MODUL 9

PENDAHULUAN

JUDUL/TOPIK : PEWARNAAN GRAM ORIGINAL (GR+)

TUJUAN : Menguasai teori yang terkait dengan pemeriksaan

INSTRUKSIONAL laboratorium medik mulai tahap pra analitik,analitik
sampai pasca analitik di bidang bakteriologi dengan
menggunakan instrumen sederhana dan otomatis
secara terampil sesuai standar pemeriksaan untuk
menghasilkan informasi diagnostik yang tepat

INDIKATOR : Mahasiswa mampu menjelaskan: Pewarnaan Gram

original

URAIAN MATERI :

Pewarnaan Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan
fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark
Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumonia. Tujuan dari pewarnaan
adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk
bakteri

Pewarnaan gram menggunakan pewarna utama Kristal Violet dan pewarna tandingan
Safranin. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mengikat zat warna pertama yaitu gentian
violet (kristal violet) yang berwarna ungu dan melepaskan zat warna kedua yaitu safranin yang
berwarna merah. Sedangkan bakteri gram negative akan mengikat zat warna kedua (safranin)
yang berwarna merah dan melepas zat warna pertama (gentian violet) yang berwarna ungu.

Pewarnaan dinding bakteri dengan pewarnaan gram memisahkan bakteri menjadi dua yaitu:

1. Bakteri gram positif

 Gram positif ini apabila dilakukan pewarnaan, maka akan terlihat berwarna ungu. Pada
bakteri gram positif, kompleks dari kristal violet yodium (KV-1) tetap tertangkap dalam dinding
sel setelah perlakuan dengan etanol. Hal ini disebabkan oleh pori-pori pada lapisan
peptidoglikans mengecil. Pengecilan pori-pori ini terjadi karena rendahnya kandungan lipid pada
dinding sel bakteri gram positif sehingga pada saat penambahan alkohol terjadi dehidrasi.
Dengan demikian KV-1 tetap terikat dan sel berwarna ungu (Darkuni, 2001). Selain itu, pada
bakteri gram positif juga ditemukan adanya senyawa Mg-ribonukleat yang akan bereaksi dengan
kristal violet sehingga zat warna ini tidak mudah dilarutkan oleh larutan pemucat.

2. Bakteri gram negatif.

Sel-sel gram negatif terlihat berwarna merah setelah dilakukan pewarnaan. Berbeda halnya
dengan bakteri gram positif, pada bakteri gram negative kandungan peptidoglikannya lebih
rendah, tetapi kandungan lipidnya tinggi. Kandungan lipid yang cukup tinggi ini dapat
menyebabkan pembesaran lubang pori-pori dan meningkatkan permeabilitas zat warna pada saat
pencucian dengan alkohon. Pori-pori pada peptidoglikan bakteri ini cukup besar sehingga setelah
perlakuan dengan alcohol atau etanol kompleks KV-1 lepas (tidak terikat) dan sel akan mengikat
zat warna kedua (Darkuni, 2001). Selain itu, dalam bakteri gram negatif ini juga tidak ditemukan

adanya senyawa Mg-ribonukleat yang dapat bereaksi dengan kristal-violet. Akibatnya kristal-
violet mudah larut oleh larutan pemucat.

REAGEN:

 Gentian violet
 Gram iodine
 Alcohol 96%
 Safranin 1%

Fungsi dari masing-masing zat warna tersebut adalah :

1.Crystal Violet (gentian violet)
 Berwarna ungu. Merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna
mikroorganisme target. Crystal Violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan
sel mikroorganisme yang bersifat asam, dengan begitu sel mikroorganisme yang
transparan akan terlihat berwarna (Ungu).

2. Yodium (gram iodine)

Merupakan pewarna Mordan , yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer
yang diserap mikroorganisme target. Pemberian yodium pada pengecatan gram
dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri.

3. Alkohol

Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna
pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat
mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan :
Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu
Bakteri menjadi tidak berwarna
4. Safranin

Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk
mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan
alkohol. Dengan kata lain , memberikan warna pada mikroorganisme non tar

CARA KERJA

1. Setelah dibuat sediaan, maka keringkan di udara dan fiksasi sebanyak 3 x

2. Teteskan gentian violet, biarkan 60 detik
1. Cuci dengan air
2. Teteskan gram iodine, biarkan 30 detik
3. Cuci dengan air
4. Decolourisasi dengan alcohol 96% sampai warna sebelumnya luntur
5. Cuci dengan air
6. Teteskan safranin 1%, biarkan 120 detik
 7. Cuci dengan air
8. Keringkan di udara, lalu periksa dibawah mikroskop dengan perbesaran okuler 10 x dan
perbesaran objektif 100 x, beri oil imersi/anisol.

LATIHAN PEMAHAMAN :

1.Apakah fungsi dari pewarnaan gram ?

1. Apa perbedaan dinding sel bakteri gram negative dan gram positif?
2. Sebutkan apa saja reagen atau bahan yang digunakan dalam pewarnaan gram ?

LATIHAN PENERAPAN :

1.Seorang analis ingin mengetahui jenis bakteri yang ada pada sebuah koloni. Maka ia
melakukan pewarnaan gram untuk mengetahuinya. Sebelum dilakukan pewarnaan, langkah apa
yang penting untuk dilakukan….

a. Dehidrasi
b. Fiksasi
c. Decolourisasi
d. Membuat biakan kuman
e. Objek glass dilidah apikan untuk menghilangkan lemak

1. Seorang analis ingin melakukan pewarnaan gram, untuk mendapatkan hasil yang baik berapa
lamakah pemberian reagen atau bahan pewarnaan tersebut….
a. 120, 60, 30 detik
b. 120,30, 60 detik
c. 30, 120, 60 detik
d. 60, 30, 120 detik
e. 60, 120, 30 detik
2. Seorang analis telah melakukan pewarnaan gram pada sebuah sampel. Setelah diamati di
bawah mikroskop ditemukan bakteri Enterobacter aerogenes. Bagaimanakah identifikasi
pada hasil tersebut…
 a.Bakteri (+) coccus (+)
b. Bakteri (+) coccus (-)
c. Bakteri (+) basil (+)
d. Bakteri (+) basil (-)
e. Bakteri (-) basil (-)

JAWABAN

LATIHAN PEMAHAMAN :

1. Tujuan pewarnaan gram adalah untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua
kelompok besar, yakni gram positif dan gram negative.
2. Dinding sel bakteri gram negative mengandung lipid yang tinggi dan peptidoglikan
yang rendah. Sedangkan dinding sel bakteri gram positif mengandung peptidoglikan
yang tebal dan lipid yang tipis.
3. a. gentian violet
b. gram iodine
c. alcohol 96%
d. safranin 1%

LATIHAN PENERAPAN :
1.B 2. D 3. D

GLOSARIUM
 Decolourisasi : proses pengelantangan atau perusakan warna secara buatan.

Dehidrasi : proses pengeluaran air dari tubuh

Lipid : suatu komponen dinding sel bakteri gram negatif

Mordan : pengikat zat warna agar tidak melarut dalam air atau
kelembapan

Peptidoglikan : komponen utama dinding selbakteri yang bersifat kaku dan

bertanggungjawab untuk menjaga integritas sel serta
menentukan bentuknya

DAFTAR PUSTAKA

1. Darkuni, M. Noviar. 2001. Mikrobiologi (Bakteriologi, Virologi, dan Mikologi). Malang:

Universitas Negeri Malang.
2. Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Imagraph.
3. Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta.: Gramedia
4. Hidayati,Rahayu.2013.http://www.academia.edu/13411203/
LAPORAN_PEWARNAAN_BAKTERI_PEWARNAAN_GRAM. Diakses pada tanggal 30
November 2017, pukul 19.50 WIB
5. Tamtam, Marten. 2017. https://kupdf.com/download/laporan-praktikum-pewarnaan-
bakteri_58cd46a9dc0d60075ac34631_pdf. Diakses pada tanggal 01 Desember 2017,
pukul o8.45 WIB