LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI PERTANIAN
“Pengecetan Gran dan Pengujian KOH pada Bakteri”

Oleh :

NAMA : I MADE ADI SAPUTRA

NIM : D1B1 16 213
KELOMPOK : IV
KELAS : A

JURUSAN AGROTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS HALU OLEO
2016
 I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri

merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik,

bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air.

Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk

mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri.

Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian

mikrobiologi.

Metode KOH umumnya menghasilkan hasil yang sama dengan metode

pewarnaan gram tapi metode KOH tidak dapat menentukan sifat gram variabel.

Gram variabel dalam pewarnaan gram ditampakkan dengan beberapa sel berwarna

ungu dan lainnya merah jingga. Bakteri gram variabel yang diuji dengan KOH

dapat menghasilkan gram (+) atau (–) seperti kelompok Coryneform

(Corynebacterium, Arthrobacter dll). Dari kelompok ini beberapa terlihat gram

(+) dan yang lain gram (–) (berlendir sedikit) menggunakan metode KOH.

Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi bakteri. Dalam taksonomi

mikroba alat yang paling ampuh digunakan yaitu pewarnaan Gram (Gram Stain),

yang dapat digunakan untuk memisahkan anggota- anggota dominan bakteria ke

dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya. Bakteri gram positif

memiliki dinding sel yang lebih sederhana, dengan jumlah peptidoglikan yang

relatif banyak. Dinding sel bakteri gram-negatif memiliki peptidoglikan yang

lebih sedikit dan secara struktural lebih kompleks. Membran bagian luar pada
dinding sel gram-negatif mengandung lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang

terikat dengan lipid. Diantara bakteri patogen,yang menyebabkan penyakit,spesies

gram-negatif umumnya lebih berbahaya dibandingkan dengan spesies gram-

positif Oleh karna itu, penting adanya pelaksanaan praktikum pengujian guna

untuk mengidentifikasi dan mengetahui morfologi dari bakteri utamanya pada

bakteri yang bergram positif dan gram negative, dengan cara pewarnaan gram dan

uji KOH.

Seperti halnya mikroorganisme lainnya bakteri mempertahankan

kehidupannya melalui penyesuaian diri terhadap lingkungan demi kelanjutan

generasinya. Untuk itu, bakteri mampu merombak dan menggunakan bahan kimia

(dalam bentuk larutan) yang ada di lingkungannya sebagai sumber energi dan zat

pembangunan. Setiap jenis spesies bakteri mempunyai karakterisasi sifat biokimia

dan fisiologi yang khas. Sifat-sifat ini dapat dijadikan acuan dalam proses

identifikasi. Oleh karena itu dalam praktikum kali ini dilakukan pengujian KOH

untuk mengetahui karakteristik sifat dari bakteri.

1.2 Tujuan

Tujuan dari pelaksanaan praktikum ini untuk melihat bentuk bakteri dan

memepelajari cara pewarnaan.

 II. TINJAUAN PUSTAKA

Karakterisasi merupakan salah satu kegiatan yang dilakukan untuk

mengobservasi bakteri maupun kapang hasil isolasi (isolat). Kegiatan karakterisasi

dapat dilakukan berdasarkan sifat sitologi (bentuk sel, gerak atau motilitas, sifat

Gram dan endospora), sifat morfologi, dan sifat fisiologi. Uji sifat morfologi

mencakup sifat-sifat koloni, seperti ukuran, bentuk, warna dan tepian, sedangkan

uji sifat fisiologi diantaranya uji hidrolisis pati, hidrolisis lemak, hidrolisis protein

dan uji katalase (Subandi, 2009).

Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk

membedakan bakteri apakah gram positif atau gram negatif, bakteri dicampur

dengan tetesan air steril pada gelas objek, kemudian disebarkan ditengah gelas

obyek sehingga membentuk lapisan tipis dan difiksasi. Dengan kristal violet

olesan bakteri digenangi selama dua menit, lalu dicuci dengan air mengalir, dan

dikering anginkan. Diberi yodium selama dua menit, dicuci dengan air mengalir

dan dikeringanginkan. Selanjutnya diberi larutan pemucat yaitu alkohol 95%, tetes

demi tetes sampai zat warna ungu tidak terlihat lagi, lalu dicuci pada air mengalir

dan dikeringanginkan. Kemudian dogenangi lagi dengna safranin selama 30 detik,

lalu dicuci dan dibiarkan kering diudara. Warna merah pada olesan bakteri

menujukkan bakteri gram negatif dan jika warna ungu menunjukkan bakteri gram

positif (Michael, 2008).

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar yaitu Gram positif dan

bakteri Gram negatif. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama
didasarkan pada perbedaan struktur, sifat kimia, dan fisik dinding sel bakteri.

Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, seorang ilmuwan Denmark

bernama Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada

tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella

pneumoniae (Qiqi, 2008).

Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen

selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen.

Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler

maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan

sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana

menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai serangkaian

larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan

yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Sugiarti, 2009).

Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat

warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan

mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara

bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal

(counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri

gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna

untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur

dinding sel mereka (Moaledj, 2008).

Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna

ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri
adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram

positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam

persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada

praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga

memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel

dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif

sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan

alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun

sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu (Yayan,

2013).

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat

macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial

dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik

lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau

olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur

pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-

bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan

struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan

bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan

endospora, flagella dan pengecatan kapsul (Bailey 2007).

 III. METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Tempat dan Waktu

Kegiatan praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Agroteknologi Unit

Fitopatologi Fakultas Pertanian Universitas Halu Oleo. Pada hari Kamis, 3

November 2016 pukul 08.00 WITA sampai selesai.

3.2 Bahan dan Alat

Adapun bahan pada praktikum ini yaitubiakan murnu, zat warna, larutan

KOH 3%.

Alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah kaca benda, jarum ose,

pipet, lampu spritus, mokroskop.

3.3 Prosedur Kerja

Prosedur kerja kali ini adalah sebagai berikut:

A. Pewarnaan Sederhana

1. Membuat olesan bakteri pada kaca benda.

2. Difiksasi

3. Diberi zat warna utama yaitu amonium oksalat kristal violet (berupa

larutan selama 1-2 menit , kemudian dicuci dengan air mengalir.

4. Diberi mordan yaitu larutan yodium selama 1-2 menit , dicuci dalam air

mengalir.

5. Teteskan larutan alkohol aseton sedikit demi sedikit , sehingga larutan yang

mengalir tadi berwarna menjadi tidak berwarna.

 6. Teteskan zat pewarna penutup yaitu larutan berwarna merah atau karbol

selama 2-3 menit.

7. Cuci dengan air mengalir, dikering anginkan.

8. Diamati dibawah mikroskop dengan minyak inersi.

9. Gambar bentuk bakteri dan warnanya.

B. Uji Larutan KOH

1. Ambil satu ose biakan bakteri Bacillus dan campurkan dengan 2 tetes

larutan KOH3%, di atas gelas objek.

2. Aduk secara merata dengan jarum ose, tarik jarum ose keatas gelas objek

dan amati pembentukanlendir. Jika terbentuk lendir mengidinkasikan

bakteri Gram-negatif, jika tidak berlendir mengindikasikan bakteri

Gram_positif

3. Lakukan hal yang sama (prosedur 1 dan 2) untuk isolat-isolat bakteri

lainnya.
 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

Hasil dari praktikum ini adalah :

Hasil Pengamatan
No. Kode isolat Uji KOH 3%
Keterangan
Reaksi Gram Bakteri Gram
1. 5529-A Negatif Positif Tidak Berlendir
2. ST216 Negatif Positif Tidak Berlendir
3. AGT- D 015 Negatif Positif Tidak Berlendir

4.2 Pembahasan

Metode KOH umumnya menghasilkan hasil yang sama dengan metode

pewarnaan gram tapi metode KOH tidak dapat menentukan sifat gram variabel.

Gram variabel dalam pewarnaan gram ditampakkan dengan beberapa sel berwarna

ungu dan lainnya merah jingga. Bakteri gram variabel yang diuji dengan KOH

dapat menghasilkan gram (+) atau (–) seperti kelompok Coryneform

(Corynebacterium, Arthrobacter dll). Dari kelompok ini beberapa terlihat gram

(+) dan yang lain gram (–) (berlendir sedikit) menggunakan metode KOH.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi

dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat

bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh

komposisi dinding selnya. Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif

adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara

dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan

penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian

alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran

tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri

negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Berdasarkan hasil praktikum yang dilakukan dapat diketahui bahwa pada

isolat 5529-A, ST216, AGT-D 015 memiliki reaksi Gram positif dan bakteri

Gram negatif, hal ini dapat diketahui dengan melihat suspensi (campuran KOH

dengan bakteri) saat melakukan pengujian dengan KOH terlihat tidak adanya

lendir pada suspensi tersebut. Sedangkan pada isolat Ralstonia reaksi Gramnya

adalah negatif dan bakteri Gramnya adalah positif, hal ini dapat diketahui dengan

melihat suspensi (campuran KOH dengan bakteri) saat melakukan pengujian

dengan KOH tidak terlihat adanya lendir pada suspensi tersebut. Hasil pengujian

diatas menunjukkan bahwa metode KOH umumnya menghasilkan hasil yang

sama dengan metode pewarnaan gram tapi metode KOH tidak dapat menentukan

sifat gram variabel. Dari uraian diatas dapat dinyatakan bahawa penentuan sifat

gram dengan KOH 3% (disebut KOH string test) memiliki hasil yang sama

dengan pewarnaan gram.

 V. KESIMPULAN

5.1. Kesimpulan

Setelah pelaksanaan kegiatan ini kita bisa menyimpulkan bahwa reaksi

atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Perbedaan

dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding

selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran

sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari

dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan

hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi

peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan

peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

5.2. Saran

Saran saya pada pratikum ini yaitu sebaiknya pratikan bisa lebih berhati-

hati dalam melakukan pratikum agar supaya didapatkan hasil yang maksimal dan

tidak menimbulkan kerusakan pada alat yang digunakan.

 DAFTAR PUSTAKA

Bailey and Scott’s. 2007. Diagnostic Microbiology 12th edition. Mosby Elsevier :
Houston.

Michael. 2008. Biologi untuk SMA kelas X Semester 1. Penerbit Erlangga :

Malang. . Winarni, Endang Widi. 2007. Biologi 3 Esis. Jakarta.

Moaledj, K. 2008. Comparison Of Gram Staining and Alternate Methods, KOH

Test and Aminopeptidase Activity in Aquatic Bacteria. Journal of
Microbiological Methods, Vol 5 (1) 303-310.

Subandi. 2009. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Gunung Djati Press,Bandung.

Sugiarti. 2009. Bakteri Gram dan Pewarnaannya.

http://rudyregobiz.wordpress.com/bakteri-gram-dan-pewarnaannya.html.
Diakses 5 November 2016.

Qiqi. 2008. Kumpulan Hasil-hasil Penelitian Mikroba. Pusat Penelitian Mahluk

Hidup. Jakarta.

Yayan. 2013. Penentuan Bakteri Positif dan Bakteri Naegatif. Jurnal Mikrobiotek,
Vol 2 (3) 20-25.