IDENTIFIKASI BAKTERI DENGAN PEWARNAAN

RABU, 15 MEI 2013

JURNAL
MIKROBIOLOGI FARMASI


OLEH:
IFA ROSI MAHRIFAH
122210101068


BAGIAN BIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2013
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Bakteri merupakan organisme yang memiliki morfologi bentuk tubuh dasar yang pada
umumnya mirip satu sama lain dengan struktur tambahan yang berbeda-beda. Sel bakteri jika
diamati dengan mata biasa sangatlah sulit karena ukurunnya yang sangat mikroskopik, untuk
itu digunakan mikroskop untuk membantu dalam mengamati morfologi dan
mengidentifikasinya.
Jika dibuat preparat oles tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat karena bentuk selnya
yang transparan dan bermacam-macam. Bakteri juga memiliki sifat yang dapat diabsorbsi
oleh zat-zat tertentu. Dalam laboratorium mikrobiologi sifat-sifat tersebut digunakan untuk
mengamati bakteri, karena sifat yang dapat menyerap suatu zat yang bersifat asam atau basa
yang dapat memberikan suatu warna baik itu pada sel bakteri ataupun pada latar belakang dari
bakteri tersebut.
Pewarnaan dalam kegiatan identifikasi bakteri bertujuan untuk memperjelas sel bakteri
dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan
membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Di mana
zat warna tersebut dapat memberikan muatan negatif atau positif. Contoh zat warna asam
antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, dan Malachite Green.
Sedangkan zat warna basa sebagai contoh antara lain Eosin dan Congo Red .
Berdasarkan hal di atas maka, dilakukanlah percobaan ini untuk mengetahui dari
bagaimana cara kerja dari suatu zat warna dan sifatnya pada suatu bakteri.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apa sajakah macam-macam pewarnaan kuman?
2. Bagaimana cara mewarnai kuman?

1.3 Tujuan Praktikum

1. Mahasiswa mengenal macam-macam pewarnaan kuman.
2. Mahasiswa dapat melakukan pewarnaan kuman.





BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
1. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan
bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri
yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat
mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan
melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece,
2005).
Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur
pewarnaan untuk:
a. Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar
b. Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme
c. Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa
(Suriawiria, 1985).
Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang
(transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena
sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias
lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam
dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna (Hadioetomo, 1990).
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan
adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk
melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat
pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya
berwarna (Volk dan Whleer, 1998).
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran
100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri
sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat
warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya,
sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan
bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna
disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian
yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak
digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat
warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite
Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008).
2. Pewarnaan Gram
Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika dilarutkan dalam air dan
diperlihatkan di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras dengan medium
disekelilingnya. Beberapa zat yang digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel.
Dalam pewarnaan mikroba, dapat digunakan satu jenis warna, cara ini disebut
pewarnaansederhana. Zat-zat warna yang biasa digunakan untuk pewarnaan bekteri dapat
dibedakan atas beberapa golongan yaitu: pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial,
pewarnaan strukturan dan pewarnaan untuk menguji adanya komponen tertentu di dalam sel
(Anonim,2007)
Karakteristik taksonomi penting bakteri adalah reaksi mereka terhadap pewarnaan gram.
Pewarnaan gram menjadi penting karena reaksi gram berhubungan dengan sifat morfologi
lain dalam bentuk hubungan filogenik. Organisme yang berpotensi gram positif mungkin
hanya dapat dilihat dengan pewarnaan gram pada kondisi lingkungan yang sesuai dan pada
biakan muda. Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarna basa,kristal
violet. Larutan iodine kemudian ditambahkan semua bakteri akan diwarnai biru pada fase ini.
Sel kemudian diberi alkohol. Sel gram positif akan tetap mengikat senyawa kristal violet-
iodine, tetap berwarna biru, sel gram negatif warnanya hilang oleh alkohol. Sebagai langkah
terakhir, counterstain (misalnya Safranin pewarna merah) ditambahkan,sehingga sel gram
negatif yang tidak berwarna, akan mengambil warna kontras; sedangkansel gram positif
terlihat dalam warna biru (Jawetz, etc. 2001).
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat
kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun
1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri
Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.
Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu,
pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding
sel seperti Mycoplasma sp. Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari
genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari
kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding
selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat
warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa,
seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen
yaitu :
Zat warna utama (violet kristal)
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna
utama.
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
uantuk melunturkan zat warna utama.
Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil
ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji
pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma
organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram
negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif
memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan
bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Sifat bakteri terhadap pewarnaan
Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa
perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif
yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
a. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
b. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat
didalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.
c. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
d. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
f. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
g. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
h. Peka terhadap streptomisin
i. Toksin yang dibentuk Endotoksin
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
a. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
b. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.
c. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
d. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
f. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
g. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
h. Tidak peka terhadap streptomisin
i. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk
mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram
meliputi crystal violet , yodium , alkohol dan safranin. Fungsi dari masing-masing zat warna
tersebut adalah :
1. Crystal Violet
Berwarna ungu. Merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna
mikroorganisme target. Crystal Violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel
mikroorganisme yang bersifat asam , dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan
terlihat berwarna (Ungu).
Kristal violet dipakai sebagai zat warna primer dikarenakan Kristal violet
mampumelekatkan bakteri pada kaca mencegah autolisis pada sel, membuat sel-sel lebih kuat
atau keras, mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel, mempertinggi sifat reaktif
gugusan-gugusan, membunuh bakteri secara cepat dengan tidak mengubah bentuk dan
strukturnya, dan mengubah afinitas cat.
2. Yodium
Merupakan pewarna Mordan , yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna
primer yang diserap mikroorganisme target. Pemberian yodium pada pengecatan Gram
dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri.
3. Alkohol
Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna
pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat
mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan :
1. Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu
2. Bakteri menjadi tidak berwarna
4. Safranin
Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi
untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan
dengan alkohol. Dengan kata lain , memberikan warna pada mikroorganisme non target
(Wahyuningsih , 2008).
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan itu merupakan tahap penting
dalam pencirian dan identifikasi bakteri (Lay,1994). Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau
tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada
membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu
gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan
membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada
di antara dua lapis membran sel.
BAB III
METODE KERJA

1.1 Pembuatan Preparat Oles













Ikuti langkah seperti pada goresan T, namun dengan lempeng agar dibagi menjadi 4 a




3.2 Pewarnaan Sederhana








3.1.4 Goresan Sinambung





Bersihkan kaca objek sehingga bebas dari lemak dan kotoran
Ambil inokulum bakteri dan sebarkan olesan tersebut hingga merata
Biarkan olesan tersebut kering udara hingga betul-betul kering
Lakukan fiksasi panas dengan melayangkan kaca objek diatas panas api
Teteskan beberapa tetes isopropyl alcohol 95% pada kedua permukaan kaca objek dan
keringkan dengan lap kertas
Buatlah lingkaran di tengah-tengah permukaan bawah kaca objek. Hal ini untuk
membantu meletakkan olesan mikroba dengan tepat
Peganglah kaca objek dengan penjepit dan miringkan kemudian bilas dengan air hingga
zat warna hilang atau sedikit sekali
Keringkan air pada permukaan preparat dengan kertas serap
Amati morfologi spesien pada masing-masing preparat di bawah mikroskop
Biarkan terwarnai biru metilen selama 1-2 menit atau selama 15-30 detik untuk
pewarnaan dengan karbol fuksin
Letakkan kaca objek diatas bak pewarnaan dan genangi olesan tersebut dengan zat warna
biru metilen untuk preparat pertama dan zat warna karbol fuksin untuk preparat kedua
Siapkan preparat olesan bakteri B.subtilis dan E.coli yang telah di fiksasi panas dimana
dibuat dua preparat untuk tiap bakteri

3.3 Pewarnaan gram

































Buat preparat oles dari bakteri E.coli dan S.aureus
Beri Kristal ungu selama satu menit
Buang kelebihan Kristal ungu dengan memiringkan kaca objek diatas bak pewarna
Bilas dengan air menggunakan botol pijit
Tiriskan kaca objek dan kembalikan ke atas rak pada bak pewarna
Beri larutan iodium gram selama 2 menit
Buang kelebihan iodium dengan memiringkan kaca objek
Bilas dengan air memakai boto pijit

Buang kelebihan safranin lalu bilas dengan air

Amati dibawah mikroskop
Cuci dengan etanol 95% setetes demi setetes selama 30 detik atau sampai zat ungu Kristal
tidak tampak lagi mengalir dari kaca objek
Beri safranin selama 30 detik

Cuci dengan sir lalu tiriskan

Tiriskan kaca objek dan serap kelebihan air dengan menekankan kertas serap diatasnya
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2007.Petunjuk Praktikum Mikrobiologi.Mataram.Universitas Mataram
Press.Burdon Ph.B., Sc.M., Ph.D., Kenneth L. & Williams, A.B., Sc.M., Ph.D., Robert P.
1969.Mycrobiology. London, Collier-McMillan Publisher.Jawetz E., Melnick J.L., Adelberg
E.A., 1982. Mikrobiologi untuk profesi kesehatan. Jakarta,EGC Press.Jawetz E., Melnick J.L.,
Alderberg E.A., 2001. Mikrobiologi kedokteran. Surabaya, Airlangga University
Press.Pelgzar & Reid, 1958. Mycrobiology. Tokyo, McGraw-Hill Company Press.Pelczar, J
Michael, 2005. Dasar-Dasar Mikrobiolog. Jakarta, Universitas Indonesia Press


DAFTAR PUSTAKA
Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta.
Hadioetomo, R, S., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
Irawan, 2008. Teknik Pewarnaan Mikroba. http://wordbiology.wordpress.com. Diakses pada hari
Senin, 13 April 2008 pada pukul 19.00 WITA.
Pelczar, M. W., 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. UI Press. Jakarta.
Suriawiria, U., 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.

Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.