LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PEWARNAAN GRAM
DAN PEMERIKSAAN JAMUR

ANGGOTA
DIAN KHAIRUNNISA (171501157)
IRNANDA LESTARI (171501137)
MUHAMMAD MULIANDI BANDASO (171501014)
SRI WAHYUNI (171501175)

KELOMPOK/HARI : 1 / SELASA
TGl PERCOBAAN : 20 FEBRUARI 2018
ASISTEN : ALDO JOSUA SIMANJORANG

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2018
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikroorganisme dapat dilihat dengan mikroskop biasa, tanpa diwarnai;

yakni dengan cara-cara khusus. Cara tersebut misaInya dengan cara tetes
bergantung, menggunakan kondensor medan gelap, dan lainnya. Tetapi
pengamatan yang demikian (tanpa pewarnaan) lebih sulit dan tidak dapat dipakai
untuk melihat bagian-bagian sell dengan seksama. Hal ini karena umumnya sel
mikroorganisme bersifat transparan atau semi transparan (Waluyo, 2010).
Mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak transparan (tembus
pandang) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa. Hal ini karena sitoplasma
sel mikrobe memiliki indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias
lingkungannya yang bersifat cair dan mikrobe tidak mengadsorbsi atau
membiaskan cahaya. Kontras antara sel dan latar belakangnya (medium) dapat
diperjelas dengan cara mewarnai sel-sel mikrobe tersebut dengan zat-zat warna
(Waluyo, 2010).
Zat warna menyerap dan membiaskan cahaya sehingga kontras
mikroorganisme dengan lingkungannya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat
pewarna memungkinkan pengamatan struktur spora, flagella. dan bahan inklusi
yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Selain itu, dengan pewarnaan dapat
menunjukkan distribusi dan susunan kimia bagian-bagian sel, membedakan
mikrobe satu dengan yang lain, menentukan pH, dan potensial oksidasi reduksi
ekstraseluler dan intraseluler (Waluyo, 2010).
Pewarnaan Gram memilahkan bakteri menjadi 2 kelompok, yakni bakteri
Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif ungu yang disebabkan
kompleks warna kristal violet-Iodlum tetap dipertahankan meskipun diberi larutan
pemucat. Sedangkan bakteri Gram negatif benNama merah karena kompleks war
na tersebut larut sewaktu pemberian Iarutan pemucat dan kemudian mengambil
zat warna kedua yang berwarna merah. Perbedaan basil dalam pewarnaan tersebut
disebabkan perbedaan struktur, terutama dinding sel kedua kelompok bakteri
tersebut. Karena kemampuannya membedakan suatu kelompok bakteri tertentu
dengan kelompok Iainnya, pewarnaan Gram juga disebut pewarnaan diferensial
(Waluyo, 2010).

1.2 Prinsip Percobaan

1.2.1 Pengecatan Gram
Daya ikat dari sifat dinding sel dan membrane luar dari suatu bakteri
terhadap larutan zat warna yang disebabkan sifat kepolarannya (sifat kepolaran
bakteri tersebut).Perbedaan warna yang terjadi pada bakteri Gram (+) dan bakteri
Gram (-) disebabkan oleh perbedaan struktur pada dinding selnya. Bakteri gram
positif tidakmengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu atau violet
dan pada tahap akhirpengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif
mengalami dekolorisasi oleh alkoholdan pada tahap akhir pengecatan terwarnai
menjadi merah oleh safranin.Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel.
Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid)kemungkinan tercuci oleh alkohol,
sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarnamerah. Bakteri gram
positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal.Setelah
pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasioleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru.

1.2.2 Pemeriksaan Jamur

Morfologi jamur pada media pertumbuhan dapat diamati secara visual
maupun dibawah pengamatan mikroskop. Jamur merupakan organisme yang
memerlukan senyawa organik untuk nutrisinya. Berdasarkan sifat jamur yang
hanya dapat hidup ditempat lembab maka untuk mengamati cahaya jamur
dibutuhkan penambahan aquadest lalu dihomogenkan dengan jamur yang diamati
kemudian dilakukan dengan cara fiksasi agar jamur dapat menempel pada objek
glass dan dapat diamati dibawah mikroskop.

1.3 Tujuan Percobaan

1) Untuk membedakan antara bakteri gram positif dan gram negatif.
2) Untuk mengetahui prosedur dalam pengecatan gram.
3) Untuk mengathui prosedur kerja dari pemeriksaan jamur.
 4) Untuk mengetahui spesies jamur pada sampel
5) Untuk mengetetahui morfologi jamur yang terdapat pada sampel secara
makroskopik dan mikroskopik.

1.4 Manfaat Percobaan

1) Agar praktikan dapat membedakan antara bakteri gram positif dan gram
negatif.
2) Agar praktikan mengetahui prosedur dalam pengecatan gram.
3) Agar praktikan mengetahui prosedur kerja dari pemeriksaan jamur.
4) Agar praktikam mampu membedakan bentuk dan morfologi jamur.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengecatan Gram

Bakteri merupakan mikrobia prokariotik uniselular, termasuk klas
Schizomycetes, berkembang biak secara aseksual dengan pembelahan sel. Bakteri
tidak berklorofil kecuali beberapa yang bersifat fotosintetik. Cara hidup bakteri
ada yang dapat hidup bebas, parasitik, saprofitik, patogen pada manusia, hewan
dan tumbuhan. Habitatnya tersebar luas di alam, dalam tanah, atmosfer (sampai +
10 km diatas bumi), di dalam lumpur, dan di laut. Bakteri mempunyai bentuk
dasar bulat, batang, dan lengkung. Bentuk bakteri juga dapat dipengaruhi oleh
umur dan syarat pertumbuhan tertentu. Bakteri dapat mengalami involusi, yaitu
perubahan bentuk yang disebabkan faktor makanan, suhu, dan lingkungan yang
kurang menguntungkan bagi bakteri. Selain itu dapat mengalami pleomorfi, yaitu
bentuk yang bermacam-macam dan teratur walaupun ditumbuhkan pada syarat
pertumbuhan yang sesuai. Umumnya bakteri berukuran 0,5-10 µ. (Sumarsih,
2003).
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula
diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa,
salah satunya adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah
satuprosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak
bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi selantara lain sifat gram,
bentuksel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah suaatu
metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar,
Gram positifdan gram negatif, berdasarkansifatkimiadanfisikadindingselmereka,
metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans
Christian gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan
majemuk karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna.Dan pewarnaan
diferensia lkarena pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau membedakan
bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu Gram negative dan
Gram positif. Bakteri gram negative merupakan bakteri yang kehilangan
kompleks ungu Kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian
terwarnai dengan pewarnaan tandingan, yaitu safranin sehingga sel-sel tampak
berwarna merah muda pada akhir pewarnaan. Sedangkan untuk bakteri gram
positif bakteri dapat menahan kompleks pewarna primer ungu Kristal iodium dan
sel bakteri berwarna biru gelap atau ungu (Ulfah, 2011).
Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membrane sel
selapis. Karena bakteri Gram positif bakteri yang dapat menahan kompleks
pewarnaan primer ungu Kristal iodium sampai akhir prosedur dansel bakteri
berwarna biru gelap atau ungu. Sedangkan bakteri gram negative merupakan
bakteri yang kehilangan kompleks ungu Kristal pada waktu pembilasan dengan
alcohol namun kemudian terwarnai dengan pewarnaan tandingan, yaitu safranin
sehingga sel-sel tampak berwarna merah muda pada akhir pewarnaan dan
mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membrane sel
kegunaannya yaitu, untuk melihat atau mengamati bentuk-bentuk sel bakteri dan
memberikan sifat reaksi pewarnaan bakteri yang dapat diketahui dengan melihat
apakah termasuk gram negatif (berwarnamerah) atau gram positif (berwarnabiru).
(Ulfah, 2011).
Prinsip pewarnaan Gram terkait dengan pengikatan pewarna (CV (ungu-
berwarna) dan safranin (berwarna merah muda) yang mengandung kation positif
pada komponen ccllular di sel bakteri yang memiliki anion bervalensi negatif. "Ia
mempertahankan pewarna berwarna. (ungu atau merah muda) di dalam sitoplasma
sel membuat perbedaan bctWec-n dua kelompok bakteri, yaitu (gram positif
(ungu) dan Gram negatif (merah muda). llin adalah teori dasar pewarnaan gram
yang memainkan aturan dalam membedakan bakteri berdasarkan warna Namun
reaksi penghasil warna ini sangat bergantung pada dua pasangan utama dalam
proses: yodium dan dinding sel tebal iodium pada dasarnya bertanggung jawab
untuk menjaga cv di balik dinding sel karena pembentukan molekul besar.
Dinding memiliki peran yang berbeda untuk dimainkan pada organisme yang
berbeda, seperti dinding sel tebal di bakteri Gram positif, yang dikerutkan dengan
erat dengan lebih banyak molekul protein di dalamnya dibandingkan dengan
dinding sel tipis bakteri gram negatif, mengandung lebih banyak lemak daripada
protein. Hasil dari. Kerusakan dinding sel pada bakteri Gram negatif yang
disebabkan oleh dekolorizer sangat kuat dan luas, sehingga semua kompleks CV-
iodine dapat dicuci dengan lebih mudah setelah aplikasi decolorizer. prinsip dasar
reaksi Gram terbentuk karena pengikatan reagen Gram dan bahan nuklir sel
bakteri tetap berada di atas semua argumen. Iniadalah alasan bahwa semua sel lain
(tanaman, jamur, manusia, dan anitnal) tidak boleh dianggap Gram positif atau
Gram negatif berdasarkan reagen yang mereka simpan di dalam sel yang
berwarna ungu atau merah jambu. (Subhash, 2009)
Genus Corynebacterium meliputi Corynebacterium diphtheriae,
penyebabnya difteri dipotret toksin-toksin, serta beberapak omensals manusia
yang tidak berbahaya. Bacillus adalah bakteri pembentuk spora besar, terutama
berasal dari tanah; Namun antraks disebabkan oleh Bacillus anthracis.Listeria
monocytogenes menyebabkan berbagai jenis pada inleksi pada populasi seperti
bayi baru lahir, wanita hamil, dan imun yang dikompromikan. (Harvey, 2007)
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikrobe dinamakan
pewarnaan positif. Dalam prosedur ini dapat digunakan zat warna basa yang
bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya,
pewarnaan negatif latar belakang di sekeliling mikrobe diwarnai untuk
meningkatkan kontras dengan mikrobe yang tidak berwarna. (Waluyo,2010)
Zat warna atau cat biologi adalah persenyawaan organik yang mempunyai
gugusan kromatofor dan gugusan auxokrom yang terikat dalam suatu cincin
benzena. Gugusan kromatofor merupakan gugusan yang dapat memberikan warna
pada molekul cat, sedangkan auxokrom adalah zat yang dapat memberikan
disosiasi elektrolitelektrolit pada molekul cat sehingga cat bersifat lebih mudah
bereaksi. Gugusan kromatofor yang mempunyai kemampuan menghasilkan warna
antara lain gugus azo (-N=N-), nitroso (-N=O-), tio (=C=S), nitro (-NO). Sedang
gugus auxokrom antara lain -NR2, -NH2, -OH, -OCH3, I, -Br, -Cl.
(Waluyo,2010)
Tujuan dari pewarnaan adalah
 Memudahkan melihat mikrobe dengan mikroskop;
 Memperjelas ukuran dan bentuk mikrobe;
 Melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri, seperti dinding sel dan
vakuola serta menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia khas dari bakteri.
(Waluyo,2010)
 Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel dinamakan
pewarnaan khusus, sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan
mikroorganisme dinamakan pewarnaan diferensial. Pewarnaan Gram merupakan
contoh pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok Gram
positif dan Gram negatif. Pewarnaan diferensial yang lain adalah pewarnaan
Ziehl-Neelsen yang memilahkan bakteri menjadi kelompok tahan asam dan
kelompok tidak tahan asam. (Waluyo,2010)
Ada berbagai macam teori yang menjelaskan bagaimana mekanisme
pewarnaan mikroorganisme. Secara garis besar ada dua macam mekanisme yakni:
 Berdasarkan atas Mekanisme Pengikatan Kimia
Mekanisme ini menurut Ehrlich, Mayer, Heiden-Hain, Giemsa, dan
lain-lain. Menurut teori pengikatan kimia, jaringan sel terdiri atas gugusan
bersifat basa dan gugus yang bersifat asam; yang akan bereaksi dengan gugus
asam atau gugus basa zat warna (konstituen sel merupakan protein atau asam-
asam amino yang merupakan senyawa amfoter).
 Berdasarkan atas Mekanisme Pengikatan Fisika
Mekanisme ini menurut Fischer, Appleyard, Freunlich, dan lainlain.
Menurut teori pengikatan fisika menyatakan bahwa peristiwa pengikatan
warna merupakan proses absorpsi warna pada konstituen sel. (Waluyo,2010)

Dalam melakukan pewarnaan Gram terdapat empat macam tahap yang

dilakukan antara lain adalah pemberian warna utama GramA berupa larutan
Kristal violet berwarna ungu. Selanjutnya adalah pengintensifan warna utama
Gram B berupa larutan kalium iodida kemudian pencuci dekolorisasi Gram C
berupa alkohol dan yang terakhir adalah pemberian warna penutup/pewarna
tandingan/counterstain. Gram D larutan safranin berwarna merah muda.Ada dua
teknik untuk membekukan prosedur warna Gram yang hasilnya setara ialah teknik
Hucker dan teknik Burke. Teknik Burke dalam prosedur ini dikenakan pada sel
bakteri yang telah difiksasi, hasil pewarnaan pada bakteri Gram positif berwarna
ungu, sedangkan pada bakteri Gram negatif berwarna merah muda. Tujuan dari
praktikum pewarnaan Gram yaitu mengenal dan mempelajari prosedur pewarnaan
Gram, memahami pentingngya setiap langkah dalam prosedur (Ulfah, 2011).
 Dengan menggunakan metode differensial atau pewarnaan Gram dengan
pengambilan sampel lendir terhadap biakan bakteri yang berumur 24 jam.Pada
dasarnya bakteri dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan Gram. Teknik
pewarnaan Gram tersebut dapat dihasilkan warna unggu atau biru gelap sebagai
Gram positif, dimana dinding sel bakteri Gram positif menyusut yang disebabkan
oleh adanya perlakuan alkohol, karena terjadi dehidrasi yang menyebabkan pori-
pori dinding sel menutup. Sedangkan bakteri Gram negatif ditandai dengan
pewarnaan merah muda, dinding sel bakteri Gram negatif mengandung lipid yang
lebih tinggi debanding Gram positif.Larutnya lipid ini disebabkan pada saat
pencucian yang diduga dapat memperbesar pori-pori dinding sel bakteri Gram
negative.Dalam teknik pewarnaan Grammenggunakan 4 jenis larutan, diantaranya
Kristal violet sebagai cat warna utama, larutan iodin sebagi pengintensifan cat
utama, alkohol sebagai pencucian dekolorisasi dan dan safranin sebagai
pemberian warna penutup (Ulfah, 2011).
Bakteri Gramnegatif setelah diberi larutan Kristal violet dan iodine
treatment hasilnya sama sperti bakteri Gram positif yaitu berwarna ungu atau biru
gelap kemudian setelah dilakukan pencucian dengan alkohol hasilnya berbeda
denga Gram positif dikarenakan memperbesarnya pori-pori dinding sel yang
mengakibatkan terjadinya perubahan warna yaitu berwarna merah. Bakteri Gram
positif pada saat tahap pewarnaan Gram setelah diberi larutan Kristal violet dan
iodine treatment dan dilakukan pencucian dengan alcohol tidak adanya perubahan
warna disebabkan menyusut pori-pori dinding sel sehingga pori-pori menutup dan
menghasilkan warna ungu atau biru gelap (Ulfah, 2011).

Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pewarnaan

1) Fiksasi
Sebelum mikroorganisme, khususnya bakteri diwarnai harus dilakukan
fiksasi terlebih dahulu. Cara yang paling banyak digunakan adalah cara fisik
dengan pemanasan atau dengan freeze drying atau dapat juga dilakukan
fiksasi dengan menggunakan agensia kimia. Agen kimia yang dapat dipakai
antara lain sabun, fenol, dan formalin. (Waluyo,2010)
Fiksasi perlu dilakukan sebelum pewarnaan mikrobe berfungsi untuk:
1) Merekatkan sel mikrobe pada gelas obyek, 2) Membunuh mikroorganisme
 secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahanperubahan bentuk dan
strukturnya, 3). Mengubah afinitas (daya ikat) zat warna, 4) Membuat sel-sel
mikroba lebih kuat (keras), 5) Melepaskan granuler (butiran) protein menjadi
gugus reaktif (NH3+) yang akan bereaksi dengan gugus -OH dari zat warna,
6) Mencegah otolisis sel, yaitu pecahnya sel yang disebabkan oleh enzim-
enzim yang dikandungnya sendiri, 7) mempertinggi sifat reaktif gugus-gugus
tertentu (gugus karboksil, amino primer,sulfhidril). (Waluyo,2010)
Cara fiksasi yang paling banyak digunakan dalam pewarnaan bakteri
adalah dengan membuat lapisan suspensi bakteri di atas gelas benda.
Kemudian suspensi tersebut dikering-anginkan dan dilalukan beberapa kali di
atas nyala lampu spiritus. Pewarnaan biologi lainnya dapat digunakan
agensia-agensia fiksasi kimia seperti campuran asam cuka dengan asam
pikrat, alkohol dengan aseton, asam kromat dengan asam osmiat, dan lain-
lain. (Waluyo,2010)

2) Peluntur Zat Warna

Peluntur zat warna adalah suatu senyawa yang menghilangkan warna
dari sel yang telah diwarnai. Peluntur zar warna (decolorizer) berfungsi untuk
menghasilkan kontras yang baik pada bayangan mikroskop. Pada umumnya
sel-sel yang mudah diwarnai akan lebih mudah pula dilunturkan warnanya.
Sedangkan sel-sel yang sukar diwarnai akan lebih sulit dilunturkan warnanya.
Adanya variasi di dalam kecepatan dekolorisasi (pelunturan) zat warna inilah
yang digunakan untuk membedakan bermacam-macam jenis bakteri dalam
pewarnaan Gram atau pewarnaan bertingkat (diferensial) lainnya.
(Waluyo,2010)
Ditinjau dari kekuatan ikatan antara sel dengan zat warna, maka dikenal
beberapa istilah, misalnya tahan asam, tahan alkohol, tahan air, dan lain-lain.
lstilah tahan asam digunakan bila zat warna telah diikat kuat oleh sel sehingga
tidak dapat dilunturkan warnanya oleh asam; demikian pula tahan alkohol dan
tahan air masing-masing tidak dapat dilunturkan oleh alkohol dan air. Bila
sesuatu zat warna telah diikat oleh suatu bagian sel, misalnya warna thionin
oleh inti, maka zat warna tersebut tidak dapat didekolorisasi oleh alkohol. Hal
 tersebut disebut alcohol fast. Analog yang lain acid fast, water fast, dan lain-
lain. (Waluyo,2010)

Pewarnaan Negatif
Beberapa mikroorganisme sulit diwarnai. Oleh karena itu, perlu ada metode
khusus untuk maksud tersebut. Pewarnaan ini bukan untuk mewarnai bakteri,
tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi gelap. Caranya secara umum dengan
mencampur mikrobe dalam setetes tinta bak/tinta cina/ tinta India (negrosin) lalu
menyebarkannya di atas kaca obyek yang bersih. (Waluyo,2010)
Pewarnaan negatif menyebabkan mikroba kelihatan transparan (tembus
pandang) dan tampak jelas pisah di antara medan yang gelap karena pewarna yang
diberikan tidak menembus sel mikroba. Teknik pewarnaan ini berguna untuk
menentukan morfologi dan ukuran sel. Berbeda dengan metode pewarnaan yang
lain, pada pewarnaan negatif olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan
lain dengan bahan kimia. Metode ini sering digunakan terhadap terutama
spiroketa yang sukar diwarnai. (Waluyo,2010)
Tinta yang dipakai dalam pewarnaan negatif adalah negrosin. Berhasil
tidaknya metode ini tergantung: a) kaca obyek harus betul-betul bersih, b) jumlah
negrosin yang digunakan menentukan keberhasilan pewarnaan, dan c) campuran
mikroorganisme harus digesekkan di atas kaca obyek, bukan sekedar didorong.
(Waluyo,2010)
Ciri-ciri pewarnaan negatif adalah: a) menggunakan zat warna yang
bermuatan negatif, b) tujuan penggunaan zat warna negatif tersebut, menyebabkan
zat warna tidak mewarnai permukaan sel yang bermuatan negatif, () pewarnaan
negatif bukan pewarnaan mikrobe, karena sel mikrobe tetaptidak berwarna setelah
penambahan zat warna, dan d) kesalahan yang sering dilakukan yakni preparat
ulas terlalu tebal dan terlalu tipis. Bila preparat terlalu tebal menyebabkan
lingkungan sekitar bakteri gelap dan mikrobe tidak dapat dibedakan dengan
lingkungan di sekelilingnya. Tetapi bila preparat terlalu tipis tidak terjadi kontras
yang tajam antara mikrobe dengan lingkungan sekitarnya.(Waluyo,2010)
Pada prosedur pewarnaan sederhana kita hanya dapat melihat mikrobe
dengan jelas, tetapi tidak dapat membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda
dengan morfologi sama. Gram seorang ahli bakteriologi Denmark secara
kebetulan menemukan suatu pewarnaan bertingkat, yang dinamakan pewarnaan
Gram.
Pewarnaan ini merupakan salah satuprosedur yang penting dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan Gram juga merupakan
tahap penting dalam identifikasi bakteri, termasuk pewarnaan diferensial.
Pewarnaan diferensial yang lain adalah pewarnaan Ziehl Neelsen, yang dapat
memilah kuman menjadi kuman tahan asam asam dan kuman tidak tahan asam.
Pewarnaan Gram memilahkan bakteri menjadi 2 kelompok, yakni bakteri Gram
positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif berwarna ungu yang disebabkan
kompleks warna kristal violet-iodium tetap dipertahankan meskipun diberi larutan
pemucat. Sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah karena kompleks
warna tersebut larut sewaktu pemberian larutan pemucat dan kemudian
mengambil zat warna kedua yang berwarna merah. Perbedaan hasil dalam
pewarnaan tersebut disebabkan perbedaan struktur, terutama dinding sel kedua
kelompok bakteri tersebut. Karena kemampuannya membedakan suatu kelompok
bakteri tertentu dengan kelompok lainnya, pewarnaan Gram juga disebut
pewarnaan diferensial. (Waluyo,2010)

2.2 Pemeriksaan Jamur

Jamur dapat berkembang biak secara vegetatif (aseksual) dan generatif

(seksual). Perkembang biakan aseksual dapat dilakukan dengan fragmentasi
miselium (thalus) dan pembentukan spora aseksual. Ada 4 cara perkembang
biakan dengan fragmentasi thalus yaitu, (a) dengan pembentukan tunas, misalnya
pada khamir, (b) dengan blastospora, yaitu tunas yang tumbuh menjadi spora,
misalnya pada Candida sp., (c) dengan arthrospora (oidium), yaitu terjadinya
segmentasi pada ujung-ujung hifa, kemudian sel-sel membulat dan akhirnya lepas
menjadi spora, misalnya pada Geotrichum sp., dan (d) dengan chlamydospora,
yaitu pembulatan dan penebalan dinding sel pada hifa vegetatif, misalnya pada
Geotrichum sp. (Sumarsih, 2003).
Spora aseksual terbentuk melalui 2 cara. Pada jamur tingkat rendah, spora
aseksual terbentuk sebagai hasil pembelahan inti berulang-ulang. Misalnya spora
yang terbentuk di dalam sporangium. Spora ini disebut sporangiospora. Pada
jamur tingkat tinggi, terbentuk spora yang disebut konidia. Konidi terbentuk pada
ujung konidiofor, terbentuk dari ujung hifa atau dari konidi yang telah terbentuk
sebelumnya. (Sumarsih, 2003).
Perkembang biakan secara seksual, dilakukan dengan pembentukan spora
seksual dan peleburan gamet (sel seksual). Ada dua tipe kelamin (mating type)
dari sel seksual, yaitu tipe kelamin + (jantan) dan tipe kelamin – (betina).
Peleburan gamet terjadi antara 2 tipe kelamin yang berbeda. Proses reproduksi
secara seksual dibagi menjadi 3 tingkatan, yaitu: (a) plasmogami yaitu
meleburnya 2 plasma sel, (b) kariogami yaitu meleburnya 2 inti haploid yang
menghasilkan satu inti diploid, dan (c) meiosis yaitu pembelahan reduksi yang
menghasilkan inti haploid.(Sumarsih, 2003).
Dalam keadaan sebenarnya (di alam bebas) boleh dikatakan tidak ada
bakteri yang hidup tersendiri dan terlepas dari species lainnya kerap kali bakteri
pathogen kedapatan bersama-sama bakteri saprobe. Yang terakhir ini boleh
disebut penyerbu yang membonceng, mungkin juga bakteri yang
membonceng.Untuk menentukan siapa pembonceng dan siapa yang dibonceng
diberikan pedoman “siapa yang kedapatan disitu lebih dulu dan siapa yang dating
terkemudian”. Untuk menyendirikan suatu spesies atau dikenal dengan beberapa
cara yaitu:
a) Dengan pengenceran
Cara ini pertama-tama dilakukan oleh lister dalam tahun 1865.Ia berhasil
memelihara biakan murni Streptococcus lactisyang diisolasikannya dari susu yang
sudah masam. Suatu sampel dari suatu suspense yang berupa campuran
bermacam-macam spesies diencerkan dalam suatu bidang/bidang tersendiri.Dari
enceran ini kemudian diambil barang ini untuk di encerkan lagi jika tidak
pengenceran.Yang ketiga ini diambil oil imersi untuk disebarkan pada suatu
mediaum padat (Dwidjoseputro, 1998).
b) Dengan penuangan
Robert Koch (1843-1905) mempunyai metode yang lain yaitu dengan
mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan. Dan sampel
ini kemudia disebarkan dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer
(Dwidjoseputro, 1998).
c) Dengan penggesekan kaca
Metode ini sekarang banyak digunakan karena tidak memakan
waktu.Dengan ini maka bakteri anaerob tidak dapat tumbuh. Jika ujung kawat
inokulasi dibengkokkan, kemudia ujung itu setelah disentuhkan suatu padat,
maksimal beberapa waktu kemudia daripada itu (kurang lebih setelah 12 jam)
akan tampaklah koloni-koloni yang letaknya sebar di permukaan medium, jika
diadakan pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil, maka
akan diperoleh suatu piaraan murni (Dwidjoseputro, 1998).
d) Penanaman pada agar (plating)
Tidak seperti sel-sel dalam medium cair, sel-sel dalam atau pada medium
gel dibuat menetap. Oleh karenanya, jika cukup sedikit sel diletakkan dalam atau
pada medium gel tiap sel akan tumbuh (Dwidjoseputro, 1998).
 BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Alat
 Beaker glass  Objek glass
 Botol alkohol  Penjepit tabung
 Bunsen  Pinset
 Jarum Ose  Pipet Tetes
 Kain Kasa  Tisu
 Mikroskop

3.2 Bahan
 Alkohol 70%  Candida albicans
 Aquadest  Escherichia coli
 Gentian Violet  Staphylococcus aureus
 Imersi Oil
 Lugol
 Safranin

3.3 Flowsheet
3.3.1 Pengecetan Gram

Objek glass

Dicuci objek glass dengan alkohol 70%, lalu

difiksasi
Ditetesi 1 tetes aquadest steril pada objek glass
Dimasukkan satu ose biakan murni
Dihomogenkan dan difiksasi
Ditambahkan 1 tetes gentian violet
Ditambahkan 1 tetes lugol
Diratakan lalu dikeringkan dengan fiksasi
 Dicuci objek galss dengan alkohol 70% sampai
tetesan terakhir tidak berwarna, dikeringkan
Diteteskan 1 tetes safranin, dibiarkan 15-30
detik
Dicuci dengan aquadest steril, dikeringkan
Diteteskan 1-2 tetes minyak imersi
Dilihat pada mikroskop dengan perbesaran 40x
dan 100x
Diamati dengan melihat warna dan bentuk
bakteri
Ditentukan jenis bakteri berdasarkan pewarnaan
gram yang diamati

Bakteri berwarna ungu Bakteri berwarna pink/merah muda

Bakteri gram (+) Bakteri gram (-)
(S. aureus) (E. coli)

3.3.2 Pemeriksaan Jamur

Objek glass

Dicuci objek glass dengan alkohol 70%, lalu

difiksasi
Ditetesi 1 tetes aquadest steril pada objek glass
Dimasukkan satu ose biakan murni jamur
Dihomogenkan dan difiksasi
Dicuci dengan aquadest steril, dikeringkan dan
ditetesi 1-2 tetes minyak imersi
Dilihat dan diamati morfologi jamir pada
mikroskop dengan perbesaran 40x dan 100x
Jamur
(Candida albicans)
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
4.1.1 Pewarnaan Gram
Nama biakan bakteri
No Pengamatan Kesimpulan
(Spesies)
1 Staphylococcus aureus Warna: Ungu Bakteri
Bentuk sel: bulat merupakan
Bentuk koloni: bakteri gram
Staphylococcus positif
2 Escherichia coli Warna: Merah jambu Bakteri
Bentuk sel: batang merupakan
Bentuk koloni: bakteri gram
monobasil negatif

4.1.2 Pemeriksaan Jamur

Nama biakan jamur
No Pengamatan Kesimpulan
(Spesies)
1 Candida albicans Terlihat bentuk jamur Jamur memiliki
dengan benang-benang bentuk yeast

4.2 Pembahasan
Pewarnaan Gram merpakan metode yang dilakukan untuk membedakan
spesies bakteri Gram positif dan Gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik
dinding sel mereka. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan pada dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada
membran sel bakteri.
Pada percobaan ini kami menggunakan 4 reagen, yaitu gentian violet, lugol,
alkohol dan safranin. Perlakuan pertama yang dilakukan adalah memberikan
pewarna gentian violet pada bakteri. Gentian violet adalah zat pewarna berwarna
ungu yang merupakan pewarna primer yang akan memberikan warna pada
mikroorganisme target. Kemudian ditambahkan larutan lugol pada bakteri.
Larutan lugol berfungsi untuk mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol
pada pengecatan gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh
bakteri. Selanjutnya, bakteri dicuci menggunakan alkohol 70%. Alkohol
digunakan untuk melunturkan zat warna utama.Selain itu pemberian alkohol dapat
menyebabkan ekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel
(Yusdiani, dkk., 2016).Sehingga bakteri gram negatif yang memiliki kandungan
lipid lebih tinggi pada dinding sel dapat larut dalam alkohol. Larutnya lipid oleh
alkohol memperbesar pori-pori dinding sel, dan menyebabkan zat warna ungu
menjadi luntur pada saat pemucatan. Sedangkan dinding sel yang lebih tebal pada
bakteri Gram positif menyusut oleh perlakuan alkohol karena terjadi dehidrasi,
menyebabkan pori-pori dinding sel menutup sehingga mencegah larutnya
kompleks zat warna ungu kristal-iodium pada langkah pemucatan (Waluyo,
2010).
Langkah selanjutnya adalah dilakukan penambahan safranin pada bakteri.
Karena terjadinya peningkatan permeabilitas pada bakteri gram negatif membuat
safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada
bakteri Gram negatif, sedangkan bakteri Gram positif dinding selnya terhidrasi
dengan perlakuan alkohol membuat pori mengerut dan menurunkan daya rembes
dinding sel dan membran sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk, dan
menyebabkan sel Gram positif tetap berwarna ungu (Yusdiani, dkk., 2016).
Setelah penambahan semua reagan, bakteri kemudian dicuci dengan aqudest
dan diamati di bawah mikroskop. Berdasarkan hasil pengamatan, bakteri
Escherichia coli berwarna merah muda atau pink, dan berbentuk batang atau
basil. Sehingga kami menyimpulkan bahwa bakteri E. coli merupakan bakteri
gram negatif. Sedangkan pada pemeriksaan bakteri Staphylococcus aureus,
berdasarkan hasil yang kami amati tampak sebagian bakteri tersebut berwarna
ungu, sedangkan sebagian lainnya berwarna merah muda. Adanya bakteri yang
berwarna merah muda pada sampel tersebut menunjukkan bahwa sampel bakteri
telah terkontaminasi oleh bakteri lainnya.Hanya sejumlah kecil staphlacoccus
aureus yang bisa kami dapatkan (Yusdiani, dkk., 2016).
 Pada percobaan selanjutnya, kami melakukan pemeriksaan morfolgi pada
jamur. Jamur yang kami gunakan adalah Candida albicans. Berdasarkan hasil
yang didapat mengenai jamur candida albicans, ketika diamati di mikroskop sel-
sel jamur berhubungan dengan sel lainnya membentuk untaian, jamurnya
memiliki bentuk yeast (Yusdiani, dkk., 2016).
 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
1) Bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu gram negative dan gram
positif.
2) Bakteri gram negatif merupakan bakteri yang kehilangan kompleks ungu
Kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian
terwarnai dengan pewarnaan tandingan, yaitu safranin sehingga sel-sel
tampak berwarna merah muda pada akhir pewarnaan.
3) Bakteri gram positif bakteri dapat menahan kompleks pewarna primer
ungu Kristal iodium dan sel bakteri berwarna biru gelap atau ungu.
4) Cara pengecatan Gram yang baik dapat dilakukan dengan mengamati
lebih baik morfologi mikroorganisme dan mengetahui bagian-bagian
structural sel mikroorganisme.
5) Perbedaan antara Gram (+) dan Gram (-) adalah Gram (+) bersifat polar,
dinding sel terdiri dari peptidoglikan tebal, dapat menyerap warna
gentian violet dan berwarna ungu. Gram (-) bersifat non polar, dinding
sel peptidoglikan tipis, tidak dapat menyerap warna gentian violet tetapi
menyerap warna safranin berwarna merah jambu.
6) Prosedur kerja pemeriksaan jamur adalah dapat secara visual maupun
dengan mikroskop dimana satu ose biakan koloni (jamur) diletakkan
pada objek glass yang telah ditetesi aalk. Kemudian dicuci dengan
akuades, ditetesi imersi oil dan dilihat dimikroskop perbesaran 100x.

5.2 Saran
1) Saat percetakan bakteri pada objek glass sebaiknya diratakan atau
dihomogenkan untuk mencegah penumpukan bakteri pada objek glass
yang dilihat melalui mikroskop.
2) Sebaiknya pada saat fiksasi jarak antara api dan objek glass tidak terlalu
dekat, agar objek glass tidak pecah.
3) Disarankan untuk selalu bekerja dengan teknik aseptis agar tidak terjadi
kontaminasi oleh mikroba lain
4) Sebaiknya pada saat mengambil bakteri pada media agar, jangan terlalu
dalam, agar media gar tidak rusak
 DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D.1998. Dasar-dasarMikrobiologi.Jakarta :Djambatan

Harvey,R.A. 2007. Lippincontt’s Illustrated Reviews Microbiology 2nd

Edition.New Jersey: Lippincott Williams & Wilkins

Mohan, S.K. 2009. Gram Stain: Looking Beyond Bacteria to Find Fungi in Gram
Stained Smear. Canada: Senior adn Teaching Medical Mycology
Technologist University Health Network

Ulfah,A.M. 2011. Pewarnaan Gram. JurnalFakultasPertanianUniversitas Sultan

AgengTirtayasa

Sumarsih, Sri. 2003. Mikrobiologi Dasar. Yogyakarta: Jurusan Ilmu Tanah UPN

Waluyo, Lud. 2010. Teknik dan Metode Dasar Mikobiologi. Malang : UPT
Penerbitan Universitas Muhammadiyah Malang

Yusdiani, Devita, dkk.. 2016. Bakteriologi. Jakarta: ECG

LAMPIRAN

Escherichia coli Gram (-) Staphylococcus aureus

GramGram(+)
(-

Jamur Candida albicans