BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri merupakan
mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna
atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup
sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri. Ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk
mempernudah proses identifikasi bakteri.

Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati
morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah dengan
pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk
mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain sifat gram,
bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram positif dan gram negatif, berdasarka
sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
denmark hans Christian gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk
karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan pewarnaan diferensial karena pewarnaan ini
mampu mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi dua
yaitu Gram negatif dan Gram positif.

Selain dengan pewarnaan atau pengecatan, identifikasi bakteri dapat berupa melihat
morfologi koloni dan uji biokimia bakteri. Morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, warna
koloni,dll. Semantara uji biokimia dilakukan untuk memastikan jenis/spesies bakterinya. Oleh karena itu,
dilakukan praktikum ini untuk mengetahui teknik pewarnaan bakteri, morfologi koloni, dan uji biokimia
sehingga dapat mempernudah untuk isdentifikasi bakteri

Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri
yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2007) . Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri
sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui
serangkaian pengecatan.

Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan baik secara langsung
(bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan
tersebut ialah untuk :

1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi.

2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.

1
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.

4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik

dan kimia yang ada akan dapat diketahui (Suriawiria, 1999).

Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple stain), pewarnaan diferensial

(differential strain), dan pewarnaan khusus (special strain) (Pratiwi, 2008). Pada pewarnaan sederhana

hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan

sekelilingnya. Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering

digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal

bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral (Lay, 1994).

Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan pewarnaan
tahan asam. Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan
paling luas digunakan untuk bakteri. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi dua
kelompok, salah satu diantaranya bakteri gram positif dan bak

1.2 Rumusan masalah

a. Apa yang dimaksud dengan bakteri ?

b. Apa yang dimaksud dengan perwarnaan bakteri ?

c. Apa – Apa saja macam – macam pewarnaan bakteri ?

d. Bagimana prosedur kerja pewarnaan bakteri

2
 BAB 2

Landasan teori

Pewarnaan Gram dilakukan untuk mengelompokkan bakteri menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif dan
bakteri Gram negative. Pada pewarnaan Gram, hasil yang didapat akan ditentukan dari komposisi
dinding sel bakteri. Pada pewarnaan Gram ini, reagen yang digunakan ada 4 jenis, yaitu Kristal violet,
iodine, alkohol dan safranin. Bakteri Gram positif akan mempertahankan warna ungu dari kristalviolet
sehingga ketika diamati dengan mikroskop akan menunjukkan warna ungu sedangkan bakteri Gram
negative tidak dapat mempertahankan warna ungu dari Kristal violet tetapi zat warna safranin dapat
terserap pada dinding sel sehingga akan memperlihatkan warna merah. Uji biokimia untuk gram negative
adalah uji oksidasi sedangkan untuk gram positif dapat dilakukan pewarnaan endospora (Pratita, 2012) .

Pewarnaan gram merupakan salah satu metode untuk mengetahui morfologi bakteri, yang bermanfaat
untuk mengetahui apakah biakan bakteri masuk dalam golongan gram positif atau gram negative. Bakteri
gram negative memiliki ciri – cirri tidak dapat menahan zat warna setelah dicuci dengan alkohol 95 %
selama 5 sampai 10 detik (Samsundari, 2006)

Salah satu pewarnaan yang sering digunakan untuk mengindentifikasi bakteri adalah perwarnaan Gram.
Berdasarkan pewarnaan Gram, bakteri dibagi menjadi dua golongan, tergantung dari reaksi dinding sel
terhadap tinta safranin atau Kristal violet. Bakteri yang tetap berwarna ungu dengan pewarnaan oleh
Kristal violet disebut bakteri Gram positif, sedangkan bakteri yang warna ungunya hilang jika dibilas
dengan alkohol, tetapi tetap berwarna merah muda karena menahan warna merah safranin disebut
bakteri Gram negative ( James, 2008 ) .

Pewarnaan Gram digunakan untuk mengetahui morfologi sel bakteri serta untuk membedakan bakteri
gram positif dan gram negative. Perbedaan warna pada bakteri gram positif dan gram negative
menunjukkan bahwa adanya perbedaan struktur dinding sel antara kedua jenis bakteri tersebut. Bakteri
gram positif memiliki struktur dinding sel dengan kandungan peptidoglikan yang tebal sedangkan bakteri
gram negative memiliki sturktur dinding sel dengan kandungan lipid yang tinggi (Fitri, 2011).

Ditinjau dari komponen penyusun dinding sel bakteri gram positif relative lebih sederhana berbanding
bakteri gram negative yaitu terdiri dari dua sampai tiga lapis membrane sitoplasma yang tersusun dari
asa teikhik dan asam teikhouronik berupa polimer yang larut dalam air, sedangkan dinding sel bakteri
negative lebih kompleks dan lebih tebal, tersusun dari peptidoglikon, lipoprotein dan lipopolisakarida,
sehingga dinding sel bakteri gram positif lebih permeable terhadap senyawa yang bersifat hidrofil
dibandingkan sel bakteri gram negative (Fatimah, 2006).

3
Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang lebih sederhana, dengan jumlah peptidoglikan yang
relative banyak. Dinding sel bakteri gram negative memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara
structural lebih kompleks. Membrane bagian luar pada dinding sel gram negative mengandung
lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang terikat dengan lipid. Diantara bakteri patogen, yang
menyebabkan penyakit, spesies gram negative umumnya lebih berbahaya dibandingkan dengan spesies
gram positif ( Campbell, 2003 ).

Kelompok bakteri gram negative ditandai dengan sel bakteri yang berwarna merah saat pengamatan
secara mikroskopik. Warna merah tersebut disebabkan karena hilangnya pewarna Kristal violet pada
waktu dekolorisasi dengan alkohol kemudian sel bakteri menyerap pewarna merah yaitu safranin.
Bakteri gram negative mengandung lipid lebih rendah sehingga dinding sel bakteri akan lebih mudah
terdehidrasi akibat perlakuan dengan alkohol. Dinding sel yang terdehidrasi menyebabkan daya
permeabilitasnya berkurang sehingga zat warna ungu Kristal keluar dari sel kemudian sel akan menyerap
safranin (Jayanti, 2010).

Respon hambatan mikroba gram positif lebih kuat dibandingkan mikroba gram negative. Hal ini
disebabkan oleh perbedaan komponen penyusun dinding sel antara mikroba gram pos

4
 BAB 3

Metode penelitian

Pewarnaan Sederhana

a) Dibersihkan kaca preparat dan cover glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu
dibersihkan lagi dengan tisu. Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.

b) Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas kaca preparat.

c) Dikeringkan kaca preparat dengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda.

d) Difiksasi dengan dipanaskan diatas nyala lampu bunsen.

e) Didinginkan lalu diteteskan larutan zat warna crystal violet sebanyak 1 atau 2 tetes, dan dibiarkan
selama 1 atau 2 menit.

f) Dicuci dengan aquades sampai sisa-sisa zat warna tercuci seluruhnya.

g) Dikeringkan dengan diangin-anginkan.

h) Diamati dengan menggunakan mikroskop.

2. Pewarnaan Negatif

a) Dibersihkan object glass dan cover glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak.

b) Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.

c) Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas object glass.

d) Difiksasi dengan cara dipanaskan diatas nyala lampu bunsen.

e) Diteteskan larutan zat warna tinta cina diatas object glass hingga merata.

f) Dikeringkan dengan diangin-anginkan.

g) Diamati dengan menggunakan mikroskop.

3. Pewarnaan Gram

5
a) Dibersihkan object glass dan cover glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu
dibersihkan lagi dengan tisu.

b) Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.

c) Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas object glass.

d) Dikeringkan object glassdengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda.

e) Difiksasi dengan dipanaskan diatas lampu bunsen.

f) Didinginkan, lalu diteteskan zat warna crystal violet sebanyak 2 atau 3 tetes dan dibiarkan selama 1
menit.

g) Dicuci dengan aquades sampai sisa-sisa zat warna tercuci seluruhnya.

h) Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan.

i) Diteteskan larutan lugol dan dibiarkan selama 1 menit.

j) Dicuci dengan aquades dan dikeringkan dengan diangin-anginkan.

k) Dicuci dengan alkohol selama 30 detik.

l) Diteteskan larutan zat warna safranin sebanyak 2 atau 3 tetes.

m) Dicuci dengan aquades.

n) Diamati dengan menggunakan mikroskop.

4. Pewarnaan Spora

a) Dibersihkan object glass dan cover glass dengan menggunakan alkohol sampai bebas lemak, lalu
dibersihkan lagi dengan tisu.

b) Difiksasi diatas nyala lampu bunsen.

c) Diambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri dan diratakan diatas object glass.

d) Dikeringkan object glass dengan diangin-anginkan hingga terbentuk noda.

e) Ditutup object glass dengan kertas saring.

f) Diteteskan malachite green sebanyak 2 atau 3 tetes.

g) Dilewatkan diatas api lampu bunsen hingga terlihat uap, jangan sampai zat warna mendidih dan
mengering.

h) Didiamkan 1 menit lalu dibuang kertas saring.

6
i) Dicuci dengan aquades dan dibiarkan selam 30 detik.

j) Diteteskan safranin dan dibiarkan selama 30 detik.

k) Diangin-anginkan hingga zat warna kering.

l) Diamati dengan menggunakan mikroskop.

5. Cat Gram A

a) Tobang kristal violet sebanyak 2 gram menggunakan kertas timbang pada neraca

b) Amonium oksalat di timbang sebanya 0,8 gram

c) Kristal violet dan amonium oksalat di campur ke dalam mortir dan dihaluskan menggunakan
stampler

d) Tambahkan 80 ml aquadest dan 20 ml alkohol 95% kedalam mortir

e) Aduk hingga merata

f) Masukkan larutan ke dalam botol reagen menggunakan corong yang telah dilapisi kertas saring

g) Tutup, beri label, dan simpan botil reagen

h) Keringkan kertas saring

6. Cat Gram B

a) Timbang sebanya 1 gram iodium menggunakan neraca yang telah dilapisi kertas timbang

b) Timbang sebanyak 2 gram kalium iodida menggunakan neraca yang telah dilapisi kertas timbang

c) Campurkan iodium dan kalium iodida ke dalam mortir dan haluskan menggunakan stampler

d) Tambahkan 300 ml aquadest ke dalam mortir

e) Aduk hinggal merat

f) Masukkan larutan ke dalam botol reagen menggunakn corng yang telah di lapisi kertas saring

g) Tutup, beri label, dan simpan botol reagen

7
 BAB 4

PEMBAHASAN

A. Definisi Bakteri

Bakteri adalah mikroorganisme yang sangat sederhana yang tidak bernukleus dan sifatnya berbeda
dengan organisme yang mempunyai inti sel. selain itu bakteri merupakan organisme yang sangat kecil
(yang berukuran mikroscopis) akibatnya pada mikroskop tidak tampak jelas dan sukar untuk melihat
morfologinya maka dari itu dilakukan pewarnaan bakteri yang biasa disebut pengenceran baketri. pada
umumnya larutan-larutan zat warna yang digunakan adalah larutan encer yang lebih dari satu persen.

B. Pewarnaan Bakteri

Pewarnaan bakteri pada umumnya bertujuan untuk mempermudah dalam pengamatan morfologi
bakteri dengan bantuan mikroskop. Bakteri umumnya tidak berwarna dan hampir tidak terlihat karena
kurang kontras dengan air dimana mereka mungkin berada. Pewarnaan sangat dibutuhkan untuk melihat
bakteri dengan sangat jelas baik untuk pengamatan intraseluler maupun morfologi keseluruhan.
Pewarnaan terhadap bakteri secara garis besar, dibagi menjadi dua, yaitu:

1. Pewarnaan bakteri hidup

Pewarnaan bakteri hidup dilakukan dengan menggunakan bahan warna yang tidak toksis tetapi jarang
dikerjakan karena bakteri hidup sukar menyerap warna. Pewarnaan bakteri hidup dilakukan untuk
melihat pergerakan bakteri, serta pemeriksaannya dilakukan dengan menggunakan tetes gantung
(hanging drop)

2. Pewarnaan bakteri mati

Pewarnaan terhadap bakteri yang telah dimatikan disebut fixed state. Pewarnaan bakteri mati bertujuan
untuk melihat struktur luar bahkan struktur dalam bakteri, memperjelas ukuran bakteri dan melihat
reaksi bakteri terhadap pewarna yang diberikan sehingga dapat diketahui sifat-sifat fisik dan kimia dari
bakteri tersebut.

C. Macam - Macam Pewarnaan bakteri

1. Pewarnaan Sederhana

8
Pewarnaan sederhana adalah pewarnaan yang menggunakan pewarna tunggal. Pewarna tunggal yang
biasanya digunakan dalam pewarnaan sederhana adalah Methylene Blue, Basic Fuchsin, dan Crystal
Violet . Semua pewarna tersebut dapat bekerja dengan baik pada bakteri karena bersifat basa dan
alkalin (kromoforiknya bermuatan positif), sedangkan sitoplasma bakteri bersifat basofilik (suka terhadap
basa) sehingga terjadilah gaya tarik antara komponen kromofor pada pewarna dengan sel bakteri, hal
tersebut menyebabkan bakteri dapat menyerap pewarna dengan baik. Pewarnaan sederhana bertujuan
untuk memberikan kontras antara bakteri dan latar belakang. Pewarnaan sederhana dilakukan ketika
kita ingin mengetahui informasi tentang bentuk dan ukuran sel bakteri. Gambar pewarnaan sederhana
yang dilihat dibawah mikroskop

2. Pewarnaan Negatif

Pewarnaan Negatif adalah pewarnaan yang menggunakan pewarna asam seperti Negrosin, Eosin, atau
Tinta India sebagai pewarna utama. Pewarnaan negatif dilakukan pada bakteri yang sukar diwarnai oleh
pewarna sederhana seperti spirochaeta. Pewarnaan negatif bertujuan untuk memberi warna gelap pada
latar belakang dan tidak memberi warna pada sel bakteri. Hal tersebut dapat terjadi karena pada
pewarnaan negatif, pewarna yang digunakan adalah pewarna asam dan memiliki komponen kromoforik
yang bermuatan negatif, yang juga dimiliki oleh sitoplasma bakteri. Sehingga pewarna tidak dapat
menembus atau berpenetrasi ke dalam sel bakteri karena negatif charge pada permukaan sel bakteri.
Pada pewarnaan negatif ini, sel bakteri terlihat transparan (tembus pandang). Gambar pewarnaan
negative dilihat dari mikroskop

3. Pewarnaan Diferensial

Pewarnaan Diferensial adalah teknik pewarnaan yang dilakukan untuk mengetahui perebedaan antara
sel-sel dari tiap-tiap mikroba. Pewarnaan diferensial menggunakan dua pewarna atau lebih. Pewarnaan
diferensial antara lain meliputi :

a. Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram digunakan untuk membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif
berdasarkan sifat fisik dan kimia dinding sel bakteri. Pewarnaan gram menggunakan pewarna utama
Kristal Violet dan pewarna tandingan Safranin.Keberhasilan metode ini sangat bergantung pada dinding
sel, maka dari itu metode ini tidak dapat dilakukan pada bakter

9
 BAB 5

PENUTUP

PENUTUP

A. Kesimpulan

Berdasarkan pembahasan materi diatas dapat disimpulkan bahwa :

1. Bakteri adalah mikroorganisme yang sangat sederhana yang tidak bernukleus dan sifatnya berbeda
dengan organisme yang mempunyai inti sel.

2. Pewarnaan bakteri pada umumnya bertujuan untuk mempermudah dalam pengamatan morfologi
bakteri dengan bantuan mikroskop.

3. Teknik perwarnaan bakteri yaitu Pewarnaan sederhana, Pewarnaan Negatif, Pewarnaan Diferensial,
dan Pewarnaan Khusus.

B. Saran

Saran dari makalah ini kepada pembaca adalah agar pembaca tidak hanya mengacu pada materi
didalam makalah ini melainkan mencari refrensi lain diluar makalah .

10