakteri dengan diberi keterangan mengenai warna
sel bakteri yang menunjukkan sifat gram dan bentuk sel.

E. LEMBAR PENGAMATAN PEWARNAAN GRAM

BAKTERI HASIL (Gambar) Keterangan
GRAM NEGATIF GRAM POSITIF
Bacillus subtilis

Escherichia coli

Staphylococus
aureus

5
II. UJI BIOKIMIAWI
A. TUJUAN :
Mengidentifikasi dan mendeterminasi bakteri berdasarka sifat-sifat biokimiawinya.

B. DASAR TEORI :
Mikroba tumbuh dan berkembang biak dengan menggunakan berbagai bahan yang terdapat
di lingkungannya melalui proses metabolisme. Nutrien yang terdapat di lingkungan
sekelilingnya terdiri dari molekul sederhana seperti H 2S dan NH4+ atau molekul organik
yang kompleks seperti protein dan polisakarida dimetabolisme untuk memperoleh energi
dan prekursor untuk sintesis dinding sel, membran dan flagella. Selain energi juga
dihasilkan zat zat buangan yang kadang bersifat toksik. Untuk menjalankan proses
metabolism maka mikroba mengunakan berbagai enzim yang aktifitasnya dapat diamati
dan terkadang menjadi ciri khas dari mikroorganisme tersebut seperti bakteri aerob yang
menghasilkan enzim katalase. Skema metabolisme ini dapat diamati pada gambar 3.2
sebagai berikut ;

Gambar 3.2 Proses metabolisme

Pada identifikasi bakteri mula-mula diamati morfologi sel individual secara mikroskopik
6
dan pertumbuhannya pada bermacam- macam medium. Karena suatu bakteri tidak
dapat dideterminasi hanya berdasarkan sifat-sifat morfologinya saja, maka perlu diteliti
pula sifat-sifat biokimiawi dan faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhannya.
Percobaan-percobaan dalam uji biokimiawi mencakup berbagai uji untuk mengetahui
aktivitas metabolisme mikroba. Pengamatan aktivitas metabolisme diketahui dari
kemampuan mikroba untuk menggunakan dan menguraikan molekul kompleks, seperti zat
pati, lemak, protein dan asam nukleat. Selain itu pengamatan juga dilakukan pada molekul
yang sederhana seperti asam amino dan sakarida. Hasil dari berbagai uji ini digunakan
untuk pencirian dan identifikasi mikroba. Bebarapa uji metode biokimia yang penting
adalah sebagai berikut :
1. Uji Katalase
Sebagian besar bakteri aerob dan bakteri anaerob fakultatif mengunakan oksigen
dalam proses metabolismenya. Sebagian besar proses metabolisme ini akan
menghasilkan senyawa hidrogen peroksida (H2O2). Senyawa ini merupakan
senyawa radikal bebas yang bersifat toksik bagi pertumbuhan sel. Bakteri aerob dan
bakteri anaerob fakultatif mampu bertahan hidup karena memiliki enzim catalase
yang mampu memecah hydrogen peroksida menjadi senyawa air dan oksigen.
Kedua senyawa ini tidak berbahaya bagi proses metabolisme sel. Diduga bahwa
bakteri yang bersifat anaerob tidak dapat tumbuh dalam lingkungan yang
mengandung oksigen karena bakteri anaerob ini tidak memiliki enzim katalase.
Reaksi pengubahan hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen ditunjukan pada
gambar 3.3 sebagai berikut :

Gambar 3.3 Aktifitas katalase

2. Tes Pengunaan Sitrat
1. Beberapa bakteri usus mampu mengunakan asam sitrat sebagai sumber utama
karbon. Metode ini berguna untuk mengelompokan bakteri gram negative
berdasarkan kemampuannya mengunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.
Media yang sering digunakan untuk menganalisis adalah media Simmons Citrate
Agar yang mengandung indicator pH Brom Thymol Blue (BTB), asam sitrat dan
7
garam amonium. Bakteri yang tumbuh pada media ini akan mengunakan asam sitrat
sebagai sumber karbon dan mengubah garam ammonium menjadi ammonia.
Perubahan ini menyebabkan perubahan komposisi media. Perubahan ini dapat
dideteksi dengan indikator BTB yang akan bewana hijau pada pH di bawah 6,9 dan
akan berwarna biru pada pH di atas 7,6. Hasil positif dengan metode ini ditunjukan
 dengan media yang berubah warna menjadi biru. Hasil tes ditunjukan pada gambar
3.4 sebagai berikut :

Gambar 3.4 Hasil Tes Pengunaan Sitrat

3. Tes Dekarboksilase Lisin
Tes ini bertujuan untuk melihat organisme yang mengunakan asam amino lysin
sebagai sumber karbon. Mikroba yang mampu mengunakan lysin sebagai sumber
karbon biasanya memiliki enzim lysin dekarboksilase di dalam selnya. Ketika lysin
dikonsumsi maka akan menghasilnkan senyawa yang dapat meningkatkan pH dari
medium. Perubahan pH ini selanjutya diamati dengan indikator. Indikator yang
sering digunakan adalah Brom Cresol Purple (BCP). Indikator ini akan ungu pada
pH netral atau basa dan akan berubah warna menjadi kuning pada pH di bawah 5,2.
Pada percobaan dengan mikroba dengan mengunakan agar Lysin Iron Agar maka
mikroba harus mengunakan glukosa terlebih dahulu sehingga menyebabkan pH
8
medium menjadi turun di bawah 5,2 sehingga akan diamati perubahan media dari
unggu menjadi kuning setelah 24 jam inkubasi. Setelah pH medium turun maka
enzim lysin dekarboksilase diaktifkan oleh sel mikroba. Kultur selanjutnya
diinkubasi lagi selama 24 jam sehingga mikroba sekarang mengunakan lysin
sebagai sumber karbon dan merubah pH medium menjadi basa kembali. Setelah 48
akan diamati perubahan warna dari kuning menjadi unggu lagi. Kegagalan terjadi
 jika medium tidak berubah menjadi kuning dalam waktu 24 jam atau tidak berubah
menjadi unggu dalam waktu 48 jam. Hasil tes dekarboksilase lysin ditunjukan pada
gambar 3.5 sebagai berikut :

Gambar 3.5 Tes dekarboksilase lysin (kuning 24 jam, unggu 48 jam)

4. Produksi Hidrogen Sulfida (H2S)

Beberapa jenis bakteri seperti Proteus vulgaris mampu merubah asam amino
sistein.dan menghasilkan produk berupa hidrogen sulfide. Jika bakteri ini
ditumbuhkan dalam media yang mengandung garam besi maka akan terjadi reaksi
antara H2S dengan ion besi membentuk endapan iron sulfide yang berwarna gelap.
Proses produksi H2S ditunjukan pada gambar 3.6 sebagai berikut :

Gambar 3.6 Produksi Hidrogen Sulfida

.
C. ALAT DAN BAHAN
 2. Isolat murni bakteri dalam NA miring dan NB (nutrien cair)
3. Reagen untuk test katalase : 10% atau 30% H2O2
4. Bahan untuk test sitrat : Simmons Citrate Agar yang mengandung indikator
Brom Thymol Blue (BTB)
5. Bahan untuk test dekarboksilase lisin : media Lysin Iron Agar (LIA) yang
mengandung Lisin dan indikator Brom Cresol Purple (BCP)
6. Media Nutrien Agar (NA)
7. Media McConkey
8. Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
9. Jarum ose
10. Mikropipet

D. PROSEDUR KERJA
1. Test Katalase
Letakkan 1-2 tetes 10 % atau 30% H 2O2 pada gelas benda dan tambahkan 1 ose atau 2-3
tetes suspensi isolat murni bakteri Staphylococus aureus. Amati, katalase positif ditandai
oleh pembentukan buih seketika. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri).

2. Test Penggunaan Sitrat

Isolat murni bakteri diinokulasikan secara goresan zig zag menggunakan ose dan secara
tusukan menggunakan jarum inokulasi pada media Simmons Citrat Agar miring, kemudian
diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Perhatikan10perubahan warna dengan
melihat perubahan warna dari hijau menjadi biru. Bandingkan dengan kontrol (tanpa
inokulasi bakteri)

3. Test Dekarboksilase Lisin

Pada medium yang mengandung lisin (Lysin iron Agar) dan kontrol (media tanpa lisin)
diinokulasi secara tusukan dengan isolat murni bakteri, inkubasikan pada suhu 37 0C selama
24 jam diamati lalu dilanjutkan lagi dengan inkubasi pada suhu 37 0C selama 24 jam.
Positif jika terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning (24 jam) dan kembali ke
ungu (48 jam). Sementara pada kontrol (media tanpa lisin) tidak terjadi perubahan warna.

4. Test H2S dan Fermentasi Gula

Dengan menggunakan media TSIA, inokulasikan isolat murni bakteri secara goresan
menggunakan jarum ose dan secara tusukan menggunakan jarum inokulasi. Inkubasikan
selama 24 jam Pembentukan H2S ditunjukkan dengan terbentuknya endapan warna hitam.
Perubahan warna TSIA dari merah menjadi kuning menunjukkan adanya fermentasi gula
(glukosa, sukrosa, laktosa). Amati juga apakah terbentuk gas yang ditandai dengan
pecahnya media atau terangkatnya media ke atas. Bandingkan dengan kontrol (media tanpa
inokulasi bakteri)

E. HASIL PENGAMATAN UJI BIOKIMIAWI

JENIS UJI HASIL PENGAMATAN KETERANGAN

UJI KONTROL
11
UJI KATALASE
TES PENGUNAAN
SITRAT

TES
DEKARBOKSILAS
E LYSIN

TEST H2S DAN

FERMENTASI
GULA-GULA

12