BAB I

PENDAHULUAN
1.1  Latar Belakang
Pewarnaan gram pertama kali dikemukakan oleh ilmuwan Denmark, Hans Christian Gram pada
tahun(1853-1938) dan mengembangkan tehnik ini tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae. Pada dasarnya pewanaan gram adalah pewarnaan
majemuk, karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Pewarnaan ini mampu
membedakan bakteri, sehingga mempermudah untuk melakukan identifikasi bakteria. Pewarnaan
garam (diferensial) adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok
besar, yaitu gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel nya. Bakteri
Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan akan tampak berwarna ungu
tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna kristal violet
setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat warna lainnya yaitu dengan karbol fuchsin
atau safranin akan tampak berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal
dan membran sel selapis. Sedangkan bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada
di antara dua lapis membran sel.

Cara Kerja
1. Kaca preparat dibersihkan dengan alkohol 70%
2. Jarum ose dipijarkan kemudian ditunggu hingga dingin, lalu bakteri diambil dari media
lalu diratakkan di atas preparat glass
3. Kaca preparat dipijarkan hingga kering
4. Larutan zat warna krista violet diteteskan sebanyak 2-3 tetes dan didiamkan selama 1
menit
 5. Preparat diberikan akuades mengalir dan dikeringkan
6. Larutan Lugol diteteskan dan dibiarkan selama 1 menit lalu dicuci dengan air mengalir
dan keringkan
7. Larutan alkohol asama diberikan selama 30 detik, lalu dicuci dengan air mengalir dan
dikeringkan
8. Larutan safranin diberikan selama 20 detik
9. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan
10. Minyak imersi diberikan diatas kaca preparat bakteri
11. Kaca preparat diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10x100x

Reagen-reagen yang digunakan dalam pengecatan gram adalah:

1.       Larutan gentien violet sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglikan bakteri.
2.       Lugol (1 tetes) sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama
3.      Ethanol 95% / alkohol 70% (secukupnya sampai cat utama luntur), sebagai bahan peluntur
untuk melunturkan cat utama
4.      Safranin / karbol fuchsin sebagai cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah
kehilangan warnacat utamanya.

Kesimpulan
Bakteri dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram.Pewarnaan  Gram merupakan
salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri
(mikroorganisme). Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram meliputi crystal violet,
yodium , alkohol dan safraninTeknik pewarnaan tersebut dapat menghasilkan warna merah
dan ungu.
Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah, sedangkan yang positif
berwarna ungu. Bakteri yang didapat berdasarkan hasil praktikum, yaitu diplobasil dengan
jenis gram negatif dan monococcus dengan jenis gram positif.

Contoh bakteri gram positif adalah Bifidobacterium, Lactobacillus, staphilococcus, clotridium,

actinomyces, arachnia, propionibacterium, peptostreptococcus.
Ciri-Ciri Bakteri Gram Positif

 Memiliki sitoplasma lipid membran

 Lapisan peptidoglikan yang tebal
 Beberapa spesies memiliki flagellum 
 Beberapa spesies memiliki kapsul polisakarida
 tidak memiliki kepekaan dengan streptomysin
 Toksin yang dibentuk berupa Eksotoksin Endotoksin
 Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rum
 Contoh bakteri gram negatif adalah aeruginosa, azotobacter, influenzae, rhizobium
leguminosarum, salmonella typhi, helicobacter pylori, neisseria gonorrchoeae, pseudomonas
aeruginosa  
Ciri-Ciri Bakteri Gram Negatif 

 Memiliki sitoplasmic membran

 Kurang rentang terhadap senyawa penisilin
 Struktur dinding sel yang tipis yaitu sekitar 10-15 mm, yang multilayer atau berlapis tiga
 Tidak resisten terhadap gangguan fisik
 Mengandung lemak pada dinding sel yang banyak yaitu sekitar 11-12

Komposisi

1.       Cat Gram A         :

         Kristal Violet              :  2 gram
         Etil Alkohol 95           :  20 ml
         Ammonium Oksalat    :  0,8 gram
         Akuades                      :  80 ml
 berwarna ungu (karena mengandung kristalviolet).

2.       Cat Gram B         :

      Yodium                 :  1 gram
      Kalium Yodida    :  2 gram
      Akuades               :  100 ml
  berwarna coklat

3.      Cat Gram C   :

      Aseton                         :  50 ml
      Etil Alkohol 95 %       :  50 ml

  Tidak berwarna
  Berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya

4.      Cat Gram D   :

         Safranin                    :  0,25 gram
         Etil Alkohol 95 %     :  10 ml
         Akuades                    :  90 ml

   Berwarna merah

 Saran
 Diharapkan dalam praktikum selanjutnya alat dan bahan yang dibutuhkan dalam
praktikum mikrobiologi, lebih di tingkatkan ketersediaannya.

DAFTAR PUSTAKA

Awetz, Melnick, Adelberg. 2008. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 23. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan:Malang
Entjang I, 2003, Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan. Jakarta: PT. Citra Aditya Bakti.
Iud, W. 2008. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. Malang: UMM Pres.
Schlegel, Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.

Kesimpulan

Berdasarkan percobaan yang dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut :
1.      Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat digunakan untuk
membedakan antara bakteri gram negatif dan gram positif. Pewarnaan ini sering digunakan
untuk identifikasi dan klasifikasi bakteri. Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda
dengan bakteri gram negatif sehingga hasil pewarnaan gram akan berbeda.
2.      Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna methylene blue sewaktu
proses pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal.
3.      Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan warna methylene blue
sewaktu prose pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis.
4.      Berdasarkan hasil pengamatan dapat diidentifikasi bahwa bakteriBacillus sp. merupakan
bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram positif .

Pewarnaan gram
1.      Disterilkan kaca preparat dengan alkohol 70%
2.      Dikeringkan (dilap) dengan tissue
3.      Difiksasi diatas lampu bunsen
4.      Ditetesi akuades
5.      Difiksasi sampai tetesan akuades menyerap dan berbekas diatas kaca preparat
6.      Diambil secara aseptis suatu koloni dengan menggunakan jarum ose
7.      Keringkan dan fiksasi diatas lampu bunsen
8.      Setelah kering, teteskan zat warna crystal violet sebanyak 2-3 tetes dan diamkan selama 1
menit
9.      Cuci dengan air mengalir dan keringkan
10.  Teteskan lagi dengan larutan lugol, dan biarkan selama 1 menit, lalu cuci dengan air
mengalir, dan keringkan.
 11.  Cuci lagi dengan alkohol 70% selam 30 detik
12.  Cuci dan keringkan
13.  Berikan larutan basil fuchsin atau safrina selama 2 menit
14.  Cuci dengan air mengalir dan keringkan
15.  Amati dengan mikroskop dan catat hasilnya

Pewarnaan Gram
Tujuan dari pewarnaan gram adalah untuk melakukan pengamatan morfologi bakteri
dengan pewarnaan diferensial. Prinsip pewarnaan gram termasuk pewarnaan diferensial
(untuk membedakan) karna dapat membedakan bakteri-bakteri yang bersifat gram negatif dan
positif. Pewarnaan ini ditemukan pertama kali pada tahun 1884 oleh Criestian Gram.
Bakteri garam positif  ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet) dengan
kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh zat warna
lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna ungu.
Bakteri gram negatif  ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna utama
tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh  peluntur dan dapat diwarnai oleh zat warna lawan
(safranin) pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna merah. Fungsi zat
warna:
Crystal violet yang berfungsi membentuk ikatan mg-Ribonucleid acid pada
membran/dinding sel bakteri sehingga membentuk kompleks mg-Ribonucleid acid- crystal
violet. Kompleks ini merupakan senyawa yang tidak luntur dengan alkohol.
Lugol’s ladin yang berfungsi sebagai penguat ikatan pada kompleks mg-Ribonuclead
acid.
Alkohol 95% berfungsi mencuci lemak pada dinding sel bakteri.
Safranin berfungsi sebagai zar warna tandingan (lawan) luruh nya kompleks mg-
Ribonucleid acid- crystal violet dari dinding sel bakteri gram negatif

DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.
Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.
Sutedjo, M.1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rhineka Cipta.

  Pewarnaan gram  
Pewarnaan gram atau metode gram adalah  salah satu teknik pewarnaan yang paling
penting dan luas di gunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri
yang sudah terfiksasi di kenai larutan-larutan berikut zat pewaraan Kristal violet, larutan
yodium, larutan akohol(bahan pemucat) dan zat pewarnaan tandinganya berupa zat warna
safranin atau air fucshin. Metode ini di beri nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Denmark Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun
1884 untuk  membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiela, pneumonia. Bakteri
yang telah diwarnai dengan metode ini  dibagi menjadi dua kelompok yaitu, bakteri gram
positf dan bakteri gram negatif. Bakteri garam positif akan memprtahankan zat pewarna
kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun
bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol
dan sewaktu diberi zat pewarna tandingnya yaitu dengan zat pewarn air fucshin atau safranin
akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini di sebabkan oleh perbedaan dalam
struktur kimiawi dinding selnya (Pelczar, 2007).
Bakteri gram positif adalah bakeri yang mempertahankan zat warna metal ungu sewaktu
proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop
sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi
antara kedua jenis bakteri ini  terutama berdasarkan pada perbedaan struktur dinding sel
bakteri .Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat metal ungu pada
metode pewarnaan gram. Bakteri gram-positif akan mempertaahankan warna ungu gelap
setelah di cuci dengan alkohol.
Sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan gram suatu pewarnaan
penimbal (conterstain)di tambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-
negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini perbedaan struktur dinding selnya. Banyak spesies
organisme inang, sifat pathogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada
dinding sel gram-negatif terutama lapisan lipopolisakarida (Pelczar, 2007).