LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
“PENGECATAN GRAM”

Di Susun Oleh :

Nama : Rita Aspiyanti

NIM 2011102415117
Kelas :D
Dosen Pengampu : Apt. Sylvan Septian Ressandy, S.Farm.,
M.Farm

PROGRAM S1 FARMASI
FAKULTAS KESEHATAN DAN FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH KALIMANTAN TIMUR
2021
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Judul Praktikum
Pengecatan Gram.

B. Tujuan Praktikum
Setelah mengikuti praktikum ini mahasiswa mampu memahami cara-cara
pengecatan suatu bakteri atau mikroorganisme.

C. Dasar Teori
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri mejadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode tersebut diberi
nama berdasarkan penemunya. (Rahmi Fitrah, Dkk. 2017).
Bakteri merupakan mikroba uniseluler, yang mempunyai 3 bentuk dasar yaitu,
bulat seperti bola (coccus), batang (bacillus), silindris dan lengkung (spiral). Untuk
melihat struktur sel bakteri dengan seksama, diperlukan suatu pewarnaan.
Biasanya pewarna yang digunakan disebut pewarna bakteri. Fungsi pewarnaan
bakteri terutama memberi warna pada sel atau bagian-bagiannya, sehingga
menambah kontras dan tampak lebih jelas. (Sri Nurhidayati, Dkk. 2015).
Kebanyakan sel bakteri tidak berwarna sehingga jika dilarutkan di
dalam air dan dilihat di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna yang
kontras dengan medium di sekelilingnya. Warna sel mikroba dapat dibuat lebih
kontras dan lebih mudah dilihat di bawah mikroskop dengan cara mewarnai sel
tersebut dengan suatu zat warna. (I Nengah Sujaya. 2016).
Beberapa zat yang digunakan untuk mewarnai bakteri juga dapat
digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Keuntungan lain dari
pewarnaan, terutama untuk bakteri yang mempunyai sel dengan ukuran relatif kecil,
adalah karena bakteri yang diwarnai akan lebih mudah dilihat di bawah mikroskop
menggunakan lensa objektif minyak imersi yang mempunyai tingkat
pembesaran relatif tinggi. (Lay, D.W. 2015).
Sel-sel bakteri yang tidak diwarnai pada umumnya sukar diamati dengan mikroskop
cahaya biasa, karena sitoplasma sel mempunyai indeks bias yang hampir sama
dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Pewarna bakteri adalah senyawa
organik yang terdiri dari gugusan kromofor dan gugusan auksokrom yang terikat
dalam suatu cincin benzena. Gugusan kromofor yang memberikan warna pada molekul
pewarna, dan gugusan auksokrom yang memberikan disosiasi elektrolit molekul pewarna
sehingga lebih mudah bereaksi. Ada dua macam pewarna berdasarkan muatan listrik
pewarna: Pewarna Basa dan Pewarna Asam. (Sarah. 2015).
Pewarna basa mengandung kromofor berupa kation (muatan positif), seperti biru
metilen dan safranin. Pewarna asam mengandung kromofor berupa anion (muatan negatif),
seperti eosin, fukhsin, dan merah kongo. Mekanisme pewarnaan bakteri terdiri dari
pengikatan kimia dan pengikatan fisika. Mekanisme pengikatan kimia
berdasarkan reaksi gugusan asam pewarna dengan gugusan basa komponen sel,
atau sebaliknya. Pengikatan fisika berdasarkan proses absorbsi pewarna pada
komponen sel. (Djide, M.N, 2016).
Pewarnaan Gram dilakukan untuk mengelompokkan bakteri menjadi 2 yaitu bakteri
Gram positif dan bakteri Gram negatif. Pada pewarnaan Gramini, reagen yang digunakan
ada 4 jenis, yaitu kristal violet, iodine, alkohol dan safranin. Bakteri Gram positif akan
mempertahankan warna ungu dari kristal violet sehingga ketika diamati mikroskop akan
menunjukkan warna ungu sedangkan bakteri Gram negatif tidak dapat mempertahankan
warna ungu dari kristal violet tetapi zat warna safranin dapat terserap pada dinding sel
sehingga akan memperlihatkan warna merah. (Dwidjoseputro, D. 2015).
Pewarnaan Gram bertujuan untuk membedakan bakteri menjadi dua kelompok yakni,
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif serta warna gram dari bakteri yaitu
merah dan biru. (Radji, DR. 2016).
Bermacam-macam cara perwarnaan yang dilakukan untuk mewarnai bakteri
merupakan modifikasi atau gabungan dari cara pewarnaan sederhana. Pewarnaan bakteri
dapat dibedakan atas beberapa golongan yaitu:
1. Pewarnaan Sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya
untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling
umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan
sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu
mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Pewarnaan
Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara
umum.
2. Pewarnaan Diferensial
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan
gram dan pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut:
a. Pewarnaan Gram
 Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.
b. Pewarnaan Tahan Asam
Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam
konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi
zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan
menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur
yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri
tahan asam (BTA). (Ganiswarna, S.G. 2017).
Zat-zat warna tersebut bekerja dengan baik dalam mewarnai bakteri karena zat-
zat mengandung gugusan fungsional yang dapat membentuk warna (khromofor) dan
bermuatan positif. Oleh karena sel-sel bakteri pada umumnya bermuatan negatif, maka
sel-sel tersebut dapat mengikat khromofor. Zat-zat warna demikian disebut zat
warna basa. Zat-zat warna yang mengandung khromofor yang bermuatan negatif (anion),
disebut zat warna asam, dan tidak dapat digunakan untuk mewarnai bakteri karena tidak
dapat diikat oleh sel bakteri. (Waluyo, lud. 2015).
 BAB II
METODE KERJA

A. Alat dan Bahan

1. Alat
a. De glass
b. Ose bulat
c. Mikroskop
d. Rak tabung
e. Objek glass
f. Tabung reaksi
g. Lampu spiritus
2. Bahan
a. Alkohol 70%
b. Cat D (safranin)
c. Aquadest
d. Bakteri SA
e. Cat A (kristal violet)
f. Kertas label
g. Cat B (larutan mordan)
h. Metilen blue
i. Cat C (larutan alkohol asam)
j. Nigrosin
k. Tissue

B. Cara Kerja
a. Pengecatan Negatif
1) Dibersihkan gelas objek dengan alkohol sehingga bebas lemak, lalu
difiksasi.
2) Setelah dingin, diambil suspensi biakan murni bakteri uji dengan ose secara
aseptis dan diletakkan diatas gelas objek.
3) Kemudian diambil nigrosin dengan ose sedikit dan dicampurkan dengan
suspensi yang telah terletak di atas obyek glass. Dicampur sampai homogen
dan terlihat sangat tipis.
4) Preparat dibiarkan kering di udara dan diamati dengan mikroskop
b. Pengecatan sederhana
1) Dibersihkan objek glass dengan alkohol 70% sampai bebas lemak,
kemudian
2) dikeringkan di atas lampu spiritus.
3) Diambil secara aseptis 1 ose suspensi bakteri dan diratakan di atas objek
glass.
4) Dibiarkan preparat kering di udara.
5) Setelah kering preparat difiksasi dengan cara dipanaskan di atas lampu
spiritus.
6) Setelah dingin, noda pada glass objek ditetesi dengan metilen blue1atau 2
tetes dan dibiarkan 1 atau 2 menit.
7) Dicuci dengan air mengalir sampai sisa-sisa cat tercuci seluruhnya.
8) Dikeringkan di udara dan diamati di bawah mikroskop.
c. Pengecatan Gram
1) Disiapkan preparat olesan bakteri
2) Dikeringkan di udara, setelah kering difiksasi diatas lampu spiritus
3) Ditetesi cat gram A sebanyak 2-3 tetes, dibiarkan 1 menit.
4) Dicuci dengan air mengalir, dikeringkan di udara atau kertas hisap.
5) Diteteskan larutan gram B, dibiarkan selama 1 menit.
6) Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.
7) Diteteskan larutan gram C selama 30 detik dan dicuci
8) Diteteskan larutan gram D selama 30 detik.
9) Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dan diamati dengan mikroskop.
10) Digambar hasil-hasil pengecatan tesebut.
 BAB III
PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini dilakukan pengecatan/pewarnaan gram untuk

mengidentifikasi mikroba. Pewarnaan gram adalah pewarnaan diferensial yang
sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi,
karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Jenis bakteri
berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu Gram positif dan Gram
negatif. Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram meliputi kristal violet,
lugol, alkohol 70% dan safranin.
Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca objek. Pengambilan
kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak agar mudah diratakan tipis-tipis. Fiksasi
dilakukan dengan cara melewatkannya di atas nyala api. Proses fiksasi dilakukan
agar bakteri benar-benar melekat pada kaca objek sehingga olesan bakteri tidak
akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Pada proses fiksasi, bidang yang
mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.
Setelah di cat, bakteri Gram positif akan menunjukkan warna ungu
sedangkan untuk bakteri Gram negatif akan menunjukkan warna merah. Perbedaan
warna pada bakteri Gram positif dan Gram negatif menunjukkan bahwa adanya
perbedaan struktur dinding sel antara kedua jenis bakteri tersebut. Bakteri Gram
positif memiliki struktur dinding sel dengan kandungan peptidoglikan yang tebal
sedangkan bakteri Gram negatif memiliki struktur dinding sel dengan kandungan
lipid yang tinggi.
Pada pewarnaan gram penambahan larutan mordant menyebabkan
terbentuknya persenyawaan kompleks. Pada sel Gram negatif, alkohol
meningkatkan porositas dinding sel dengan melarutkan lipid lapisan luar. Jadi,
kompleks kristal violet-iodin (mordant) dapat lebih mudah dihilangkan dari lapisan
peptidoglikan yang tidak tertaut silang dengan kuat. Oleh sebab itu, efek pencucian
alkohol memfasilitasi pelepasan kompleks kristal violet-iodin (mordant) yang tidak
terikat, yang
membuat sel-sel menjadi kehilangan warna atau tidak berwarna. Karena hanya
sel-sel Gram negatif yang mengalami kehilangan warna sehingga sel-selnya
menyerap pewarna tandingan (safranin) (Post and Songer, 2005).
Dinding sel Gram positif memiliki kandungan lipid yang rendah, sehingga
dinding sel lebih mudah terdehidrasi akibat perlakuan alkohol yang menyebabkan
pori-pori sel menjadi lebih kecil dan permeabilitasnya berkurang sehinggga zat
warna kristal violet yang merupakan zat warna utama tidak dapat keluar dari sel
(Putri dkk., 2018).
Faktor-faktor yang mempengaruhi warna dan bakteri yaitu fiksasi, peluntur
warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu
preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer
maka semua zat warna terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan
terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan
hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 2015).
 BAB IV

PENUTUP

A. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum dapat disimpulkan bahwa pewarnaan Gram
merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk mengidentifikasi
bakteri (mikroorganisme). Pewarnaan Gram digunakan untuk
mengelompokkan bakteri Gram positif dan Gram negatif. Berdasarkan
percobaan, bakteri Gram positif pada pewarnaan Gram berwarna ungu
disebabkan kompleks zat warna kristal violet-iodium tetap dipertahankan
meskipun diberi larutan alkohol, sedangkan bakteri Gram negatif berwarna
merah sebab kompleks tersebut larut pada saat pemberian larutan alkohol
sehingga mengambil warna merah safranin. Perbedaan warna pada bakteri
Gram positif dan Gram negatif menunjukkan bahwa adanya perbedaan struktur
dinding sel antara kedua jenis bakteri tersebut.
B. Saran
Dalam melakukan praktikum ini diharapkan praktikan berhati-hati
dalam menggunakan alat dan bahan yang ada di laboratorium, serta
memperhatikan ketelitian saat melakukan percobaan agar berjalan dengan
lancar dan mendapatkan hasil yang maksimal.
 DAFTAR PUSTAKA

Djide, M.N, 2016. Mikrobiologi Farmasi. Jurusan Farmasi Unhas: Makassar

Dwidjoseputro, D. 2015. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta
Ganiswarna, S.G. 2017. Farmakologi dan Terapi Edisi IV. Bagian Farmakologi
Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia: Jakarta
I Nengah Sujaya. 2016. PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI. Universitas
Udayana: Bali
Lay, D.W. 2015. Analisis Mikroba di Laboratorium. Penerbit Raja Grafindo Persada:
Jakarta
Radji, DR. 2016. Buku Ajar Mikrobiologi Panduan Mahasiswa Farmasi &
Kedokteran. UI Press: Jakarta
Rahmi Fitrah, Dkk. 2017. ANALISIS BAKTERI TANAH DI HUTAN LARANGAN
ADAT RUMBIO. Jurnal Agroteknologi: Pekanbaru. Vol 8 No 1
Sarah. 2015. Penuntun Praktikum Analisis Mikrobiologi Farmasi. Universitas Muslim
Indonesia : Makassar
Sri Nurhidayati, Dkk. 2015. DETEKSI BAKTERI PATOGEN YANG BERASOSIASI
DENGAN Kappaphycus alvarezii(Doty) BERGEJALA PENYAKIT ICE-ICE.
Jurnal Sains Teknologi & Lingkungan: Mataram. Vol. 1 No. 2
Waluyo, lud. 2015. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM: Malang