A.

Cara Pewarnaan Gram dan Pengamatan Preparat

B. Tujuan :
1. Mahasiswa dapat mengetahui pewarnaan gram
2. Mahasiswa dapat mengetahui cara pewarnaan gram
3. Mahasiswa dapat mengetahui pengamatan dari pewarnaan gram

C. Prinsip Kerja
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara
komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang
disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini
maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Prinsip pewarnaan
gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ; sehingga
menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan
penambahan larutan pencuci (Dwidjoseputro.1998).

D. Dasar Teori
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir
tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut
disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga
mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.
Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu
mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak
mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan
zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar
belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga
kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan.
Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras
mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna
memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang
 mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk
melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan
pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut
pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram
positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl
neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam
dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998).

E. Waktu dan Tempat :

Adapun waktu dan tempat diadakannya praktikum ini yaitu :
Hari/Tanggal : Kamis, 4 Mei 2017
Pukul : 08.00-13.00 WITA
Tempat : Laboratorium Bakteriologi Analis Kesehatan

F. Alat dan Bahan :

Alat :
1. Bunsen
2. Objek glass
3. Jarum ose
4. Mikroskop
5. Cawan petri
6. Pipet tetes
Bahan :
1. Alcohol 70 %
2. NaCl
3. Biakan bakteri
4. Tissue
5. Kristal violet
6. Iodine
7. Safranin O
8. Oil immerse
G. Cara kerja
A. Pewarnaan gram
1. Mendesinfeksi meja kerja dengan menggunakan alcohol 70 %
2. Menyalakan api Bunsen
3. Melabeli objek glass kemudian memfiksasi objek glass dengan cara
melewatkannya di lidah api Bunsen
4. Memfiksasi ose sampai berpijar dengan api Bunsen
5. Mengambil sedikit NaCl dengan menggunakan ose kemudian
diletakkan di objek glass
6. Memfiksasi kembali ose
7. Memanaskan pinggir media agar dengan menggunakan api Bunsen
8. Mengambil sedikit bakteri didalam media agar dengan menggunakan
ose kemudian diletakkan di atas objek glass
9. Membuat hapusan di atas objek glass dengan diameter 1 cm
10. Memfiksasi kembali jarum ose dengan menggunakan api bunsen
11. Mengeringkan objek glass
12. Memfiksasi objek glass di atas lidah api Bunsen
13. Meneteskan Kristal violet dengan menggunakan pipet tetes di atas
objek glass mendiamkan selama 1 menit lalu dibilas dengan air
14. Meneteskan iodine dengan menggunakan pipet tetes di atas objek glass
mendiamkan selama 1 menit lalu membilas dengan air
15. Meneteskan alcohol dengan menggunakan pipet tetes di atas objek
glass diamkan selama 30 detik kemudian dibilas dengan air
16. Meneteskan sapranin o dengan menggunakan pipet tetes di atas objek
glass diamkan selama 45 detik kemudian dibilas dengan air

B. Pengamatan preparat
1. Meletakkan mikroskop dengan meja mikroskop menghadap ke arah
tubuh peneliti
 2. Memutar posisi pengatur lensa okuler agar menghadap ke arah tubuh
peneliti
3. Mengunci pengatur lensa okuler agar tidak bergerak selama diamati
4. Menghidupkan saklar untuk menyalakan lampu
5. Mengatur cahaya pada lampu dengan memutar pengatur intensitas
cahaya lampu
6. Mengatur lensa objektif pada perbesaran 10 kali dengan cara memutar
revolver sampai berbunyi klik
7. Mengatur lensa kondensor sampai pada titik terjauh
8. Memutar diafragma pada perbesaran 10 kali
9. Mengambil preparat dan meletakkannya di meja benda kemudian
menjepit preparat dengan menggunakan penjepit sediaan agar preparat
tidak bergeser.
10. Menaikkan meja benda dengan memutar makrometer ke arah belakang
11. Memutar sekrup pengatur vertical dan sekrup pengatur horizontal
sampai didapatkan daerah lapang pandang
12. Memutar revolver sampai lensa objektif pada posisi miring
13. Meneteskan satu tetes oil immerse pada daerah lapang pandang tadi
14. Memutar revolver sampai lensa objektif berada pada perbesaran 100
kali
15. Menaikkan lensa kondensor sampai pada jarak paling dekat dengan
meja sediaan.
16. Memutar diafragma sampai perbesaran 100 kali
17. Mengatur intensitas cahaya agar lebih terang dengan menggunakan
pengatur intensitas cahaya lampu
18. Membidik sambil memutar micrometer ke arah belakang sampai
mikrobiota yang ada pada preparat terlihat jelas.

H. Hasil dan Pembahasan :

a. Pewarnaan Gram
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram
pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi
dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan
dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri
tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan
gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai
dinding sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004).
Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu
pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik
adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam
yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana
salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua,
yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung
warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan
bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut
disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam.
Pada zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna
disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat
warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai
muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan
negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan sitoplasma
sewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan
berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih
jelas terlihat (Dwidjoseputro.1998).
Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan
untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk
mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai
latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif
ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur
sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel
yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat
warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya
sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro.1998).
 Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan
mikroorganisme disebut pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini
dapat digunakan zat warna basa yang yang bermuatan positif maupun zat
warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif
latar belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan
kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup
penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas
(Dwidjoseputro.1998)
b. Pengamatan Preparat
Dari hasil pengamatan yang kami lakukan pada preparat dengan
menggunakan mikroskop. Setelah dilakukan perbesaran 100 kali untuk
mencari lapang pandang kemudian ditetesi oil immerse dan dilakukan
perbesaran 1000 kali didapatkan bakteri coccus yang bercirikan bakteri
tersebut berbentuk bulat. Di preparat yang kami amati terdapat bakteri gram
positif dan juga bakteri gram negatif. Hal tersebut dikarenakan biakan
bakteri yang kami gunakan untuk membuat hapusan bukanlah biakan murni.

I. Kesimpulan
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Salah satu cara untuk
mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah
dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk
mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri
melalui serangkaian pengecatan. Metode pengecatan pertama kali ditemukan
oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat
dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram
negative.

J. Pustaka
anis24.mahasiswa.unimus.ac.id/wp-content/.../MIKROBIOLOGI-
PEWARNAAN.pdf diakses pada tanggal 6 Mei 2017
Dwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang : Djambatan
Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga
Lay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta : Rajawali
Sutedjo, Mul Mulyani.1991.Mikrobiologi Tanah.Jakarta : Rineka Cipta
Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum.Malang : UMM Press