MAKALAH

BAKTERIOLOGI

“MACAM - MACAM PEWARNAAN BAKTERI”

Disusun Oleh :

Rahmawati (P27903117119)
Reny Yuliyanti (P27903117120)
Riyani Dwi Lestari (P27903117121)

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENTRIAN KESEHATAN BANTEN

PROGRAM STUDI D III ANALIS KESEHATAN

TAHUN 2017/2018
 KATA PENGANTAR

Dengan menyebut nama Allah SWT yang Maha Pengasih lagi Maha Panyayang,
dengan ini kami panjatkan puji syukur atas kehadirat-Nya, yang telah melimpahkan rahmat-
Nya kepada kami, sehingga kami dapat menyelesaikan makalah Bakteriologi tentang
“Macam-macam Pewarnaan Bakteri”

Adapun makalah ini telah kami usahakan semaksimal mungkin dan tentunya dengan
bantuan dari banyak pihak, sehingga dapat memperlancar proses pembuatan makalah ini.
Oleh sebab itu, kami juga ingin menyampaikan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya
kepada semua pihak yang telah membantu kami dalam pembuatan makalah ini.

Akhirnya penyusun mengharapkan semoga dari makalah Bakteriologi tentang

“Macam-macam Pewarnaan Bakteri” ini dapat diambil manfaatnya sehingga dapat
memberikan inpirasi terhadap pembaca. Selain itu, kritik dan saran dari Anda kami tunggu
untuk perbaikan makalah ini nantinya.

Tangerang, 25 Maret 2018

Penyusun

i
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ................................................................................................ i

DAFTAR ISI............................................................................................................... ii
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang ................................................................................................. 1
B. Rumusan Masalah ............................................................................................ 2
C. Tujuan Penelitian ............................................................................................. 2
BAB II PEMBAHASAN
A. Pewarnaan Sederhana....................................................................................... 3
B. Pewarnaan Gram .............................................................................................. 4
C. Pewarnaan Negatif ........................................................................................... 7
D. Pewarnaan Spora .............................................................................................. 8
E. Pewarnaan Kapsul ............................................................................................ 9
F. Pewarnaan Flagel ............................................................................................. 10
G. Pewarnaan Bakteri Tahan Asam ...................................................................... 13
H. Macam-macam Pewarna .................................................................................. 15
I. Kegunaan Bahan .............................................................................................. 16
BAB III PENUTUP
A. Kesimpulan ...................................................................................................... 18
B. Saran ................................................................................................................. 18
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 19

ii
 BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Tujuan dari pewarnaan bakteri adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk
sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri,
dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau
kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo. 1990).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun
1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu, bakteri
gram positif dan bakteri gram negatif. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri
terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme
yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004).
Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian
warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam).
Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-
ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat
warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa.
Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut
pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat
warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat
warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor
dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan
memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak
digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel, membran sel dan
sitoplasma sewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan
berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas
terlihat (Dwidjoseputro.1998).
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini
kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak
sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang
sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama
bila suspensi tersebut berasal dari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi

1
 bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada
preparatnya (Sutedjo.1991).
Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka
seringkali setelah pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan.
Fiksasi dapat dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau
merendamnya dengan metanol. Fiksasi digunakan untuk :
1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai
2. Melekatkan bakteri pada glass objek
3. Mematikan bakteri

B. Rumusan Masalah
Rumusan masalah dari makalah pewarnaan bakteri ini adalah :
a. Apa yang dimaksud dengan perwarnaan bakteri ?
b. Apa saja macam - macam pewarnaan bakteri ?
c. Bagimana prosedur kerja pewarnaan bakteri ?

C. Tujuan
Tujuan pembuatan makalah ini adalah :
a. Untuk mengetahui pengertian pewarnaan bakteri
b. Untuk mengetahui Macam - macam pewarnaan bakteri
c. Untuk mengetahui prosedur kerja pewarnaan bakteri

2
 BAB II
PEMBAHASAN

Macam-macam Pewarnaan Pada Bakteri, antara lain :

A. Pewarnaan Sederhana
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazimnya, prosedur
pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen,
karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna
negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering digunakan adalah
nigrosin dan merah kongo (Lay.1994).
Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering
digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri
pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan
pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat
pewarnaan seperti rantai (stertococcus), buah anggur ( stafilococcus), pasangan
(diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay.1994).
Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya
terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara
yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum (Dwidjoseputro.1998).
Contoh bakteri yang bisa diamati oleh pewarnaan sederhana adalah Bacillus Subtilis,
Staphylococcus aureus.
Cara kerja pewarnaan Sederhana
Alat dan Bahan
Alat :
 Objek Glass  Mikroskop
 Bunsen  Penjepit Preparat
 Jarum Ose

Bahan :
 Alkohol 70 %  Crystal Violet
 Aquades  Bakteri dari Media

3
 Cara Kerja Pewarnaan Sederhana dengan Crystal Violet
1. Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas
Bunsen
2. Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit
aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose
3. Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di
atas preparat glass
4. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
5. Diteteskan larutan zat warna crystal violet
6. Dikeringkan dan dianginkan selama 1 menit
7. Dicuci dengan air mengalir
8. Dikeringkan preparat dengan dianginkan, dan
9. Diamati dibawah mikroskop karakteristik dan bentuk bakteri

B. Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan
bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat
warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop.
Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci
dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak
berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur
kimiawi dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain :
crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine (Lay.1994).
Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang
berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan
hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada
dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat
keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif
dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga
terlihat sebagai bakteri gram negatif (Lay,1994).
Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ;
sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan
penambahan larutan pencuci (Dwidjoseputro.1998).

4
 Bakteri gram positif seperti Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Bacillus
cereus, Clostridium perfringens. Contoh bakteri Gram negatif, yaitu Azotobacter,
Rhizobium leguminosarum, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, dan Helicobacter pylori.
Cara kerja pewarnaan Gram
Alat dan Bahan
Alat :
 Objek Glass  Mikroskop
 Bunsen  Penjepit Preparat
 Jarum Ose
Bahan :
 Alkohol 70 %  Lugol
 Aquades  Alkohol 95%
 Crystal Violet  Basic Fuchsin atau Safranin
 Bakteri dari Media

Cara Kerja Pewarnaan Gram

1. Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas
Bunsen
2. Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit
aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose
3. Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di
atas preparat glass
4. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
5. Diteteskan larutan zat warna crystal violet 2-3 tetes dan didiamkan selama 1
menit
6. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
7. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan
8. Diteteskan dengan larutan Lugol dan dibiarkan selama 1 menit lalu dicuci
dengan air mengalir dan diangin keringkan
9. Kemudian dicuci dengan dengan alkohol 95% selama 30 detik, lalu dicuci
dengan air mengalir dan dikering anginkan
10. Diberi larutan basic fuchsin atau safranin selama 2 menit

5
 11. Dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan
12. Diamati dibawah mikroskop

Ciri-ciri gram negative:

 Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer
 Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan
terdapat dalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari
berat kering, tidak mengandung asam laktat.
 Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
 Tidak resisten terhadap gangguan fisik
Ciri-ciri bakteri gram positif:
 Struktur dindingnya tebal
 Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
 Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
 Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal
 Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
 Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu

1. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu
2. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur
pewarnaan gram untuk :
 Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar
 Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme
 Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa

6
C. Pewarnaan Negatif
Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit
diwarnai, dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya, metode
pewarnaan negatif merupakan suatu metode perwarnaan umum, dimana digunakan
larutan zat warna yang tidak meresap ke dalam sel-sel bakteri melainkan melatar
belakangi sehingga kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak
berwarna (negatif). (Lay.1994).
Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung dimana
digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteri melainkan ke
dalam latar belakangnya (Lay.1994)
Contoh bakteri pewarnaan negative adalah Streptococcus mutans pada kotoran
gigi.
Cara kerja pewarnaan Negatif
Alat dan Bahan
Alat :
 Objek Glass  Mikroskop
 Bunsen  Penjepit Preparat
 Jarum Ose
Bahan :
 Alkohol 70 %  Bakteri dari Media
 Aquades  Tinta Cina

Cara Kerja Pewarnaan Negatif

1. Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas
Bunsen
2. Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit
aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose
3. Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di
atas preparat glass
4. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
5. Diteteskan larutan zat warna tinta cina 1 tetes
6. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya
7. Dicuci dengan air mengalir

7
 8. Dikeringkan preparat dengan dianginkan, dan diamati dibawah mikroskop

D. Pewarnaan Spora
Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malachite green
dan safranin, yang dalam hasil pewarnaannya akan muncul warna hijau pada
sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya yaitu pada Bacillus subtitulis
(Lay.1994).
Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang menggunakan
malachite green dan safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan muncul warna
hijau pada sporanya dan warna merah pada sel vegetatifnya (Lay.1994). Bakteri
bersopra seperti Salmonella typhii dan Bacillus subtilis.
Cara kerja pewarnaan Spora
Alat dan Bahan
Alat :
 Objek Glass  Mikroskop
 Bunsen  Kertas Saring
 Jarum Ose  Penjepit Preparat
Bahan
 Alkohol 70%  Malachite Green
 Aquades  Safranin
 Bakteri dari Media

Cara Kerja Pewarnaan Spora

1. Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas
bunsen
2. Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit
aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose
3. Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di
atas preparat glass
4. Ditutup dengan kertas saring
5. Diteteskan malachite green kemudian difiksasi
6. Didiamkan selama 5 menit dan dibuang kertas saring
7. Dibilas dengan air mengalir dan kemudian dianginkan

8
 8. Diteteskan safranin dan dikeringkan tanpa fiksasi
9. Diamati dibawah mikroskop

E. Pewarnaan Kapsul Bakteri

Tanpa pewarnaan, kapsul bakteri sangat sukar diamati dengan mikroskop
cahaya biasa karena tidak berwarna dan mempunyai ideks bias yang rendah. Karena
kapsul bersifat non-ionik, maka pewarnaanya tidak dapat dilakukan menggunakan
prosedur yang sederhana dan biasa. Masalah utama dalam pewarnaan kapsul ialah bila
olesan bakteri yang telah disiapkan difiksasi dengan panas menurut metode yang
biasa. Masalah utama dalam pewarnaan kapsul ialah bila olean bakteri yang telah
isiapkan itu difiksasi dengan panas menurut metode yang biasa, maka kapsul tersebut
akan rusak, namun apabila tidak difikasi dengan panas, maka organisme tersebut akan
meluncur pada waktu pencucian. Dalam banyak pekerjaan bakteriologis, yang kita
perlukan hanyalah sekedar memperagakan ada atau tidaknya kapsul. Tujuan ini dapat
digunakan dengan cara menggabungkan proses pewarnaan negatif dengan pewarnaan
sederhana. Teknik pewarnaan lain untuk melihat kapsul pada bakteri antara lai dengan
metoda pewarnaan Anthony, Pewarnaan Hiss, Pewarnaan Leifson, dan pewarnaan
Tyler.
Prinsip Pewarnaan Kapsul Pada umumnya sel bakteri mengandung air 80– 85%,
protein, lemak, karbohidrat, dan disamping itu juga mengandung enzim. Bahan
terakhir ini sangat penting. Sel Bakteri terdiri dari sel,
endoplasma/sitoplasma/protoplasma. Sitoplasma ini dikelilingi membran sitoplasma
dimana di dalamnya terdapat granul - granul dan inti sel. Granul - granul Ini
merupakan persediaan makanan. Disamping itu bakteri tersebut mempunyai kapsul
yaitu seluruh sel dibugkus oleh suatu substansi semacam slym / gelatin. Kapsul ini
berfungsi untuk melindungi bakteri terhadap serangan dari luar.
Contoh bakteri berkapsul antara lain: Bacillus anthracis, Diplooccus pneumoniae,
Klebsiella, Acetobacter xylinium, Bacillus subtilis, Betacrocus dextranicus
Cara kerja pewarnaan Kapsul
Alat dan Bahan

Alat
 Aquades  Batang Ose
 Bak pewarnaan  Kapas

9
  Kertas saring  Pembakar Spiritus
 Korek api  Pipet Tetes
 Mikroskop cahaya  Tabung Reaksi
 Object glass  Tissue

Bahan
 Air fuchsin  Suspensi bakteri Bacillus subtilis
 Alkohol 70 %  Tinta cina
 Aquades  Xylol
 Minyak imersi

Cara Kerja
Prosedur Percobaan Pewarnaan Negatif
 Sediakan dua buah object glass yang sudah dibersihkan dengan alkohol
sehingga bebas lemak.
 Kedua object glass dibersihkan dengan alkohol 70% sampai bersih agar
terbebas dari lemak.
 Kedua object glass dipanaskan diatas pembakar spirtitus
 Kawat ose dipijarkan diatas pembakar spirtitus lalu didinginkan
 Pada kaca objek pertama diletakkan satu suspensi bakteri dan satu ose tinta
cina dengan perbandingan (1:1)
 Suspensi bakteri dan satu ose tinta cina dengan perbandingan (1:1)
dicampurkan dengan sudut object glass sampai keduanya homogen.
 Preparat apusan dibuat untuk membentuk sudut 45% hingga campuran
tersebut menjadi lapisan film tipis.
 Preparat dikeringkan dan difiksasi selama 3 kali.
 Tetesi preparat dengan zat warna air fuchsin selama 5 menit.
 Zat warna berlebihan dibuang, tetapi jangan dicuci, kemudian dikeringkan.
 Preparat ditetesi dengan minyak imersi, lalu diamati dibawah mikroskop.

F. Pewarnaan Flagella
Prinsip pewarnaan flagella adalah membuat organel tersebut dapat dilihat dengan
cara melapisinya dengan mordant dalam jumlah yang cukup. Dua metode pewarnaan

10
flagella, yaitu metode Gray dan metode Leifson. Metode Gray digunakan untuk
mendapat hasil yang lebih baik dan mengena walaupun dalam metode ini tidak
dilakukan pencelupan yang khusus. Pada pewarnaan flagella larutan kristal violet
bertindak sebagai pewarna utama, sedangkan asam tannic dan alumunium kalium
sulfat bertindak sebagai mordant. Kristal violet akan membentuk endapan disekitar
flagel, sehingga meningkatkan ukuran nyata flagel.
Pengelompokan bakteri kali ini didasarkan pada berapa banyak flagel yang
dimiliki oleh bakteri sebagai alat geraknya. Berikut ini pengelompokannya:
 Kelompok bakteri monotrik – Pada kelompok monotrik ini, bakteri hanya
memiliki satu flagel saja sebagai alat gerak bakteri tersebut yang terdapat pada
bagian ujung sisi tubuhnya. Sebagai contoh yaitu bakteri pseudomonas
aeruginosa yang hanya memiliki satu flagel saja di bagian sisi tubuhnya
sebagai alat geraknya.
 Kelompok bakteri lofotrik – Pada pengelompokan bakteri lofotrik ini, alat gerak
yang dimiliki jumlahnya lebih dari satu dan hanya terdapat di salah satu sisi tubuh
dari bakteri ini. Contohnya seperti pada bakteri pseudomonas fluorescens dimana
bakteri ini memiliki alat gerak lebih dari satu di salah satu sisi tubuhnya.
 Kelompok bakteri amfitrik – Sama halnya dengan kelompok lofotrik, pada
kelompok amfitrik jumlah flagel yang dimiliki bakteri lebih dari satu, hanya saja
ada perbedaan antara kelompok lofitrik dan kelompok amfitrik, dimana pada
kelompok bakteri lofotrik flagelnya hanya terdapat di salah satu sisi tubuh bakteri,
sedangkan pada kelompok amfitrik, flagelnya terdapat di kedua sisi ujung bakteri.
Sebagai contohnya yaitu bakteri aquaspirillum serpens, pada bakteri ini, flagel
yang dimiliki jumlahnya lebih dari satu dan berada di kedua sisi ujung bagian
tubuhnya.
 Kelompok bakteri peritrik – Pada kelompok peritrik ini umumnya bakteri
memiliki flagel di seluruh permukaan tubuhnya sebagai alat gerak mereka.
Contohnya yaitu pada bakteri salmonela typhosa dimana bakteri ini memiliki
flagel hampir diseluruh tubuhnya yang berfungsi sebagai alat geraknya

11
Cara kerja pewarnaan Flagel
Alat dan Bahan
Alat :
 Pipet tetes  Mikroskop
 Objeck glass  Spirtus dan pembakar
 Ohse lurus spirtus

Bahan :

 Media SIM  larutan ZN A

 larutan mordant  Emersi oil

Cara kerja metode Gray

Lakukan uji motil terlebih dahulu
 Siapkan media SIM, lakukan inokulasi 1 ohse biakan bakteri secara tusukan
pada media SIM secara aseptis
 Inkubasi 37C selama 24 jam
Interprestasi hasil
 (+) terjadi pertumbuhan menyebar pada sekitar tusukan
 (-) tidak terjadi pertumbuhan menyebar pada sekitar tusukan

Pembuatan preparat
 Siapkan objeckglass yang bersih, kering dan bebas lemak
 Labelisasi
 Teteskan 1 tetes sampel bakteri ditepi objeckglass menggunakan pipet tetes
steril secara aseptis
 Objeck glass dimiringkan sehingga tetesan mengalir keujung yang lain
 Keringkan dalam incubator suhu 37C selama 10 menit

Pengecetan
 Siapkan preparat yang sudah jadi dan taruh di jembatan pengecetan
 Genangi preparat dengan larutan mordant selama 10 menit
 Buang sisa cat, cuci dengan air mengalir
 Genangi dengan ZN A selama 5 menit

12
  Buang sisa cat, cuci dengan air mengalir, kering anginkan
 Periksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000x dengan penambahan
emersi oil
G. Pewarnaan Bakteri Tahan Asam
Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu
berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang
terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60%
dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain Mycobacterium
tuberculose, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis,
dan Nocandia gonorrhoeae.
Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan
penyakit tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri
tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan
pernafasan (Syahrurachman, 1994).
Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok
Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut
bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin)
sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat
berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan
pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat,
sehingga sel bakteri tidak berwarna (Lay, 1994).
Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar
ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka lapisan lilin dan
lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan lilin dan
lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian dengan asam alkohol
warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur dan
mengambil warna biru dari methylen blue.

Prinsip Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini untuk memilah kelompok mycrobacterium dan bakteri lainnya.
Pewarnaan ini disebut pewarnaan tahan asam karena dapat mempertahanakan zat
warna pertama sewaktu dicuci dengan asam alcohol. Bakteri tahan asam berwarna
merah, Sedangkan bakteri tidak tahan asam larutan pemucat akan melarutkan karbol

13
fuksin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna, sehingga setelah
penambahan zat warna kedua bakteri tidak tahan asam berwarna biru.
Cara kerja pewarnaan Tahan Asam
Alat dan Bahan
ALAT
 Objek Glass  Gegep
 Ose  Pipet Tetes
 Lampu Spirtus  Korek api
 Mikroskop  Lidi

BAHAN

 Karbol fuksin  Aquadest

 Asam alcohol  Oil Imersi
 Methilen Blue

PROSEDUR KERJA
1. Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2. Membuat preparat dengan mengambil sampel dengan lidi lalu di usapkan pada
object glass
3. Menambahkan karbol fuksin pada preparat
4. Memanaskan preparat selama 5 menit sampai terlihat uap ( Jangan sampai
mendidih )
5. Mencuci dengan air mengalir
6. Menamhakan asam alcohol lalu di diamkan selama 20 detik
7. Mencuci dengan air mengalir
8. Menambahkan methilen blue dan di diamkan selama 1 menit
9. Mencuci dengan air mengalir
10. Keringkan , Lalu amati pada mikroskop dengan pembesaran lensa objektif 100 x
dengan menambahkann oil imersi

14
3
H. Macam Macam Pewarna
1. Fuchsin carbon, merupakan campuaran fuchsin fenol dan dasar yang
digunakan dalam prosedur pewarnaan bakteri. Hal ini umumnya digunakan
dalam pewarnaan mikrobkateria karena memiliki ketertarikan untuk asam
mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba, carbol fuchsin juga
digunakan sebagai antiseptik tropikal (Lay,1994)
2. Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini
digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri.
Crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan
sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991).
3. Nigrosin adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan
memanaskan campuran nirobenzena, anilin, dan hidroklorida. Industri
utamanya adalah sebagai pewarna untuk lak, pernis, dan tinta penanda pena.
Didalam biologi, nigrosin digunakan untuk pewarnaan negatif bakteri. Bentuk
dan organisme yang terlihat sebagai warna bebas menguraikan terhadap latar
belakang gelap. Keuntungan dari menggunakan metode ini daripada noda
positif biasa seperti fuchsin, metilen blue, atau carbol, ialah bahwa fiksasi
sebelumnya oleh panas atau alkohol tidak diperlukan sehingga organisme
terlihat. Selain itu pewarnaan negatif dengan nigrosin dapat mengungkapkan
beberapa mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai dengan metode biasa.
4. Lugol’s yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari
iodium dan iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai
antiseptik dan desinfektan, dan untuk desinfikasi darurat air minum, dan
sebagai reagen untuk deteksi pasti di dalam laboratorium, pewarnaan dan tes
medis (Dwidjoseputro.1998).
5. Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi.
Safranin digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan.
Mewarnai seluruhinti sel darah merah. Ini adalah counterstain klasik dalam
gram stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang rawan, musin
dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur kimia. Ada juga
trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dan aplikasi
pewarnaanbiologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan
diantara keduanya. Persiapan safranin komersial sering mengandung

15
3
 campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai indikator redok
dalam kimia analitik (Sutedjo,1991)

I. Kegunaan dari Bahan yang Dipakai

1. Alkohol 70 %, bertujuan untuk menghilangkan lemak dan kotoran yang
menempel dikaca alas.
2. Aquades, untuk membilas pewarnaan.
3. Crystal Violet, merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna
pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu
berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan
seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu).
4. Lugol, untuk Meningkatkan aktifitas peningkatan zat warna oleh bakteri, untuk
memperjelas zat warna dan mempersulit kelarutan zat warna.
5. Alkohol 95 %, ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan
penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan ungu dari komplek
Kristal ungu dan kalium iodida pada gram negative, karena mengandung lipid
sedangkan pada gram positif akan tetap mempertahankan warna ungu karena
mengandung peptidoglikan. Bakteri gram positif akan mengalami dehidrasi pada
dinding selnya dan pori-porinya menciut karena daya rembes dinding sel dan
membrane menurun sehingga kompleks kalium iodida tidak dapat keluar dari sel
dan tetap berwarna ungu. Sedangkan pada gram negative lipid tereksitasi (keluar)
dari dinding sel dan pori-pori mengembang sehingga kompleks kalium iodida
keluar dari sel dan sel menjadi tidak berwarna atau warna ungu akan luntur karena
peluruhan dinding sel.
6. Carbol Fuchsin, digunakan untuk pewarnaan Gram Bakteri Gram positif akan
mengikat zat warna ungu dari Carbol Gentian Violet.
7. Malachite Green, digunakan untuk mewarnai endospora dan akan memberikan
warna hijau pada endospora. Malachite green akan berikatan pada permukaan
endospora.
8. Safranin, pada pewarnaan gram yaitu merupakan pewarnaan tandingan atau
pewarna skunder, zat ini berfungsi untuk mewarnai sel-sel yang telah kehilangan
warna utama dengan kata lain memberikan warna pada bakteri non target. Pada
pewarnaan spora merupakan zat warna lawan, akan memberi warna merah kepada
bagian sel bakteri selain endospora.

16
3
9. Tinta Cina, untuk memeri warna latar belakang pada sediaan apabila dilihat pada
mikroskop.
10. Oil Imersi, agar preparat tidak tergores oleh mikroskop.
11. Larutan Mordant, Meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri
sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Setelah
penambahan larutan Mordan, zat warna akan lebih jelas terlihat dan zat warna
lebih sulit dilarutkan.

17
3
 BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
1. Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan
warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup
2. Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada
gram positif berwarna ungu kareana dapat mempertahankan zat pewarna
kristal violet serta perbadaan terjadi pada dinding selnya
3. Macam-macam pewarnaan antara lain : pewarnaan sederhana, pewarnaan
negatif, pewarnaan spora, perwarnaan kapsul, Pewarnaan Flagel dan
Pewarnaan Gram
4. Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain :
alkohol, carbol fuchsin, crystal violet, nigrosin, malachite green, lugol’s
iodida, dan safranin.

B. Saran
Kritik dan saran yang membangun, kami harapkan untuk perbaikan dan kemajuan
makalah ini.

18
3
 DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang : Djambatan Hadiutomo. 1990.

Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga Lay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di

Laboratorium.Jakarta : Rajawali Sutedjo, Mul Mulyani.1991.Mikrobiologi Tanah.Jakarta :

Rineka Cipta Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum.Malang : UMM Press

Lay, B. W. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo Persada.

Syahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Jakarta: UI

Press.

19
3