LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI PANGAN
Ditulis dalam Rangka Memenuhi Tugas Mata Kuliah Mikrobiologi Pangan

Oleh Ni Putu Tia Pratiwi P07131012017

KEMENTRIAN KESEHATAN RI POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR JURUSAN GIZI 2013

I. II.

Judul : Membuat Preparat Kering dan Pengecatan Gram Hari dan Tanggal : Senin, 23 September 2013

III. Tujuan Praktikkum : Tujuan Khusus 1. Mahasiswa dapat membuat preparat kering 2. Mahasiswa dapat membedakan Gram positif dan Gram negatif Tujuan Umum 1. Mahasiswa dapat mengetahui proses pembuatan preparat kering 2. Dapat mengetahui proses penegcatan Gram

IV. Dasar Teori: Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi dua, yaitu : 1. Pewarnaan sederhana Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan. a. Pewarnaan Asam Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel.Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif

adalah metilen biru dan air furksin. b. Pewarnaan Basa Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. 2. Pewarnaan Diferensial (Gram) Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. a. Bakteri Gram Negatif Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. b. Bakteri Gram Positif Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009). Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif. Sifat Bakteri garam (+) Bakteri negatif(-) Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1- Kandungan lipid 4%) Ketahanan penisilin Penghambatan pewarna basa (VK) Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif Relatif sederhana kompleks Ketahanaa terhadap perlakuan fisik Adapun kelebihan dan kekurangan dari pengecatan gram antara lain: Kelebihan : Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai Lebih tahan Kurang tahan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat terhadap Lebih sensitif tinggi Lebih tahan gram

kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore Kekurangan : Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan

mikroorganisme tersebut.

Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan

pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.

V.

Alat dan Bahan: Alat : Glass objek Pensil glass Ose Lampu spritus Kertas label Rak pengecatan dengan jembatan pengecatan Bahan : Biakan bakteri pada agar miring Biakan bakteri Gram Positif (+) Biakan bakteri Gram Negatif (-)

Aquadest sebagai pengencer (suspensi) olesa bakteri. Preparat kering yang siap untuk di cat.

Reagen : R1. Karbol gentlan ungu R2. Larutan Lugol R3. Etanol 96% R4. Fuchsin

VI. Prosedur Kerja: 1. Pembuatan preparat kering a. menyalakan lampu spritus. b. mengambil glass objek, menghangatkan diatas nyala api Bunsen.

c. Memberi tanda dengan pensil glass pada bagian bawah glass objek (2 - 2,5cm) dari ujung glass objek, selanjutnya secara proporsional membuat 2 lingkaran padaobjek glass untuk suspense kuman. d. Mengisi pada masing-masing lingkaran satu tetes aquadest pengencer secara steril. e. Mengambil sedikit biakan kuman dari agar miring sebanyak satu ose dengan cara menyentuhkan ose pada biakan kuman, kemudian kuman disuspensikan pada lingkaran yang telah ditandai dengan tanda (+) dan (-), yang telah diberi aquadest pengencer secara steril. f. Mengeringkan glass objek yang telah diisi suspense kuman diudara atau diatas nyala api Bunsen. g. Kemudian memfiksir prearat diatas nyala api, beberapa kali. 2. Pengecatan Gram a. Meletakkan preparat kering yang siap untuk di cat di atas rak pengecatan. b. Kemudian menetesi preparat dengan reagen pengecatan gram : Menambahkan R1. selama 1 3 menit, lalu mencuci preparat dengan air mengalir. Menambahkan R2. selama - 1 menit, lalu mencuci preparat dengan air mengalir. Menambahkan R3. selama 1/4 menit, lalu mencuci preparat dengan air mengalir. Menambahkan R4. selama 1 - 2 menit, lalu mencuci preparat dengan air mengalir. c. Mengeringkan preparat. d. Member label pada preparat yang berisi: nama penegcatan; tanggal; bulan; tahun pengecatan; nama pembuat 3. Cara melihat preparat di bawah mikroskop dengan pembesarn kuat (oil imersi) a. Menghubungkan steker kabel mikroskop ke power listrik yang sesuai. b. Menyalakn lampu mikroskop, memeriksa penerangan lampu mikroskop dari yang paling rendah paling tinggi c. Meneteskan oil mersi pada olesan kuman d. Meletakkan preparat pada meja preparat

e. Menggunakn lensa objekif pembesaran 100X tepat di atas olesan yang berisi imersi f. Menurunkan objektif sampai menempelpad imersi, sambil dilihat dari okuler, memfokuskan cahaya dengan menurunkan/ menaikkan objektif, samapi di dapat lapang pandang yang paling jelas. g. Dengan meggerakkan penggeser preparat mencari lapang pandang yang terlihat sel sel kuman yang tersendiri dan jelas. h. Membandingkan hasil pengecatan Gram postif dan negative.

VII. Hasil Pengamatan : Bakteri Gram positif (+) Gram negative (-) Warna Ungu Merah muda Bentuk Coccus (bulat) Batang

VIII. Pembahasan Pewarnaan gram termasuk pewarnaan diferensial yang digunakan untuk membedakan bakteri gram negative dan bakteri gram positif. Pewarnaan ini menggunakan 4 jenis larutan yaitu Kristal violet sebagai pewarna utama, larutan lugol sebagai pengintensifan warna utama, Etanol 96% untuk pencucian dan Fuchsin sebagai pewarna penutup. Bakteri bersifat gram positif yaitu bakteri yang dapat mengikat dengan kuat warna utama kristal violet berwarna ungu, pada saat bakteri Gram positif ditambahkan dengan kristal violet maka gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel, dengan pemberian larutan lugol maka kristal violet akan masuk sampai ke inti sel, pemberian alkohol menyebabkan pori-pori dinding sel mengecil sehingga warna ungu tertahan di dalam sel disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid. Sedangkan bakteri yang bersifat gram negative tidak dapat mengikat kuat warna utama dan dapat diwarnai oleh cat lawan yakni merah dari pewarna safranin. Prinsip dasar dari pewarnaan gram yaitu bakteri akan menyerap zat warna tertentu yaitu Kristal violet.Dengan penguatan lugol, bakteri Gram positif akan tetap mengikat warna ungu meskipun ada penambahan safranin sedangkan bakteri Gram negatif akan melepaskan warna ungu dengan adanya penambahan alkohol dan akan mengikat safranin menjadi warna merah.

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009). Kristal violet adalah larutan berwarna ungu yang merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam, dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (Ungu). Dari hasil pengamatan yang telah dilakukan selama praktikum, praktikan meneliti bentuk dan warna dari bakteri dengan menggunakan mikroskop. Untuk melihat warna bakteri lensa objek yang digunakan adalah lensa dengan pembesaran 10X. Dengan mengatur pergerakkan preparat dan menaik turunkan lensa objektif serta mengatur penerangan lampu mikroskop. Dapat terlihat bakteri Gram positif memiliki warna ungu sedangkan pada bakteri Gram negative warna yang terlihat adalah warna merah muda . Setelah itu untuk mengetahui bentuk bakteri praktikan mengganti lensa objektif dengan menggunakan lensa pembesaran 100X, namun sebelum dilakukan pengamatan terlebih dahulu preparat ditetesi dengan oil mersi. Penggunaan oil imersi berfungsi untuk menaikan indeks bias cahaya sehingga objek dapat terlihat dengan lebih jelas. Kemudian preparat dinaikkan agar dekat dengan lensa objektif. Pada lensa terlihat bakteri Gram positif memiliki bentuk coccus/ bulat sedangkan bakteri Gram negative memiliki bentuk batang. Kendala yang dialami pada saat melakukan praktikum yaitu ketika melakukan pewarnaan pada bakteri sebab jika terjadi kesalahan dan warna terlalu tebal. Maka pada saat pengamatan, bakteri yang akan diamati susah untuk terlihat.

IX. Kesimpulan: Dari hasil pembahasan dapat disimpulkan bahwa : 1. Pewarnaan Gram menggunakan 4 jenis larutan yaitu Kristal violet sebagai pewarna utama, larutan lugol sebagai pengintensifan warna utama, aseton alkhol untuk pencucian dan safranin sebagai pewarna penutup.

2. Bakteri yang bersifat gram positif yaitu bakteri yang dapat mengikat dengan kuat warna utama kristal violet berwarna ungu. 3. Bakteri yang bersifat gram negative tidak dapat mengikat kuat warna utama dan dapat diwarnai oleh cat lawan yakni merah dari pewarna safranin. 4. Bentuk bakteri yang bersifat Gram positif adalah coccus atau bulat. 5. Bentuk bakteri yang bersifat Gram negative adalah batang. X. Daftar pustaka Nirwati, Hera, _______, Pembuatan Preparat dan Pengecatan dalam Petunjuk Praktikum Mikrobiologi, Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan. Gupte, Satish. 1990. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Binarupa Aksara. Pelezar, M.1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Jakarta: Erlangga. Yumna Triyana,Shofyatul.____.Pengecatan Gram. Tersedia online: medicine.uii.ac.id/upload/mikro-lk/ (diakses pada tanggal 27 September 2013) Ferry.2013.Pewarnaan Gram. Tersedia Online:

Dwi,

http://ferrydwirestuhendra.blogspot.com/2013/01/pewarnaan-gram.html ( diakses pada tanggal 28 September 2013)